Microscopía 4D de levadura

Resumen

Este protocolo describe el análisis de compartimentos intracelulares etiquetados fluorescentemente en levaduras en ciernes utilizando microscopía confocal 4D (time-lapse 3D) multicolor. Los parámetros de imagen se eligen para capturar señales adecuadas mientras se limitan los fotodaños. Los plugins Personalizados ImageJ permiten rastrear y analizar cuantitativamente las estructuras etiquetadas.

Resumen

El objetivo de este protocolo es caracterizar cómo se forman y transforman los compartimentos de membrana en células vivas de levadura en ciernes. Muchos compartimentos intracelulares en la levadura son dinámicos, y una comprensión completa de sus propiedades requiere imágenes de lapso de tiempo. La microscopía de fluorescencia confocal 4D multicolor es un método potente para rastrear el comportamiento y la composición de un compartimiento intracelular en una escala de tiempo de 5-15 min. El análisis riguroso de la dinámica del compartimiento requiere la captura de miles de Secciones. Para lograr este objetivo, el fotoblanqueo y la fototoxicidad se minimizan escaneando rápidamente a muy baja potencia láser, y las dimensiones en píxeles y los intervalos de paso en Z se establecen en los valores más grandes que son compatibles con el muestreo de la imagen a resolución completa. Los conjuntos de datos 4D resultantes son ruidosos, pero se pueden suavizar mediante la desconvolución. Incluso con datos de alta calidad, la fase de análisis es difícil porque las estructuras intracelulares son a menudo numerosas, heterogéneas y móviles. Para satisfacer esta necesidad, los plugins personalizados de ImageJ se escribieron en datos 4D de matriz en una pantalla de computadora, identificar estructuras de interés, editar los datos para aislar estructuras individuales, cuantificar los cursos de tiempo de fluorescencia y hacer películas de las pilas Z proyectadas. Las películas 4D son particularmente útiles para distinguir compartimentos estables de compartimentos transitorios que se vuelcan por maduración. Estas películas también se pueden utilizar para caracterizar eventos como la fusión de compartimentos, y para probar los efectos de mutaciones específicas u otras perturbaciones.

Introducción

Los compartimentos del sistema de endomembrana están en flujo constante, y su caracterización completa requiere imágenes celulares vivas. Aquí se describe un protocolo que emplea la microscopía confocal 4D (time-lapse 3D) para visualizar compartimentos etiquetados fluorescentemente en levaduras en ciernes. El método fue desarrollado para rastrear la dinámica de los compartimentos secretores en Pichia pastoris y Saccharomyces cerevisiae^1,2,3. Este protocolo se centra en S. cerevisiae, que tiene un Golgi no apilado en el que las cisternae individuales....

Protocolo

1. Preparación

1. Hacer no fluorescentes mínimos NSD medio². Se espera que la ausencia de riboflavina reduzca la fluorescencia verde intracelular de fondo y la fototoxicidad asociada.
2. Cultivar la cepa de levadura durante la noche a 23 oC en fase logarítmica en 5 ml de NSD en un matraz desfofado de 50 ml con buena aireación. Aproximadamente 3-4 h antes del análisis, diluir el cultivo de levadura en NSD fresco para que la OD final₆₀₀ será 0.5-0.8 en el momento de la toma de imágenes.
3. Preparar una solución de 2 mg/ml de concanavalina A (ConA). Si lo desea, congele las alícuotas de esta solución en nitrógeno líquido y guárd....

Resultados

El ejemplo dado aquí documenta y cuantifica la maduración de dos levaduras Golgi cisternae visualizadas por la microscopía confocal 4D de doble color³. Una célula de levadura contiene en el orden de 10-15 Golgi cisternae, cada uno de los cuales madura en un curso de tiempo de aproximadamente 2-4 min. La maduración se puede visualizar etiquetando el marcador Golgi temprano Vrg4 con GFP y etiquetando el marcador Golgi tardío Sec7 con un fluorescente rojo fluorescente.......

Discusión

La toma de imágenes confocales 4D de los orgánulos de levadura requiere una afinación cuidadosa de múltiples parámetros. La principal preocupación es el fotoblanqueo y la fototoxicidad. Una película 4D típica implica la recopilación de miles de secciones ópticas, por lo que la iluminación láser debe mantenerse lo más baja posible. Las etiquetas de proteínas fluorescentes tándem se pueden utilizar para aumentar la señal sin aumentar la expresión de la proteína etiquetada^16,

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Platos con fondo de vidrio de 35 mm Nº 1.5	MatTek	P35G-0.170-14-C	Platos
imagen Concanavalin A polvo	Sigma-Aldrich	C2010
Trolox	Vector Laboratories	CB-1000
Microscopio confocal Leica SP8	Leica Microsystems
Leica Application Suite X	Leica Microsystems		Software para microscopio
Software Huygens Essential, versión 17.04	Scientific Volume Imaging		Software de deconvolución
ImageJ	NIH		Software de procesamiento y análisis de imágenes

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