Summary
Ce protocole fournit une méthode fiable pour établir des souris humanisées avec le système immunitaire humain et les cellules hépatiques. Les souris immunodéficientes doublement reconstituées réalisées par injection intrasplégique d'hépatocytes humains et de CD34- cellules souches hématopoïétiques sont sensibles à l'infection par le virus de l'immunodéficience humaine-1 et récapitulent les lésions hépatiques observées dans patients infectés par le VIH.
Abstract
Malgré l'espérance de vie accrue des patients infectés par le virus de l'immunodéficience humaine 1 (VIH-1), l'affection hépatique est devenue une cause fréquente de leur morbidité. L'immunopathologie hépatique causée par le VIH-1 reste insaisissable. Les petits modèles animaux de xénogreffe avec des hépatocytes humains et le système immunitaire humain peuvent récapituler la biologie humaine de la pathogénie de la maladie. Ici, un protocole est décrit pour établir un modèle de souris humanisée double par des hépatocytes humains et CD34- cellules hématopoïétiques de tige/progénitrice (HSPc) transplantation, pour étudier la pathologie immuno-hépatique telle qu'observée dans les patients HIV-infectés. Pour parvenir à une double reconstitution, hommes TK-NOG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug Tg(Alb-TK)7-2/ShiJic) souris sont injectées par voie intrapéritone avec des doses de ganciclovir (GCV) pour éliminer les cellules transgéniques du foie de la souris, et avec treosulfan pour le conditionnement nonmyeloablatif, qui faciliter l'engraftment de l'hépatocyte humain (HEP) et le développement du système immunitaire humain (HIS). Les niveaux humains d'albumine (ALB) sont évalués pour l'engraftment de foie, et la présence des cellules immunitaires humaines dans le sang détecté par cytométrie de flux confirme l'établissement du système immunitaire humain. Le modèle développé à l'aide du protocole décrit ici ressemble à de multiples composants des dommages au foie causés par l'infection par le VIH-1. Sa mise en place pourrait s'avérer essentielle pour l'étude de la co-infection par le virus de l'hépatite et pour l'évaluation des médicaments antiviraux et antirétroviraux.
Introduction
Depuis l'avènement du traitement antirétroviral, il y a eu une diminution substantielle des décès liés à la monoinfection par le VIH-1. Cependant, l'affection hépatique est apparue comme une cause fréquente de morbidité chez les patients infectés par le VIH1,2. Les coinfections des virus de l'hépatite par infection par le VIH-1 sont plus fréquentes, représentant 10 % à 30 % des personnes infectées par le VIH aux États-Unis3,4,5.
La spécificité de l'hôte des virus du VIH-1 et de l'hépatite limite l'utilité des modèles de petits animaux pour étudier des maladies infectieuses spécifiques à l'homme ou pour étudier de multiples aspects de la pathogénie hépatique associée au VIH-1. Les souris immunodéficientes qui permettent l'engraftment des cellules et/ou des tissus humains (appelés modèles humanisés de souris) sont des modèles animaux acceptables pour des études précliniques6,7,8. Depuis l'introduction de souris humanisées au début des années 2000, de multiples études précliniques sur la toxicité du foie humain cholestatique, les agents pathogènes spécifiques à l'homme, y compris le VIH-1 et les troubles neurocognitifs associés au VIH, le virus Epstein Barr, l'hépatite et d'autres maladies infectieuses, ont été étudiés chez ces souris6,9,10,11. Plusieurs modèles de souris pour les CD34et les HSPC et/ou la transplantation d'hépatocytes humains ont été développés depuis longtemps et se sont améliorés au fil du temps pour étudier la pathogénie de la maladie de l'hépatite B (HBV)-associée à la maladie du foie12, 13 (en) , 14. Plusieurs modèles de transplantation de HSPC et d'hépatocytehumain humain (HEP) sont basés sur des souches, connues sous le nom de NOG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac)8,13, NSG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)15, Balb/C-Rag2-/-- (Rag2tm1.1Flv Il2rgtm1.1Flv/J)12, et fah-/- NOD rag1-/- souris il2r-null16. Cependant, chaque modèle a ses propres avantages et limites; par exemple, les souris aFR8 doublement humanisées pour les PHE et les cellules souches humaines (HSC) sur un fond Balb/C-Rag2-/-C-/- permet l'engraftment réussi des cellules immunitaires et des HSC, mais il y a une absence d'un T- et d'un B-cellule réponse dans ce modèle12. Les principales préoccupations dans la reconstitution de souris double humanisées comprennent l'engraftment sous-optimal, l'absence de modèles appropriés pour soutenir différents tissus, des conditions dépareillées, le rejet immunitaire, ou la maladie degreffe-contre-hôte(GVHD), et technique difficultés, telles que les manipulations risquées avec les nouveau-nés et les taux de mortalité élevés dus à des anomalies métaboliques13.
Bien que les souris humanisées aient été utilisées pour la recherche sur le VIH depuis de nombreuses années17,18,19, l'utilisation de souris humanisées pour étudier les dommages au foie causés par le VIH-1 a été limitée20. Nous avons précédemment rapporté l'établissement d'un modèle de souris TK-NOG doublement humanisé et son application dans la maladie hépatique associée au VIH8. Ce modèle montre l'engraftment robuste des cellules hépatiques et immunitaires et récapitule la pathogénie d'infection par le VIH. Cette discussion présente un protocole détaillé, y compris les étapes les plus critiques dans la transplantation des hépatocytes humains. Une description des HSPC exigées pour une engraftment réussie des HEPs et l'établissement d'un système immunitaire fonctionnel dans les souris de TK-NOG est également présentée. L'utilisation de ces souris pour étudier l'immunopathogenèse hépatique associée au VIH est détaillée. Des souris mâles TK-NOG porteuses d'un transgène de type 1 de type 1 de type de thymidine kinase (HSV-TK) de type 1 de la kinase (HSV-TK) de type. Les cellules hépatiques de souris exprimant ce transgène peuvent facilement être alendues après une brève exposition à une dose non toxique de GCV. Les cellules du foie humain transplantées sont maintenues de façon stable dans le foie de souris sans médicaments exogènes21. Les souris sont également préconditionnées avec des doses non myélobolatives de treosulfan pour créer une niche dans la moelle osseuse de la souris pour les cellules humaines8. Les souris immunodéficientes de TK-NOG sont intrasplenically injectées avec des HEPs et des HSPC multipotents. Les souris sont alors régulièrement surveillées pour la reconstitution de sang et de foie par l'immunophénotypage de sang et les mesures des niveaux humains-albumins de sérum, respectivement. Les souris dont la reconstitution réussie est de plus de 15 % pour les cellules immunitaires humaines et les PHE sont injectées par voie intrapéritone avec le VIH-1. L'effet du VIH sur le foie peut être évalué dès 4 à 5 semaines après l'infection. Il est essentiel de noter que, parce que le VIH-1 est utilisé, toutes les précautions nécessaires doivent être prises lors de la manipulation du virus et de l'injecter chez la souris.
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Protocol
Ce protocole a été approuvé par l'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) du Centre médical de l'Université du Nebraska.
REMARQUE: Obtenir l'approbation de l'IACUC local avant d'effectuer des expériences sur des animaux.
1. Traitement du sang de cordon ombilical et isolement des HSPC humains
- Effectuer toutes les étapes du protocole dans des conditions stériles dans des armoires à débit laminaire.
- Prenez le sang de cordon ombilical (CB) recueilli dans des tubes héparinisés et faites le volume jusqu'à 35 ml en ajoutant la saline tamponnée de phosphate (PBS). Superposez l'échantillon au-dessus du milieu de séparation des lymphocytes (LSM) tel qu'illustré dans la figure 1 et centrifugez le LSM avec le CB en couches à 400 x g pendant 35 min à 4 oC sans freins.
REMARQUE : Diluer le sang soigneusement et doucement pour éviter le mélange à l'interface. - Retirez soigneusement la couche supérieure de LSM et de plasma et transférez l'interface blanche de manteau de buffy à un nouveau tube utilisant une pipette de transfert.
- Resuspendre le pelage bouffi dans 30 - 40 ml de tampon glace-froid (PBS - 0,5% d'albumine de sérum bovin [BSA] - 2 mM d'acide éthylènediaminetetraacetic [EDTA]). À l'aide d'une pipette, combiner 20 l l de la suspension cellulaire avec 20 l de 0,4 % de bleu trypan et une pipette de 10 l du mélange dans l'ouverture extérieure de l'une ou l'autre des deux chambres d'une glissière de comptage et insérer la glissière dans un compteur cellulaire automatisé pour compter les cellules.
REMARQUE: Utilisez un tampon glace-froid à toutes les étapes, car il aide à maintenir les cellules viables. - Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 10 min à 4 oC et aspirer soigneusement le supernatant. Ensuite, ajoutez 300 l de tampon glace-froid.
- Ajouter 100 l de réagent de blocage des récepteurs Fc humains et 100 l de microbilles monoclonales anti-humains CD34 de souris anti-humains CD34 pour un nombre de 1 x 108 cellules (voir le Tableau des matériaux). Incuber pendant 30 min à 4 oC, ajouter 10 ml de tampon glace-froid pour laver les cellules, et centrifuger à 300 x g pendant 10 min à 4 oC.
REMARQUE: Échelle de ce en fonction du nombre de cellules si plus de 1 x 108 cellules sont présentes. - Retirez soigneusement le supernatant, suspendez la pastille dans 500 l de tampon, et procédez à l'étape de séparation magnétique pour enrichir les HSPC.
- Placez une colonne LS de sélection positive (voir la Table des Matériaux) dans le champ de tri des cellules activées par magnétique et passez-la à travers avec 3 ml de tampon.
- Chargez l'échantillon vers la colonne LS qui peut piéger les microbilles liées au CD34 mD humain dans des échantillons et lui permettre de circuler sous l'influence de la gravité dans le tube de collecte.
- Laver la colonne 3x avec un tampon et recueillir l'elute dans le même tube de collecte du CD34- fraction de cellules.
- Plongez la colonne avec 5 ml de tampon pour éliper les cellules CD34dans un nouveau tube de collecte. Répétez la procédure pour atteindre une pureté de 'gt;90%.
- Comptez les cellules CD34et les cellules à l'aide d'un colorant bleu trypan dans un hémocytomètre. Après le comptage, centrifuger les cellules CD34à 300 x g pendant 5 min et jeter le supernatant.
- Resuspendre les cellules CD34dans 25 'L de PBS pour qu'une injection soit utilisée immédiatement dans la transplantation ou la cryopreserve les cellules à une concentration de 1-2 millions/mL dans le milieu de congélation (Roswell Park Memorial Institute medium [RPMI 1640 medium] - 50% fetal sérum bovin (FBS) - 10% de sulfoxide de diméthyle [DMSO]) pour une utilisation ultérieure dans la transplantation.
REMARQUE: Repensez toujours les cellules viables avant de les utiliser dans la transplantation. - Pour vérifier la pureté de l'elute CD34, prenez 50 l de la suspension et incubez-la avec 10 l d'anticorps CD34 anti-humains conjugués au PE pendant 30 min à 4 oC. Après l'incubation des anticorps, lavez les cellules tachées avec du PBS, suspendez-les dans 100 L de PBS, puis procédez à la cytométrie du débit. Ajouter un tube supplémentaire de cellules sans anticorps pour concevoir la porte dans le cytomètre de flux.
- Après l'acquisition, analysez les données en sélectionnant la région d'intérêt sur une parcelle de diffusion vers l'avant (FSC) et de dispersion latérale (SSC), suivie d'un gating pour les cellules individuelles sur les parcelles fSC-area et FSC-height. Cellules CD34-positives de porte sur des cellules simples dans le canal de PE et la parcelle de SSC-secteur.
2. Préparation d'hépatocytes humains pour la transplantation
- Retirer les hépatocytes cryoconservés de l'azote liquide, immerger rapidement le flacon dans le bain d'eau et décongeler pendant environ 90 à 120 s.
- Retirez le bouchon de flacon et versez les hépatocytes décongelés dans le tube conique de 50 ml du milieu de décongélation réchauffé.
- Suspendre les cellules en berçant le tube de 50 ml à la main pendant quelques secondes.
REMARQUE: Ne pas vortex le tube. - Pelleter les cellules à 100 x g pendant 8 min à température ambiante. Laver les cellules granulées en PBS avec 0,1 % de BSA et les mettre en commun avec des HSPC frais ou décongelés (ratio 10:1) en PBS dans un volume final de 80 L/souris.
3. Manipulation, dépistage, génotypage et traitement des animaux pour la transplantation de HSPC et d'hépatocytes humains
- Manipulation d'animaux
- En raison de l'immunodéficit grave, la race, la maison, et manipulent des souris de TK-NOG dans des conditions aseptiques.
- Portez toujours une blouse de laboratoire, des gants, des couvre-chaussures et un masque facial pour prévenir l'infection par des micro-organismes potentiellement pathogènes.
- Utilisez des gants et des instruments stériles pour la chirurgie et manipulez les animaux aseptiquement tout au long de la chirurgie.
- Sélection de souris TK-NOG pour l'expérience
- Maintenir la colonie de souches TK-NOG en élevant des souris femelles TK-NOG avec des compagnons de litière mâles non-TK-NOG et sélectionnez la progéniture transgénique par génotypage.
REMARQUE: Effectuer le génotypage (voir l'étape 3.3) pour déterminer la présence ou l'absence du transgène chez les souris mâles et femelles nouveau-nées au moment du sœur. - Sélectionnez les mâles à l'âge de 6 à 8 semaines pour la transplantation en raison de leur sensibilité élevée à l'épuisement GCV-négocié des hépatocytes transgéniques HSV-TK21.
- Ear-tag les souris au moment du sœur ou de la chirurgie pour faciliter l'identification. Notez le poids et l'état de santé des animaux.
- Maintenir la colonie de souches TK-NOG en élevant des souris femelles TK-NOG avec des compagnons de litière mâles non-TK-NOG et sélectionnez la progéniture transgénique par génotypage.
- Génotypage pour la présence du transgène HSV-TK à l'aide d'une réaction quantitative en chaîne de polymérase en temps réel
- Effectuer le génotypage au moment du sœur (généralement à l'âge de 3 à 4 semaines). Pour le génotypage, couper un morceau de l'oreille de la souris dans une armoire de sécurité biologique à flux laminaire pour maintenir la stérilité et extraire l'ADN génomique à l'aide d'une trousse d'isolement de l'ADN génomique.
- Amplifier l'ADN génomique extrait d'un morceau d'oreille dans un mélange de réaction de 20 L à l'écran pour le transgène HSV-TK sous le contrôle du promoteur d'albumine humaine en ajoutant 1 L d'amorce avant 5'-CCATGCACGTCTTTATCCTGG-3', 1 'L de l'amorce inverse 5'-TAAGTTGCAGCAgAGGGCCGT-3', 0.5 'L de Sonde FAM 5-FAM-AATCGCCCGCCCTGC-MGB-3', et 10 'L de master mix sur un instrument de réaction en chaîne de polymérase en temps réel (PCR)22.
- Définir les réglages PCR en temps réel comme suit : 60 oC pour 30 s (étape prélue), 95 oC pour 10 min (stade de maintien), 40 cycles de 95 oC pour 15 s et 60 oC pour 1 min (stade PCR) et 60 oC pour 30 s (étape de lecture).
REMARQUE: Un cycle de seuil (Ct) inférieur à 22 est considéré comme positif pour le transgène HSV-TK.
- Traitement à l'aide de ganciclovir et de treosulfan
- À l'aide d'une aiguille de 27 G, injectez aux souris TK-NOG des injections intrapéritonéales de VMC (6 mg/kg) 2 fois par jour au jour 7 et au jour 5 en 100 l de saline avant la chirurgie pour épuiser les cellules parenchymales transgéniques de la souris (comme le montre la stratégie expérimentale de la figure 2)23 .
- Les jours 3, 2 et 1 avant la chirurgie, conditionnez les souris avec des doses intrapéritoléales non myélo-abculées de treosulfan (1,5 g/kg/jour) dans 100 l de saline, à l'aide d'une aiguille de 27 G.
- Un jour avant l'opération, tirer de deux à trois gouttes (100 l) de sang de la veine submandibulaire en le piquant avec une lancette de 5 mm, et isoler le sérum en centrifuge (1 500 x g pour 10 min à 4 oC) pour l'analyse alanine aminotransferase (ALT) pour évaluer le degr ee de dommages au foie.
- Préparation à la chirurgie
- Utilisez des tondeuses pour raser la fourrure de la souris entourant le site d'incision (à gauche de la paroi péritonéale) avant la chirurgie.
- Ajustez le flux d'oxygène à 1 L/min et le flux d'isoflurane à 3% - 5% dans une chambre d'induction à l'aide d'une machine d'anesthésie de souris. Placez une souris à la fois dans la chambre d'induction pour l'anesthésie.
- Fixez l'extrémité d'un tube d'extension stérile (d'une capacité de rétention de 550 l l de suspension; consultez la Table des Matériaux pour les spécifications) à une aiguille de 30 G et à l'autre extrémité d'une seringue de 1 ml.
- Remplissez la seringue avec la suspension (80 l/souris) des PHE et des HSCP mis en commun (voir la section 2), ajustez la seringue dans l'encoche d'une pipette répétitive de distribution et ajustez le distributeur pour distribuer 10 L dans chaque presse.
- Une fois que les souris sont anesthésiées (généralement après 3 - 4 min), passer le flux d'isoflurane au cône de nez et de réduire le débit d'isoflurane à 2% - 3%.
- Transplantation intrasplégique de HSPC et d'hépatocytes humains chez la souris
- Effectuez toutes les étapes de chirurgie dans une armoire à flux laminaire dans des conditions stériles.
- Placez un drapé stérile propre sur la surface de travail et frottez le côté gauche du corps de chaque souris avec 10 % d'iode povidone suivi de 70 % d'alcool isopropyl, avant de faire une incision.
- Faire une petite incision (1 à 1,5 cm de longueur et 5 mm de profondeur) dans la peau, le muscle et le péritoine à gauche de la paroi péritonéale avec les ciseaux de type Vanna pour entrer dans la cavité péritonéale à environ 5 mm sous le bord inférieur de la cage thoracique.
- Localisez la rate, tirez-la légèrement avec des forceps à la zone d'opération pour un accès facile, et insérez l'aiguille de 30 G dans le poteau inférieur de la rate.
- Débloquez le piston de la pipette distributrice et distribuez 10 L du volume à la fois, avec une limite de 60 à 80 l par rate. Retirez l'aiguille lentement et coupez la rate avec des clips de ligature à l'aide d'une ligature applier.
- Repoussez la rate dans la cavité du corps avec des applicateurs à pointe de coton mouillés de PBS stérile.
- Fermer la couche musculaire de la paroi abdominale à l'aide d'une suture absorbable interrompue modèle de suture (pas continue). Accomplir la fermeture de la peau avec un modèle de suture interrompue en utilisant des sutures non absorbables.
- Utilisez des coussinets circulants d'eau chaude pour protéger les souris de l'hypothermie après la chirurgie.
- Enlever les sutures non absorbables 10-14 jours après la chirurgie.
- Soins postopératoires
- Lorsque l'animal transplanté se réveille, injecter de la buprénorphine analgésique (0,1 mg/kg) par voie intrapéritone, 2 fois par jour pendant 3 jours consécutifs.
- Observez les animaux au moins 1 fois par jour jusqu'à ce qu'ils reviennent à des conditions physiques normales.
REMARQUE: Vérifiez le poids corporel de chaque animal, puisque certaines souris peuvent perdre du poids après la chirurgie. Les souris retrouvent généralement leur poids d'origine en 1 à 2 semaines.
4. Validation d'engraftment du foie humain par ELISA et le système immunitaire humain par cytométrie de flux
REMARQUE: Évaluer la reconstitution du foie humain et du système immunitaire mensuellement, en commençant 1 mois après la transplantation par essai immunosorbent lié aux enzymes (ELISA) et la cytométrie du flux, respectivement.
- Recueillir des échantillons de sang de la veine sous-mandibulaire à l'aide de lancettes dans les tubes EDTA, et centrifugeuse à 1 500 x g pendant 10 min à 4 oC. Isoler le sérum pour vérifier les niveaux d'albumine humaine afin d'évaluer l'efficacité de l'engraftment du foie de souris pour les hépatocytes humains transplantés, à l'aide d'un ensemble de quantitation eLISA d'albumine humaine (voir le tableau des matériaux)en suivant le fabricant Instructions.
REMARQUE: Ne jetez pas la pastille et utilisez les cellules granulées pour une analyse de cytométrie du débit afin d'évaluer la reconstitution du système immunitaire humain. - Resuspendre la pastille cellulaire sans sérum dans 35 'L de tampon FACS (PBS ' 2% FBS) et taché de 5 'L de CD45 spécifique à la souris (concentration 0.5 mg/mL), 5 'L chacun de l'homme anticorps spécifiques CD45 (0,1 mg/mL), CD3 (0,2 mg/mL), CD8 (0,1 mg/mL) et CD19 (0,5 mg/ml) , et 20 oL de CD4 (0,25 mg/mL) et de CD14 (0,25 mg/mL) chacun pendant 30 min à 4 oC, pour vérifier le développement d'un système immunitaire fonctionnel à partir de CD34et HSPC.
REMARQUE: Envisagez d'ajouter un tube supplémentaire de cellules non tachées pour déterminer le gating des cellules tachées. - Après l'incubation, transférer la suspension tachée (100 l) dans un tube de cytométrie à fond rond en polystyrène et utiliser 2 ml de tampon de lyse 1x (voir le tableau des matériaux)en diluant 1 partie du tampon de lyse 10x avec 9 parties d'eau distillée et en couve 10 - 15 min pour lyser les globules rouges.
REMARQUE : Observez la turbidité pour évaluer la lyse de globule rouge. Une fois que l'échantillon devient clair, la lyse est terminée. - Après la lyse, ajouter 3 ml de tampon FACS dans le tube et centrifugeuse à 300 x g à 4 oC pendant 5 min pour obtenir une boulette. Répétez le lavage en ajoutant 3 ml de tampon FACS à la pastille et à la centrifugeuse à 300 x g à 4 oC pendant 5 min.
- Fixer les cellules dans le paraformaldehyde fraîchement fait 1% (PFA) et acquérir des cellules tachées sur le cytomètre de flux, analysé avec un logiciel de débit.
- Pour l'analyse, sélectionnez les lymphocytes qui se basent sur une parcelle fSC/SSC, suivis d'un gating unicellulaire sur la hauteur fSC-area/FSC.
- En outre, porte pour CD45 spécifique à l'homme (hCD45) sur la population unicellulaire et comprennent la souris-spécifique CD45 (mCD45) pour l'exclusion des cellules d'origine murine. Strategize gating de la population tachée basée sur le gating des cellules non tachées.
- Porte hCD45cellules pour déterminer la fréquence des cellules CD3et T et CD19et B. Cellules T de porte pour déterminer les sous-ensembles CD4 et CD8. Pour évaluer les monocytes, portez sur hCD45 pour déterminer Les monocytes CD14.
5. Infection par le VIH des souris TK-NOG et son effet sur le foie humain et le système immunitaire
- Traiter le virus VIH-1 et toutes les souris infectées dans une installation de biosécurité désignée de niveau 2.
MISE EN GARDE: Autoclave et jetez tous les déchets infectés par le VIH dans des sacs à double biorisque. Pour des raisons de sécurité, portez des gants résistants aux coupures tout en remettant des souris infectées par le VIH. - Portez de l'équipement de protection individuelle (EPI), y compris une robe de combinaison jetable, des couvre-chaussures, un masque facial et des gants doubles en tout temps tout en travaillant avec le virus.
- Sélectionnez des souris dont la reconstitution est de plus de 15 % des cellules CD45et 4.7 de l'homme (testées à l'étape 4.7) et avec une présence d'albumine humaine dans le sérum pour détecter l'infection par le VIH-1 (testée à l'étape 4.1).
- Injecter aux souris 1 x 103 à 1 x 104 doses infectieuses de culture tissulaire 50 (TCID50) HIV-1ADA dans un volume de 100 à 200 L par souris, par voie intrapéritone.
- Euthanasiez les souris infectées par le VIH 5 semaines après l'infection en utilisant l'isoflurane (avec une concentration de vapeur d'isoflurane de 'gt;5%).
- Après avoir euthanasié les souris, recueillir du sang dans les tubes EDTA par une ponction cardiaque pour l'isolement du sérum, pour voir l'effet du VIH-1 sur le foie en évaluant les niveaux d'albumine spécifiques à l'homme par ELISA (voir l'étape 4.1) et les cellules sanguines pour vérifier les changements dans le système immunitaire humain cellules utilisant la cytométrie de flux (voir les étapes 4.2 - 4.8).
REMARQUE: Évaluer la charge virale périphérique 5 semaines après l'infection sur un bioanalyseur pour confirmer si les souris sont infectées. - Après avoir prélevé du sang, exciser le foie des souris euthanasiées.
- Pour l'excision hépatique, exposer la cavité abdominale en faisant une incision de 1,5 - 2 cm de long et 0,5 cm de profondeur dans la peau, les muscles et le péritoine, à partir de la xyphoïde. Faire une coupe perpendiculaire à la colonne vertébrale entre le foie et le diaphragme. Soulevez le foie et couper toutes les membranes qui l'attachent à l'estomac et aux intestins.
- Recueillir et fixer le foie dans 4% de paraformaldéhyde pendant la nuit et suivre un protocole immunohistochimique standard pour évaluer l'effet du VIH sur CK18- hépatocytes en utilisant l'anticorps CK18 spécifique à l'homme8.
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Representative Results
L'établissement d'un modèle de souris doublement humanisé avec le foie humain et les cellules immunitaires peut être facilement surveillé à chaque étape avec eLISA très simple et cytométrie de flux, respectivement. La cytométrie des flux est régulièrement pratiquée pour évaluer le développement d'un système immunitaire fonctionnel et pour voir l'effet de l'infection par le VIH sur les cellules immunitaires. Chez les souris doublement humanisées, le développement de cellules immunitaires fonctionnelles peut varier de 15 % à 90 % de la porte des lymphocytes. Les sous-ensembles représentatifs de cellules immunitaires sont représentés dans des parcelles de points (figure 3). Pour l'évaluation de l'engraftment des hépatocytes humains, ELISA pour des niveaux d'albumine humains-spécifiques est exécuté mensuellement sur le sérum de souris. Les souris greffées avec des HSPC et des HEP montrent des niveaux d'albumine spécifiques à l'homme allant de 7 g/mL à 377 g/mL à un mois, continuant de croître au cours de la période d'observation (6 mois) (Figure 4). L'effet de l'infection par le VIH sur les cellules immunitaires humaines dans le sang des souris doublement humanisées est surveillé par cytométrie du débit et sur les PHE dans le foie par l'albumine eLISA spécifique à l'homme. D'ici 5 semaines, le VIH-1 provoque une diminution des niveaux d'albumine humaine dans le sérum, tel qu'évalué par ELISA, et il y a un appauvrissement des ck18humains - hépatocytes dans les sections hépatiques des souris doublement humanisées, tel qu'évalué par immunohistochemistry (Figure 5). Un rapport plus faible de CD4:CD8 est généralement observé, par cytométrie de flux, dans le sang et le foie des souris infectées par le VIH, par rapport aux niveaux notés chez la même souris avant l'infection (figure 6). Tous les réactifs et matériaux importants pour le protocole sont discutés dans la Table des Matériaux.
Figure 1 : Schéma de l'enrichissement des CD34et des cellules du sang de cordon ombilical. (A) Le sang de cordon est superposé sur le milieu de séparation des lymphocytes (LSM) et centrifugé pour isoler le pelage bouffi. (B) Les colonnes LS sont placées sur un support magnétique et rincées avec un tampon BSA, suivie s'ajouter une couche chamois. Les cellules positives pour CD34 sont emprisonnées dans les colonnes, et CD34- les cellules sont élucées dans des tubes séparés. Les cellules CD34piégées dans les résines de colonne sont plongées avec un piston, et les cellules sont rassemblées dans un nouveau tube. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Vue schématique de la conception expérimentale pour la double reconstitution des souris du foie et du système immunitaire humanisées, suivie d'une infection par le VIH-1. Les souris TK-NOG sont injectées avec du ganciclovir (GCV) à une dose de 6 mg/kg, 2 fois par jour, le jour -7 et le jour -5, suivie d'une injection de tréosulfan les jours -3, -2 et -1. Pour dépister les souris pour la transplantation (Tx), un aminotransferase d'alanine (ALT) est effectué un jour avant la chirurgie, et les souris avec des niveaux d'ALT de 'gt;;600 U/L sont sélectionnés. Après la transplantation, les souris sont vérifiées pour une reconstitution du système immunitaire humain par cytométrie de flux (FACS) et pour la reconstitution du foie en évaluant leur niveau d'albumine à l'aide d'ELISA. Les souris sont infectées par le VIH-1 5 semaines avant d'être sacrifiées. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Stratégie de gating d'analyse de cytométrie de flux pour la distribution de cellules humaines du sang. (A) Tout d'abord, les lymphocytes sont fermés sur le sang entier basé sur FSC-A et SSC-A. (B) Les cellules individuelles sont fermées sur les lymphocytes. (C) Les cD45humains sont fermés sur des cellules simples à l'aide de la souris CD45 et du CD45 humain. (D) CD3- Les lymphocytes T et les cellules CD19et B sont identifiés sur les CD45 ferméset les leucocytes humains. (E) CD4- T cellules d'aide et CD8- cellules T cytotoxiques sont identifiés dans les cellules Fermées CD3t. (F) CD14- monocytes sont fermés à partir de CD45 humains- leucocytes. Les résultats représentés ici proviennent d'une souris transplantée avec des hépatocytes humains doubles et des HSPC. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : La concentration d'albumine est mesurée par ELISA dans le sérum de souris doublement humanisées. Les souris sont transplantées avec des hépatocytes humains (HEP) et CD34- cellules hématopoïétiques de tige/progéniteur (HSPc)(n - 11). Le sérum est recueilli à différents moments à 1, 4 et 6 mois après la transplantation, et des dilutions sont faites pour ajuster les concentrations d'échantillons inconnues dans la gamme des normes. Chaque symbole représente une valeur de souris individuelle. Les résultats représentent la médiane, ainsi que les valeurs individuelles. P lt; 0,05, par ANOVA à sens unique. Ce chiffre a été modifié à partir de Dagur et coll.8. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Effet sur le VIH-1 sur les niveaux d'albumine dans le sérum et l'épuisement des epatocytes humains CK18 dans le foie des souris doublement humanisées. (A) Les concentrations d'albumine sont surveillées chez des souris non infectées(n - 9) transplantées à la fois avec des PHE humains et des HSPC à 1 et 4 mois. Les souris sont infectées(n - 10) par le VIH à 4 à 5 mois après la transplantation et sacrifiées 5 semaines après l'infection. Chaque symbole représente une valeur de souris individuelle. Les résultats représentent la médiane, ainsi que les valeurs individuelles. P lt; 0,05, par ANOVA à sens unique. Ce chiffre a été modifié à partir de Dagur et al. 8. (B) Les sections hépatiques à cinq microns provenant de souris non infectées (HEP et HSPC, panneau gauche) et de souris TK-NOG infectées par le VIH (HEP et HSPC , VIH, panneau droit) sont fixes, paraffines intégrées et tachées d'anticorps anti-humains cytokératine-18 (CK18). Le VIH-1 causant un appauvrissement des hépatocytes CK18est mis en évidence par une zone moins occupée par les celluleshumaines CK18. Les résultats représentés ici proviennent d'une souris non infectée et d'une souris infectée par le VIH transplantée avec des hépatocytes humains doubles et des HSPC. Barres d'échelle de 100 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6 : Ratio des cellules CD4et Des cellules CD8et Des lymphocytes T dans le sang périphérique et dans le foie des souris non infectées et infectées par le VIH-1. Pour les souris non infectées reconstituées doubles : cercle fermé ; HEPs et HSPCs; sang n ' 7; foie n 6. Pour les souris infectées par le VIH-1 : cercles ouverts; HEPs - HSPc - VIH; sang n ' 10; foie n 11. Les résultats représentent la médiane, ainsi que les valeurs individuelles. P et lt; 0,05, par test ANOVA à sens unique entre souris infectées par le VIH et non infectées. Ce chiffre a été modifié à partir de Dagur et coll.8. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Le foie est compromis et endommagé chez les patients infectés par le VIH24. Les modèles expérimentaux de petits animaux pour étudier les maladies du foie humain en présence du VIH-1 sont extrêmement limités, malgré la disponibilité de quelques modèles animaux cotransplantés avec CD34et HSPc et hépatocytes7,12, 25. Dans les expériences in vitro, il est démontré que les hépatocytes sont infectés par le VIH-1 de faible niveau26. Les souris humanisées qui transportent les deux types de cellules humaines sont un modèle souhaitable. Le foie de souris reconstituéavec seulement le système immunitaire humain a été montré pour être affecté par l'infection de HIV sous l'épuisement expérimental des cellules T réglementaires humaines20,27. Cependant, la différence dans les propriétés immunitaires et fonctionnelles des hépatocytes de souris et humains peut souligner les différences dans leurs réponses au VIH-1 et aux cellules immunitaires. Dans cette revue, un protocole est décrit pour reconstituer le système immunitaire humain et le foie et pour adresser l'immunopathologie de foie HIV-1-associée, comme observé dans hiv-1-infectés patients. Des souris mâles de TK-NOG ont été choisies en raison de leur expression élevée de l'ARNm de foie-sélectif de le transgène de HSV-TK et de la susceptibilité de la toxicité de GCV au foie transgénique de souris21. En outre, ils peuvent être maintenus pendant de longues périodes après la transplantation sans l'utilisation de médicaments exogènes et ne développent pas de maladies systémiques spontanées28. Pour établir le système immunitaire humain et la reconstitution de foie, l'ablation du système immunitaire de souris et des dommages aux cellules hépatiques souris-spécifiques sont exigés et réalisés utilisant des doses nonmyeloablatives de treosulfan et de GCV, comme indiqué précédemment dans les souris mâles de TK-NOG13 ,23. Les souris sont injectées avec gCV et treosulfan à l'âge de 6 - 8 semaines, comme l'expression de la lésion hépatique induite par le transgène et gCV telle qu'évaluée par les niveaux d'ALT sont optimales, alors, pour fournir niche-à-transplanté cellules humaines21. Les souris présentant des niveaux d'ALT de 200 U/L, mais de 600 U/L, sont généralement sélectionnées pour la transplantation. Les souris montrant des niveaux d'ALT de l'U/L de '600 sont à un plus grand risque de mort car les hépatocytes humains ne sont pas en mesure de sauver la fonction endommagée du foie de souris.
Actuellement, la double humanisation est montrée par la transplantation des CD34 humains- HSPc et cellules foetales de foie ; cependant, la manipulation des animaux nouveau-nés crée des problèmes techniques13,14. Les HSPC peuvent être dérivés ou isolés de sources multiples, telles que les cellules hépatiques fœtales (FLC), les cellules souches embryonnaires (ESC) et les CB. Cependant, les questions éthiques limitent l'utilisation des ESC et des FLC. CB n'a pas une telle restriction et est une alternative la plus utile pour obtenir des HSPC, en plus d'être une source précieuse de cellules hématopoïétiques primitives de tige et d'ancêtre qui peuvent reconstituer le système immunitaire fonctionnel système. Le sang de cordon ne devrait pas être plus vieux qu'un jour lorsqu'il est utilisé pour isoler les HSPC, car le rendement des HSPC est fortement affecté par l'âge. La pureté des HSPC isolés doit être vérifiée avant de cryopréserver les cellules. La contamination croisée des lymphocytes CD3et T est évitée, car elle peut conduire à la greffe systémique de souris-contre-la maladie d'hôte et à l'allorejet aigu des HEP tout en transplantant avec des cellules dépareillées.
Les hépatocytes disponibles dans le commerce ont été utilisés comme source de reconstitution du foie8,13. Les hépatocytes adultes sont préférés pour établir la reconstitution du foie en raison de leur efficacité accrue dans l'engraftment et la durabilité pendant une longue période de temps29.
La présence du système immunitaire humain dans un modèle de souris a augmenté les niveaux d'ALB, comme indiqué précédemment30,31. Cependant, l'efficacité des hépatocytes et de la reconstitution du système immunitaire peut varier selon les différentes sources de cellules donneuses et dépendder de la souris receveuse. Ainsi, chaque souris doit être évaluée pour l'engraftment, et la partie la plus critique est d'utiliser les anticorps ou le réactif qui sont spécifiques à l'homme et ne pas croiser avec les cellules de la souris. Les réactifs et anticorps spécifiques à l'homme utilisés dans l'étude présentée ici sont détaillés dans le Tableau des matériaux. Si des anticorps autres que ceux fournis dans le Tableau des matériaux sont utilisés pour l'étude, assurez-vous de vérifier la spécificité humaine.
La condition optimale serait la transplantation de cellules syngénéiques ; cependant, c'est techniquement difficile à réaliser. Dans la mesure du possible, les HSPC et les hépatocytes devraient être mis en commun à partir de donneurs avec des antigènes de classe 1 de leucocyte humain partiellement assortis (comme HLA-A2).
Pour dépister les souris pour les études sur le VIH, le sang est prélevé à plusieurs moments pour déterminer la reconstitution optimale du système immunitaire et du foie; cytométrie de flux et ELISA sont préférés car ils peuvent être effectués avec seulement une petite quantité de sang. Les cellules sanguines et le sérum du même échantillon pourraient être utilisés pour la cytométrie du débit et ELISA, respectivement. Il est important de faire des dilutions appropriées du sérum à chaque point de temps (1 000 à 40 000 gamme) pour évaluer les niveaux d'ALB afin que les concentrations inconnues puissent être portées dans la fourchette des concentrations standard (gamme de kit : 6,25 - 400 ng/mL).
Les cytokines proinflammatoires en réponse à l'infection par le VIH-1 en présence du système immunitaire humain peuvent également être utiles pour traiter l'interaction des hépatocytes et des cellules immunitaires. Le modèle est utile pour montrer l'immunopathogenèse de l'affection hépatique induite par le VIH-1, étant donné qu'il récapitule les lésions hépatiques de la même manière que chez l'homme, comme en témoigne un faible ratio de CD4:CD8, une diminution des niveaux d'ALB, la mort de l'hépatocyte humain, et le foie immunitaire activation. Le modèle a également quelques limitations, telles qu'un bas niveau d'activité cytotoxique de cellules De et le commutateur altéré de classe d'immunoglobuline. En raison de la présence du système immunitaire humain et du foie, le modèle présenté ici est prometteur pour les coinfections de studi du VIH-1 et des virus de l'hépatite, l'infection chronique de l'hépatite (pour clarifier les mécanismes de la réponse immunitaire anti-hépatite), et comme une cirrhose modèle.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la subvention r24OD018546 de l'Institut national de la santé (à L.Y.P. et S.G.). Les auteurs tenons à remercier Weizhe Li, Ph.D., pour l'aide dans les procédures chirurgicales, Amanda Branch Woods, B.S., Yan Cheng pour l'immunohistologie, les membres de l'installation de recherche sur la cytométrie des flux de flux de l'UNMC Directeur Phillip Hexley, Ph.D., Victoria B. Smith, B.S., et Samantha Wall(S.-B.), membres avancés de l'installation de microscopie de l'UNMC, Janice A. Taylor, B.S., et James R. Talaska, B.S., pour le soutien technique. Les auteurs reconnaissent les Drs Mamoru Ito et Hiroshi Suemizu de la CIEA pour avoir fourni des souris TK-NOG et le Dr Joachim Baumgart pour avoir fourni des treosulfan. Les auteurs remercient le Dr Adrian Koesters, UNMC, pour sa contribution éditoriale au manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 27 G1/2" needles | BD biosciences | 305109 | |
| 30 G1/2" needles | BD biosciences | 305106 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube 12 mm x 75 mm style | Corning | 352054 | |
| BD 1 mL Tuberculin Syringe Without Needle | BD biosciences | 309659 | |
| BD FACS array bioanalyzer | BD Biosciences | For purity check of eluted CD34+ cells | |
| BD FACS array software | BD Biosciences | Software to analysis acquired CD34+ cell on FACS array | |
| BD FACS lysing solution | BD Biosciences | 349202 | To lyse red blood cells |
| BD LSR II | BD Biosciences | Instrument for acquisiton of flow cytometry samples | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tube | BD biosciences | BD 367874 | To collect Cord blood |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-aldrich | A9576 | |
| Buprenorphine | Controlled substance and pain-killer | ||
| CD14-PE | BD Biosciences | 555398 | Specific to human |
| CD19-BV605 | BD Biosciences | 562653 | Specific to human |
| CD34 MicroBead Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-046-702 | For isoation of CD34+ HSPC |
| CD34-PE, human | Miltenyi Biotec | 130-081-002 | Antibody used for purity check of eluted CD34+ cells |
| CD3-AF700 | BD Biosciences | 557943 | Specific to human |
| CD45-PerCPCy5.5 | BD Biosciences | 564105 | Specific to human |
| CD4-APC | BD Biosciences | 555349 | Specific to human |
| CD8-BV421 | BD Biosciences | 562428 | Specific to human |
| Cell counting slides | Bio-rad | 1450015 | |
| ChargeSwitch gDNA Mini Tissue Kit | Thermofisher scientific | CS11204 | for extraction of genomic DNA from ear piece |
| Cobas Amplicor system v1.5 | Roche Molecular Diagnostics | bioanalyzer to measure viral load | |
| Cotton-tipped applicators | McKesson | 24-106-2S | |
| Cytokeratin-18 (CK18) | DAKO | M7010 | Specific to human |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma-aldrich | D2650-5X5ML | |
| Extension set Microbore Slide Clamp(s) Fixed Male Luer Lock. L: 60 in L: 152 cm PV: 0.55 mL Fluid Path Sterile | BD biosciences | 30914 | Attached to dispensing pippet and to load with HSPC and HEP suspesion |
| FACS Diva version 6 | BD Biosciences | flow cytometer software required for acqusition of sample | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10438026 | |
| FLOWJO analysis software v10.2 |
FLOWJO, LLC | flow cytometry analysis software | |
| Ganciclovir | APP Pharmaceuticals, Inc. | 315110 | Prescripition drug |
| Greiner MiniCollect EDTA Tubes | Greiner bio-one | 450475 | |
| Hepatocytes thawing medium | Triangle Research Labs | MCHT50 | |
| Horizon Open Ligating Clip Appliers | Teleflex | 537061 | To hold the ligating clips |
| Hospira Sterile Water for Injection | ACE surgical supply co. Inc. | 001-1187 | For dilution of Buprenorphine (pain-killer) |
| Human Albumin ELISA Quantitation Set | Bethyl laboratories | E80-129 | For assesing human albumin levels in mouse serum |
| Human hepatocyte | Triangle Research Labs | HUCP1 | Cryopreserved human hepatocytes, induction qualified |
| Iris Scissors, Straight | Ted Pella, Inc. | 13295 | |
| Lancet | MEDIpoint | Goldenrod 5 mm | |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Used to entrap CD34+ microbeads (positive selection) |
| Lymphocyte Separation Medium (LSM) | MP Biomedicals | 50494 | For isoation of lymphocytes from peripheral blood |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | holds Qudro MACS seperator and LS columns |
| McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5605 | Used to make an incision on skin to expose spleen |
| Micro Dissecting Forceps | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5157 | to hold and pull out spleen from peritoneal cavity |
| mouse CD45-FITC | BD Biosciences | 553080 | mouse-specific |
| PBS (Phosphate Buffered Saline) | Hyclone | SH30256.02 | |
| Qudro MACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | holds four LS columns |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 11875093 | |
| StepOne Plus Real Time PCR | Applied Biosystems | Instrument used to genotype | |
| Stepper Series Repetitive Dispensing Pipette 1ml | DYMAX CORP | T15469 | Used to dispense HSPC and HEP supension in controlled manner |
| Suturevet PGA synthetic absorbale suture | Henry Schein Animal Health | 41178 | Suturing of skin and peritoneum |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Thermofisher scientific | 4369016 | |
| TC20 automated cell counter | Bio-rad | 1450102 | |
| TK-NOG mice | Provided by the Central Institute for Experimental Animals (CIEA, Japan; Drs. Mamoru Ito and Hiroshi Suemizu) | ||
| Treosulfan | Medac GmbH | Provided by Dr. Joachim Baumgart (medac GmbH) | |
| Trypan Blue | Bio-rad | 1450022 | |
| Vannas-type Micro Scissors, Straight, 80mm L | Ted Pella, Inc. | 1346 | Used to make an incision on skin to expose spleen |
| Weck hemoclip traditional titanium ligating clips | Esutures | 523700 | To ligate the spleen post-injection |
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