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Genetics

qKAT: quantitativa coeficiente digitação de assassino-célula Genes de receptores de imunoglobulina-como

Published: March 6, 2019 doi: 10.3791/58646
Automatic Translation
1,2,3,4, 1, 1,5, 1,6, 1,7, 1
1Department of Pathology, University of Cambridge, 2Department of Physiology, Development and Neuroscience, University of Cambridge, 3Department of Obstetrics and Gynaecology, University of Cambridge School of Medicine, NIHR Cambridge Biomedical Research Centre, 4Centre for Trophoblast Research, University of Cambridge, 5Department of Genetics & Evolution, University of Geneva, 6Royal Papworth Hospital, 7Department of Plant Sciences, University of Cambridge

Summary

Pilha de assassino quantitativa imunoglobulina-como receptor (KIR) semi-automático digitação (qKAT) é um método simples, alto rendimento e baixo custo para copiar números genes KIR de tipo para sua aplicação em estudos de associação de população e a doença.

Abstract

Receptores de imunoglobulina-like da pilha de assassino (KIRs) são um conjunto de receptores imunes inibitórios e ativando, assassinas naturais (NK) e células T, codificadas por um cluster polimórfico de genes no cromossomo 19. Seus ligantes mais bem caracterizadas são as moléculas de antigénios (HLA) de leucócito humano que são codificadas dentro o locus de (MHC) complexo principal de histocompatibilidade no cromossomo 6. Não há evidências substanciais de que desempenham um papel significativo na imunidade, reprodução e transplante de órgãos, tornando-se crucial ter técnicas que podem com precisão genótipo-los. No entanto, sequência de alta homologia, também como alélica e variação do número de cópia, dificultam ao genótipo e, eficientemente, métodos de projeto que podem com precisão todos os genes KIR . Os métodos tradicionais são geralmente limitados a resolução dos dados obtidos, produtividade, rentabilidade e o tempo necessário para configurar e executar os experimentos. Nós descrevemos um método chamado quantitativo KIR digitação semi-automática (qKAT), que é um método de reação em cadeia de polimerase em tempo real multiplex do elevado-throughput que pode determinar o número de cópias do gene para todos os genes no locus do KIR . qKAT é um método simples de alto rendimento que pode fornecer dados de alta resolução KIR cópia números, que podem ser mais usados para inferir as variações nos haplótipos estruturalmente polimórficas que eles englobam. Dados de número e haplótipo esta cópia podem ser benéficos para estudos sobre associações de doença em grande escala, genética de populações, bem como investigações sobre a expressão e interações funcionais entre KIR e HLA.

Introduction

Em humanos, os receptores de imunoglobulina-como assassino(KIR) locus é mapeado no braço longo do cromossomo 19 dentro o leucócitos do receptor complexo (LRC). Esse locus é cerca de 150 kb de comprimento e inclui 15 KIR genes arranjados cabeça a cauda. Os loci KIR que é atualmente conhecidos são KIR2DL1, KIR2DL2/KIR2DL3 KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1-5, KIR3DL1/KIR3DS1, KIR3DL2-3, e dois pseudogenes, KIR2DP1 e KIR3DP1. Os genes KIR codificam para bidimensional (2D) e tridimensionais (3D) domínio de imunoglobulina-como receptores com short (S; ativando) ou longa (L; inibitório) cauda citoplasmática, que é expressos por células assassinas naturais (NK) e subconjuntos de T células. Variação de número de cópia exibiu dentro das formas de locus KIR diversos haplótipos com gene variável conteúdo1. Recombinação homóloga não-alélica (NAHR), facilitada por um arranjo de gene de cabeça-de-cauda estreita e sequência de alta homologia, é o mecanismo proposto para ser responsável para a variabilidade de haplotypic. Mais de 100 diferentes haplótipos foram relatados em populações em todo o mundo1,2,3,4. Todos estes haplótipos podiam ser divididos em dois grandes grupos: A e B haplótipos. O haplótipo A contém 7 genes KIR : KIR3DL3, KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR3DL1e KIR3DL2, que são inibitórios genes KIR e a activação KIR gene KIR2DS4. No entanto, até 70% de indivíduos de origem europeia que são homozigotos para KIR haplótipo A exclusivamente levar para uma forma de "exclusão" não-funcional de KIR2DS45,6. Todas as outras combinações de genes KIR formam grupo B haplótipos, incluindo pelo menos um dos genes KIR específicos KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS5, KIR3DS1, KIR2DL2, e KIR2DL5e tipicamente incluem dois ou mais genes KIR ativando.

Moléculas de HLA classe I foram identificados como ligantes para determinados receptores inibitórios (KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3e KIR3DL1), ativando os receptores (KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS4, KIR2DS5e KIR3DS1), e para KIR2DL4, que é um exclusivo KIR que contém um longo citoplasmático rabos como outros receptores KIR inibitórios, mas também tem um resíduo de carga positiva perto o domínio extracelular, que é um comum característica de outros receptores KIR ativando. A combinação de variantes dentro dos genes KIR e os genes HLA influencia a interação do ligante do receptor que formas potencial NK célula capacidade de resposta a nível individual7,8. Evidências de estudos genéticos Associação indicou que KIR desempenha um papel na resistência viral (ex.., vírus de imunodeficiência humana [HIV]9 e hepatite C vírus [HCV]10), o sucesso do transplante de 11, o risco de gravidez transtornos e sucesso reprodutivo12,13, a proteção contra a recaída após células-tronco hematopoéticas alogênico transplante (TCTH)14,15, 16e o risco de cancros17.

A combinação de sequência de alta homologia e alélica e haplotypic diversidade apresenta desafios na tarefa de genes KIR com precisão genotipagem. Métodos convencionais para digitar genes KIR incluem a primeira demão de sequência-específica (SSP) do polymerase reação em cadeia (PCR)18,19,20, sequência específica oligonucleotide sonda PCR (SSOP)21, e laser assistida matriz desorção ionização-tempo de voo de espectrometria de massa (MALDI-TOF MS)22. As desvantagens dessas técnicas são que eles só fornecem visão parcial sobre o genótipo de um indivíduo enquanto também ser trabalhoso executar. Recentemente, sequenciamento de próxima geração (NGS) tem sido aplicado para digitar o locus KIR especificamente. Enquanto este método é muito poderoso, pode ser caro executar, e é demorado para realizar verificações de dados e análise em profundidade.

qKAT é um método PCR quantitativo elevado-throughput. Enquanto os métodos convencionais são laborioso e demorado, este método torna possível executar quase 1.000 amostras de DNA (gDNA) genômicas em cinco dias e dá o genótipo KIR , bem como o número de cópia do gene. qKAT é composto por dez reações multiplex, cada um dos quais metas dois loci KIR e um gene de referência de um número fixo de cópia no genoma (STAT6) utilizado para a quantificação relativa do gene KIR copiar número23. Este ensaio tem sido usado com sucesso em estudos envolvendo painéis de grande população e doença coortes sobre doenças infecciosas como HCV, doenças auto-imunes, como diabetes tipo 1 e transtornos da gravidez como pré-eclâmpsia, bem como fornecendo uma genética na base de estudos que visa compreender o NK celular função1,4,24,25,26.

Protocol

1. preparação e chapeamento do DNA

  1. Quantificar com precisão a concentração de gDNA usando um instrumento espectrofotométrico ou fluorométrica.
  2. Dilua o DNA a 4 ng / µ l em uma placa de 96 poços profundos-bem. Incluem pelo menos uma amostra de gDNA de controle com um número de cópia conhecida e um modelo de controle.
  3. Centrifugar as placas de 96 poços a 450 x g por 2 min.
  4. Usando um instrumento de manipulação de líquidos, dispensar cada amostra em quadriplicado nas chapas de qPCR 384-bem, para que cada poço tem 10 ng de DNA (2,5 µ l/poço). Prepare pelo menos dez chapas de 384-bem, uma para cada reação qKAT.
  5. Se gDNA fornecimento de mais de uma placa de 96 poços, realize uma lavagem de volume completo com 2% de lixívia e água ultrapura para limpar as agulhas do líquido sistema entre cada placa de 96 poços de gDNA amostras de manipulação.
  6. Secar o DNA por incubar as placas de 384-bem em uma área limpa, em temperatura ambiente pelo menos 24 h.

2. preparação das sondas e Primers

Nota: qKAT é composto por dez reações multiplex. Cada reação inclui três pares da primeira demão e três sondas de fluorescência-etiquetada que amplificam especificamente dois genes KIR e referência de um gene. As sondas que foram publicadas no Jiang et al.27 foram modificadas para que os oligonucleotides agora são rotulados com corantes ATTO desde que eles oferecem maior fotoestabilidade e vidas sinal longo. Cartilha pré-aliquotadas combinações são comercialmente disponíveis (ver Tabela de materiais).

  1. Prepare as combinações de cartilha para cada reação conforme as diluições indicado na tabela 1.
  2. Prepare sonda combinações para cada reação, conforme tabela 1. Teste cada sonda individual antes de fazer a combinação.

3. preparação do Master Mix

Nota Os volumes mencionados abaixo são para a realização de uma reação de qKAT em um conjunto de placas de 10 x 384-bem.

  1. Certifique-se de que as amostras de gDNA chapeadas com as placas do 384-bem estão completamente secas. Realizar todos os passos no gelo e manter os reagentes cobertos da exposição à luz tanto quanto possível, desde que as sondas de fluorescência-etiquetada são foto - e termo-sensível.
  2. Degele o buffer de qPCR, primer e alíquotas de sonda a 4 ° C.
  3. No gelo, prepare uma mistura de mestre para placas de 10 x 384-bem adicionando 18,86 mL de água ultrapura, 20 mL de tampão de qPCR, 1.000 µ l de combinação preprepared cartilha e 180 µ l de combinação de sonda preprepared (tabela 2).
  4. Distribua uniformemente a mistura de mestre através de uma placa de 96 de profundidade bem usando uma pipeta multicanal, pipetagem 415 µ l em cada poço. Manter esta placa em uma caixa de gelo coberta de luz.
  5. Usando um instrumento de manipulação de líquidos, dispense 9,5 µ l do mix mestre em cada poço da placa 384-bem com gDNA seca. Selar o prato com uma folha e coloque-o imediatamente a 4 ° C. Repita este processo para as restantes placas, garantindo que as agulhas do líquido sistema de manipulação são lavadas com água entre cada prato.
  6. Centrifugar as placas de 384 poços a 450 x g por 3 min e incube-os a 4 ° C durante a noite ou entre 6-12 h para Ressuspender o DNA e para dissipar quaisquer bolhas de ar.

4. ensaio de qPCR

  1. Após a incubação durante a noite, centrifugar a 450 x g durante 3 min dissipar quaisquer bolhas de ar restantes.
  2. Para efeitos de automação, ligue a máquina de qPCR (por exemplo, LightCycler 480) a um manipulador de microplaca (ver Tabela de materiais). Programa manipulador de microplacas para colocar as placas na máquina qPCR de uma doca de armazenamento refrigerado protegido da luz.
    Nota os ensaios devem, em teoria, trabalhar em outras máquinas de qPCR com configurações de ópticas compatíveis.
  3. Use as seguintes condições de ciclismo: 95 ° C por 5 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C por 15 s e 66 ° C para 50 s, com coleta de dados a 66 ° C.
  4. Uma vez concluída a execução, tem o robô recolher a placa da máquina qPCR e colocá-lo no banco do réus de descarte.

5. após a execução da análise

  1. Após a amplificação, calcular os valores de ciclo (Cq) de quantificação usando o segundo método de máximo derivativo ou o método de pontos de ajuste com o software da máquina qPCR (ver Tabela de materiais), seguindo os passos abaixo.
  2. Abra o software de qPCR e, na aba do navegador , abra o arquivo de experimento de reação salvos para um prato.
  3. Para a análise usando o segundo método de máximo derivado, selecione a guia de análise e criar uma nova análise, usando o método Abs Quant/Second derivado Max.
    1. Na janela criar nova análise , seleccione o tipo de análise: o método Abs Quant/Second derivado Max, subconjunto: todas as amostras, programa: amplificação, nome: Rx-DFO (onde x é o número de reação).
    2. Selecione Filtro Comb e escolha VIC/HEX/Yellow555 (533-580). Isso garante que os dados coletados para STAT6 estão selecionados.
    3. Selecione cor compensação para VIC/HEX/Yellow555(533-580). Clique em calcular. Repita isto para Fam (465-510) e Cy5/Cy5.5(618-660). Clique em salvar arquivo.
  4. Para a análise usando o método de pontos de ajuste, selecione Abs Quant/Fit pontos na guia de análise.
    1. Na janela criar nova análise , seleccione o tipo de análise: o método Abs Quant/Fit pontos, subconjunto: todas as amostras, programa: amplificação, nome: RxF-DFO (onde x é o número de reação).
    2. Selecione os filtros corretos e compensações de cor para cada um dos genes KIR (Fam/Cy5) e o STAT6 . Na guia Noiseband , defina a banda ruído para eliminar o ruído de fundo.
    3. Na guia análise , definir os pontos de ajuste para 3 e selecione que mostrar pontos de ajuste. Clique em calcular. Clique em salvar arquivo.

6. exportação dos resultados

  1. No software qPCR, abra o navegador Tab. Selecione Exportar de lote de resultados.
  2. Abra a pasta na qual os arquivos do experimento são salvos em transferir os arquivos para a seção do lado direito da janela. Clique em seguinte. Selecione o nome e o local do arquivo de exportação.
  3. Selecione o tipo de análise o método Abs Quant/Second derivado Max ou Abs Quant/Fit pontos. Clique em seguinte. Verifique se o nome do arquivo, a pasta de exportação e o tipo de análise estão correto e clique em próximo para iniciar o processo de exportação.
  4. Espere até que o Status de exportação é Okey. A tela automaticamente se moverá para o próximo passo. Verifique que todos os arquivos selecionados foram exportados com sucesso para que o número de arquivos falhou = 0. Clique em concluído.
  5. Use scripts split_file.pl e roche2sds.pl para dividir as placas exportadas em reações individuais para cada placa.
    Nota os scripts são fornecidos na solicitação/GitHub.

7. Copie o número de cálculos

  1. Abra o software de análise número da cópia (por exemplo, CopyCaller). Selecione Importar arquivo de resultados PCR em tempo real e carregar arquivos de texto criados pelo roche2sds.pl.
  2. Selecione analisar e realizar a análise ou selecionando amostra Calibrador com número de cópia conhecida ou selecionando o número mais frequente de cópia. Ver tabela 5 para o número mais frequente de cópia de genes KIR tipicamente observada em populações de origem europeia.

8. qualidade dos dados verifica

  1. Use script de R KIR_CNVdata_analysis_for_Excel_ver020215. R para combinar dados de número de cópia de todas as placas em uma planilha.
    Nota os scripts são fornecidos na solicitação/GitHub.
  2. Verifique novamente os dados brutos sobre o software de análise de número de cópia para amostras que não estão em conformidade com o desequilíbrio de ligação conhecida (LD) para genes KIR (quadro 6).

Representative Results

Análise do número de cópia pode efectuar exportando os arquivos para o software de análise número de cópia, que fornece o número de cópia previsto e estimado baseado no método ΔΔCq.

O número de cópia pode ser previsto com base no número de amostras de DNA de controle na placa ou inserindo o número de cópia de gene mais frequente (tabela 5) cópia conhecida. A Figura 1 mostra os resultados de uma placa para uma reação que tem como alvo KIR2DL4 e KIR3DS1, bem como o gene de referência STAT6. O número de cópia mais frequente para KIR2DL4, um gene de quadro no locus KIR , é duas cópias, Considerando que o número de cópia mais frequente para KIR3DS1, um gene de activação, é uma cópia. Os resultados na figura mostram as parcelas de amplificação do PCR observadas sobre o software de qPCR e os dados de número de cópia gerados a partir dos dados de qPCR. Como mostrado, o ensaio é capaz de distinguir entre 0, 1, 2, 3 e 4 número de cópias do gene de KIR . O software de análise de número de cópia também permite uma visualização da distribuição do número de cópia através da placa como um gráfico de pizza ou um gráfico de barras. A eficácia da previsão de número de cópia é inferior para amostras com um número maior de cópia.

A qualidade de todos os materiais usados nas reações gDNA, tampão, primers e sondas, pode afetar a precisão dos resultados obtidos. No entanto, a discordância nos resultados é mais provável ser causado devido a variação na concentração de DNA através de uma placa. A pureza do gDNA extraído, o que pode ser medido usando a 260/280 e 260/230 rácios, também pode ter um efeito sobre a qualidade. Um rácio de 260/280 cuja relação 1,8-2 e 260/230 2-2.2 são desejáveis. Um concentrações de intervalo irregular de DNA através de uma placa podem levar a uma alta variabilidade no ciclo de limiar (Ct) entre amostras e discordância no intervalo do número estimado de cópia. Os resultados na Figura 2 mostram o efeito que a disparidade entre os valores det C através de uma placa pode ter sobre a exactidão na predição do número de cópia. A linha vermelha indica o intervalo do número estimado de cópia para uma amostra e, idealmente, deveria ser mais próximo de um número inteiro possível.

Os dados de número de cópia, uma vez analisados, podem ser exportados como um arquivo de planilha em um formato de 96 poços. Usamos um script de R (disponível quando solicitado) para combinar os dados de número de cópia de todos os 10 placas que são executados como um conjunto em uma planilha. Os dados publicados sobre KIRs de populações de origem europeia na maior parte permite a previsão de regras de LD que existem entre os vários genes no complexo KIR 1. Estas previsões são usados para conduzir verificações a jusante na cópia números resultados obtidos (tabela 6). Amostras que não estão em conformidade com o previsto LD entre os genes podem conter incomum polimorfismo ou variações estruturais de haplotypic. Um fluxograma descrevendo o protocolo é mostrado na Figura 3.

Uma ferramenta chamada KIR haplótipo identificador (http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/) foi desenvolvida para facilitar a imputação de haplótipos do conjunto de dados. A imputação funciona com base numa lista de haplótipos de referência observadas em uma população de origem europeia1. No entanto, a ferramenta também permite um conjunto personalizado de haplótipos de referência a ser usado em vez disso. Três arquivos separados são gerados; o primeiro arquivo lista todas as combinações de haplótipo para uma amostra, o segundo arquivo fornece uma lista aparada as combinações de haplótipos que têm as mais altas frequências combinadas, e o terceiro arquivo listas de exemplos que não podem ser atribuídos haplótipos. Non-atribuição de haplótipos poderia ser usado como um indicador de haplótipos de romance.

Figure 1
Figura 1: número de resultados representativos de uma placa para a reação 5. (A), este painel mostra amplificação parcelas. (B), este painel mostra copiar números parcelas. (C), este painel mostra a distribuição do número de cópia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: número de resultados representativos de uma placa com uma concentração variável de DNA pela reação 5. (A), este painel mostra amplificação parcelas. (B), este painel mostra copiar números parcelas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: fluxograma do protocolo qKAT. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Ensaio Genes Primers para a frente Concentração (nM) Primers reversos Concentração (nM) Sondas Concentração (nM)
N º 1 3DP1 A4F 250 A5R 250 P4a 150
2DL 2 2DL2F4 400 C3R2 600 P5B 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
N º 2 2DS2 A4F 400 A6R 400 P4a 200
2DL 3 D1F 400 D1R 400 P9 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
N º 3 3DL 3 A8F 500 A8R 500 P4a 150
2DS4Del 2DS4Del 250 2DS4R2 250 P5B 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
N º 4 3DL1e4 B1F 250 B1R 125 P4b 150
3DL1e9 D4F 250 D4R2 500 P9 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
N º 5 3DS1 B2F 250 B1R 250 P4b 150
2DL 4 C1F 200 C1R 200 P5B - 2DL 4 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
N º 6 2DL 1 B3F 500 B3R 125 P4b 150
2DP1 D3F 250 D3R 500 P9 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
N º 7 2DS1 B4F 500 B4R 250 P4b 150
2DL 5 D2F 500 D2R 500 P9 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
N º 8 2DS3 B5F 250 E55 250 P4b 150
3DL2e9 D4F 250 C55 125 P9 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
N º 9 3DL2e4 A1F 200 A1R 200 P4a 150
2DS4FL 2DS4FL 250 2DS4R2 500 P5B 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
N º 10 2DS5 B6F2 200 B6R3 200 P4b 150
2DS4 C5F 250 C5R 250 P5B 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150

Tabela 1: combinação e concentração de primers e sondas utilizadas em cada reação de qKAT 27 .

Reação Primeira demão alíquotas (µ l) Alíquotas de sonda (µ l)
R1 3DP1 A4F A5R 2DL2F4 C3R2 ÁGUA STAT6F STAT6R P4A P5B PSTAT6
2DL 2 100 100 160 240 200 80 80 60 60 60
R2 2DS2 A2F A6R D1F D1R ÁGUA STAT6F STAT6R P4A P9 PSTAT6
2DL 3 160 160 160 160 160 80 80 80 60 60
Nota: preciso de 20 µ l de menos água no MasterMix
R3 3DL 3 A8F A8FB A8R 2DS4DELF 2DS4R2 ÁGUA STAT6F STAT6R P4A P5B PSTAT6
2DS4DEL 100 100 200 100 100 200 80 80 60 60 60
R4 3DL1E4 B1F B1R D4F D4R2 ÁGUA STAT6F STAT6R P4B P9 PSTAT6
3DL1E9 100 50 100 200 350 80 80 60 60 60
R5 3DS1 B2F B1R C1F C1R ÁGUA STAT6F STAT6R P4B P5B - 2L 4 PSTAT6
2DL 4 100 100 80 80 440 80 80 60 60 60
R6 2DL 1 B3F B3R D3F D3R ÁGUA STAT6F STAT6R P4B P9 PSTAT6
2DP1 200 50 100 200 250 80 80 60 60 60
R7 2DS1 B4F B4R D2F D2R ÁGUA STAT6F STAT6R P4B P9 PSTAT6
2DL 5 200 100 200 200 100 80 80 60 60 60
R8 2DS3 B5F E55 D4F C55 ÁGUA STAT6F STAT6R P4B P9 PSTAT6
3DL2E9 100 100 100 50 450 80 80 60 60 60
R9 3DL2E4 A1F A1R 2DS4WTF 2DS4R2 ÁGUA STAT6F STAT6R P4A P5B PSTAT6
2DS4WT 80 80 100 200 340 80 80 60 60 60
R10 2DS5 B6F2 B6R3 C5F C5R ÁGUA STAT6F STAT6R P4B P5B PSTAT6
2DS4TOTAL 80 80 100 100 440 80 80 60 60 60

Tabela 2: Volumes (µ l) da cartilha de 100 µM/ponta de estocam soluções para fazer a primeira demão e sonda alíquotas de combinação.

Nome Direção modificação de 5´ modificação de 3´ Sequência (5' →3') Comprimento TM % DE GC Exão Posição
P4a Sentido FAM BHQ-1 TCATCCTGC
AATGTTGGT
CAGATGTCA		 27 60 44,4 4 425-451
P4b Antisentido FAM BHQ-1 AACAGAACC
GTAGCATCT
GTAGGTCCC
T		 28 62 50 4 576-603
P5B Sentido ATTO647N BHQ-2 AACATTCCA
GGCCGACT
TTCCTCTG		 25 60 52 5 828-852
P5B - 2DL 4 Sentido ATTO647N BHQ-2 AACATTCCA
GGCCGACT
TCCCTCTG		 25 61 56 5 828-852
P9 Sentido ATTO647N BHQ-2 CCCTTCTCA
GAGGCCCA
AGACACC		 24 60 62,5 9 1246-1269
PSTAT6 ATTO550 BHQ-2 CTGATTCCT
CCATGAGCA
TGCAGCTT		 26 62 50

Tabela 3: lista das sondas utilizadas em qKAT 1, 27. os corantes fluorescentes usados na extremidade 5' das sondas oligo P5b, P5b - 2 DL 4, P9 e PSTAT6 foram modificados para corantes ATTO.

Gene Primeiras demão Direção Sequência (5´-3´) Comprimento TM % DE GC Exão Posição Amplicon (bp) Alelos podem ser desperdiçados.
3DL2e4 A1F Para a frente GCCCCTGCTGAA
ATCAGG		 18 52 61.1 4 399-416 179 3DL 008 * 2, * 021, * 027, * 038.
A1R Inverter CTGCAAGGACAG
GCATCAA		 19 53 52,6 559-577 3DL 2 * 048
3DP1 A4F Para a frente GTCCCCTGGTGA
AATCAGA		 19 49 52,6 4 398-416 112 Nenhum
A5R Inverter GTGAGGCGCAAA
GTGTCA		 18 52 55.6 492-509 Nenhum
2DS2 A2F Para a frente GTCGCCTGGTGA
AATCAGA		 19 49 52,6 4 398-416 111 Nenhum
A6R Inverter TGAGGTGCAAAG
TGTCCTTAT		 21 51 42,9 488-508 Nenhum
3DL 3 A8Fa Para a frente GTGAAATCGGGA
GAGACG		 18 50 55.6 4 406-423 139 Nenhum
A8Fb Para a frente GGTGAAATCAGG
AGAGACG		 19 50 52,6 405-423 3DL 3 * 054, 3DL 3 * 00905.
A8R Inverter AGTTGACCTGGG
AACCCG		 18 51 61.1 526-543 Nenhum
3DL1e4 B1F Para a frente CATCGGTCCCAT
GATGCT		 18 51 55.6 4 549-566 85 3DL 1 * 00505, 3DL 1 * 006, 3DL 1 * 054, 3DL 1 * 086, 3DL 1 * 089
B1R Inverter GGGAGCTGACAA
CTGATAGG		 20 52 55 614-633 3DL 1 * 00502
3DS1 B2F Para a frente CATCGGTTCCAT
GATGCG		 18 51 55.6 4 549-566 85 3DS1 * 047; pode pegar 3DL 1 * 054.
B1R Inverter GGGAGCTGACAA
CTGATAGG		 20 52 55 614-633 Nenhum
2DL 1 B3F Para a frente TTCTCCATCAGT
CGCATGAC		 20 52 50 4 544-563 96 2DL 1 * 020, 2DL 1 * 028
B3R Inverter GTCACTGGGAGC
TGACAC		 18 50 61.1 622-639 2DL 1 * 023, 2DL 1 * 029, 2DL 1 * 030
2DS1 B4F Para a frente TCTCCATCAGTC
GCATGAA		 19 51 47,4 4 545-563 96 2DS1 * 001
B4R Inverter GGTCACTGGGAG
CTGAC		 17 49 64,7 624-640 Nenhum
2DS3 B5F Para a frente CTCCATCGGTCG
CATGAG		 18 53 61.1 4 546-563 96 Nenhum
E55 Inverter GGGTCACTGGGA
GCTGAA		 18 51 61.1 624-641 Nenhum
2DS5 B6F2 Para a frente AGAGAGGGGACG
TTTAACC		 19 50 52,6 4 475-493 173 Nenhum
B6R3 Inverter TCCAGAGGGTCA
CTGGGC		 18 53 66,7 630-647 2DS5 * 003
2DL 4 C1F Para a frente GCAGTGCCCAGC
ATCAAT		 18 52 55.6 5 808-825 83 Nenhum
C1R Inverter CCGAAGCATCTG
TAGGTCT		 19 52 52,6 872-890 2DL 4 * 018, 2DL 4 * 019
2DL 2 2DL2F4 Para a frente GAGGTGGAGGCC
CATGAAT		 19 52 57.9 5 778-796 151 2DL 2 * 009; 782G mudado para r.
C3R2 Inverter TCGAGTTTGACC
ACTCGTAT		 20 51 45 909-928 Nenhum
2DS4 C5F Para a frente TCCCTGCAGTGC
GCAGC		 17 57 70.6 5 803-819 120 Nenhum
C5R Inverter TTGACCACTCGT
AGGGAGC		 19 52 57.9 904-922 2DS4 * 013
2DS4Del 2DS4Del Para a frente CCTTGTCCTGCA
GCTCCAT		 19 54 57.9 5 750-768 203 Nenhum
2DS4R2 Inverter TGACGGAAACAA
GCAGTGGA		 20 53 50 933-952 Nenhum
2DS4FL 2DS4FL Para a frente CCGGAGCTCCTA
TGACATG		 19 53 57.9 5 744-762 209 Nenhum
2DS4R2 Inverter TGACGGAAACAA
GCAGTGGA		 20 53 50 933-952 Nenhum
2DL 3 D1F Para a frente AGACCCTCAGGA
GGTGA		 17 48 58,8 9 1180-1196 156 Nenhum
D1R Inverter CAGGAGACAACT
TTGGATCA		 20 50 45 1316-1335 2DL 3 * 010, 2DL 3 * 017, 2DL 3 * 01801 e 2DL 3 * 01802
2DL 5 D2F Para a frente CACTGCGTTTTC
ACACAGAC		 20 52 50 9 1214-1233 120 2DL5B * 011 e 2DL5B * 020
D2R Inverter GGCAGGAGACAA
TGATCTT		 19 49 47,4 1315-1333 Nenhum
2DP1 D3F Para a frente CCTCAGGAGGTG
ACATACGT		 20 53 55 9 1184-1203 121 Nenhum
D3R Inverter TTGGAAGTTCCG
TGTACACT		 20 50 45 1285-1304 Nenhum
3DL1e9 D4F Para a frente CACAGTTGGATC
ACTGCGT		 19 52 52,6 9 1203-1221 93 3DL 1 * 061, 3DL 1 * 068
D4R2 Inverter CCGTGTACAAGA
TGGTATCTGTA		 23 53 43,5 1273-1295 3DL 1 * 05901, 3DL 1 * 05902, 3DL 1 * 060, 3DL 1 * 061, 3DL 1 * 064, 3DL 1 * 065, 3DL 1 * 094N, 3DL 1 * 098
3DL2e9 D4F Para a frente CACAGTTGGATC
ACTGCGT		 19 52 52,6 9 1203-1221 156 Nenhum
D5R Inverter GACCTGACTGTG
GTGCTCG		 19 54 63,2 1340-1358 Nenhum
STAT6 STAT6F Para a frente CCAGATGCCTAC
CATGGTGC		 20 54 60 129.
STAT6R Inverter CCATCTGCACAG
ACCACTCC		 20 54 60

Tabela 4: sequências dos primers utilizados em qKAT 1, 27.

KIR gene 3DL 3 2DS2 2DL 2 2DL 3 2DP1 2DL 1 3DP1 2DL 4 3DL 1
EX9		 3DL 1
EX9		 3DS1 2DL 5 2DS3 2DS5 2DS1 2DS4
Total		 2DS4
FL		 2DS4
DEL		 3DL 2
EX4		 3DL 2
EX9
Número de cópia mais frequente 2 1 1 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 2 1 1 2 2

Tabela 5: Número de cópia mais frequente para KIR genes comumente observados em amostras de origem europeia.

Regras de desequilíbrio de ligação para qKAT com base em populações europeias Verificação do número de cópia
1 KIR3DL3, KIR3DP1, KIR2DL4 e KIR3DL2 são quadro genes presentes em ambos os haplótipos. KIR3DL3, KIR3DP1, KIR2DL4 e KIR3DL2 = 2
2 KIR2DS2 e KIR2DL2 são em LD uns com os outros 2DS2=2 DL 2
3 KIR2DL2 e KIR2DL3 são alelos de um mesmo gene 2 DL de 2+2 DL 3= 2
4 KIR2DP1 e KIR2DL1 são em LD uns com os outros 2DP1=2 DL 1
5 Exon 4 de KIR3DL1 e KIR3DL2 é igual a exon 9 de KIR3DL1 e KIR3DL2 respectivamente. 3DL1ex4=3DL1ex9 e 3DL2ex4=3DL2ex9
6 KIR3DL1 e KIR3DS1 são alelos 3 DL 1+3DS1= 2
7 KIR2DS3 e KIR2DS5 estão em LD com KIR2DL5 2DS3+2DS5=2 DL 5
8 KIR3DS1 e KIR2DS1 estão em LD 3DS1=2DS1
9 Presença de KIR2DS1 e KIR2DS4Tvirgula é mutuamente exclusiva em um haplótipo 2DS1+2DS4TOTAL= 2
10 KIR2DS4FL e KIR2DS4del são variantes de KIR2DS4TOTAL 2DS4FL+2DS4DEL=2DS4TOTAL

Tabela 6: desequilíbrio de ligação entre KIR os genes comumente observados em populações de origem Europeia podem ser usados para verificar os dados de número de cópia 1,27.

Discussion

Nós descrevemos um método de alta produtividade semi-automatizadas romance, chamado qKAT, que facilita a digitação de número cópia dos genes KIR . O método é uma melhoria sobre os métodos convencionais como SSP-PCR, que são de baixo rendimento e só podem indicar a presença ou ausência destes genes altamente polimórficos.

A precisão dos dados cópia números obtidos é dependente de vários fatores, incluindo a qualidade e uniformidade-concentração de amostras gDNA e a qualidade dos reagentes. A qualidade e a precisão das amostras gDNA através de uma placa são extremamente importantes, uma vez que as variações na concentração do outro lado da placa podem resultar em erros no cálculo do número de cópia. Desde os ensaios foram validados utilizando conjuntos de exemplo de origem europeia, dados de coortes de outras partes do mundo exigem verificações mais minuciosa. Isto é para garantir que instâncias do abandono do alelo ou ligação não-específica da primeira demão/sonda não são mal interpretadas como variação de número de cópia.

Enquanto os ensaios foram projetados e otimizados para rodar como alta produtividade, eles podem ser modificados para executar amostras menos. A métrica de confiança no software de análise do número cópia é afectada quando analisando amostras de menos, mas isso pode ser melhorado se amostras de DNA genômicas controle com um número de cópia de gene conhecido do KIR estão incluídas na placa e repetições de exemplo adicionais são incluído.

Para os laboratórios sem líquido/placa-manipulação de robôs, mistura de mestre pode ser dispensada usando pipetas multicanais e chapas podem ser carregadas manualmente dentro do instrumento qPCR.

O principal objetivo por trás do desenvolvimento de qKAT foi criar um simples, alta produtividade, alta resolução e econômica método genótipo KIRs para doença estudos de associação. Isto foi conseguido com sucesso desde que qKAT tem sido empregado em investigar o papel do KIR em vários estudos de associação grande doença, incluindo uma variedade de doenças infecciosas, doenças auto-imunes e distúrbios de gravidez4, 24 , 25 , 26.

Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

O projeto recebido financiamento do Conselho de pesquisa médica (MRC), o Conselho Europeu de investigação (CEI) sob o programa União Europeia do Horizonte 2020 pesquisa e inovação (grant acordo n. º 695551) e a National Institute of Health (NIH) Cambridge Biomedical Research Centre e sangue de pesquisa de NIH e Transplant Research Unit (NIHR BTRU) na transplantação e na Universidade de Cambridge e em parceria com o sangue de NHS e transplante (NHSBT). As opiniões expressadas são as dos autores e não necessariamente aqueles de NHS, o NIHR, o departamento de saúde ou o NHSBT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Oligonucleotides Sigma Custom order SEQUENCES: Listed in Table 4
Probes labelled with ATTO dyes Sigma Custom order SEQUENCES: Listed in Table 3
SensiFAST Probe No-ROX Kit Bioline BIO-86020 −
MilliQ water − − −
Name Company Catalog Number Comments
EQUIPMENT
Centrifuge with a swinging bucket rotor Eppendorf(or equivalent) Eppendorf 5810R or equivalent system
NanoDrop Thermo Scientific ND-2000
OR
QuBit Fluorometer Life Technologies Q33216
Matrix Hydra Thermo Scientific 109611
LightCycler 480 II Instrument 384-well Roche 05015243001
Twister II Microplate Handler with MéCour Thermal Plate Stacker (MéCour) Caliper Life Sciences 204135
Vortex mixer Biosan BS-010201-AAA
Single-channel pipettes (volume range: 0.5–10 µL, 2–20 µL, 20–200 µL, 200–1,000 µL; 1-10 mL) Gilson(or equivalent) F144801, F123600, F123615, F123602, F161201
RNase- and DNase-free pipette tips filtered (10 µL, 20 µL, 200 µL, 1,000 µL, 10 mL) Starlab (or equivalent) S1111-3810, S1120-1810, S1120-8810, S1111-6810, I1054-0001
StarTub PS Reagent Reservoir, 55 mL STARLAB E2310-1010
50 mL Centrifuge Tube STARLAB E1450-0200
96-well deep well plate Fisher Scientific 12194162
LC480 384 Multi-well plates Roche 04729749001
LightCycler 480 Sealing Foil Roche 04729757001
Name Company Catalog Number Comments
SOFTWARE
Roche LightCycler 480 Software v1.5
Applied Biosystems CopyCaller Software v2.1 https://www.thermofisher.com/uk/en/home/technical-resources/software-downloads/copycaller-software.html
KIR haplotype identifier http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/

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Genética edição 145 Imunogenética receptor de imunoglobulina como de células killer (KIRs) copie o número variação haplótipo Antígeno leucocitário humano (HLA) pilha de assassino natural reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR)
qKAT: quantitativa coeficiente digitação de assassino-célula Genes de receptores de imunoglobulina-como
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Jayaraman, J., Kirgizova, V., Di,… More

Jayaraman, J., Kirgizova, V., Di, D., Johnson, C., Jiang, W., Traherne, J. A. qKAT: Quantitative Semi-automated Typing of Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor Genes. J. Vis. Exp. (145), e58646, doi:10.3791/58646 (2019).

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