이 문서의 목적은 acetylated 히스톤 잔류물의 정량화와 H3 및 H4 히스톤의 효율적인 정화를 종합적이 고 체계적인 가이드를 제공 하는 것입니다.
모든 진 핵 유기 체, 염색 질, 생리 서식 파일의 모든 유전 정보를 유전에 대 한 필수적입니다. Chromatin는 다양 한 posttranslational 수정 (PTMs) 발생 하는 대부분 (즉, 히스톤 꼬리) 히스톤 단백질의 아미노 termini에 기본 DNA의 기능 상태 및 내게 필요한 옵션의 배열. 히스톤 꼬리는 nucleosome의 코어에서 확장 하 고 히스톤 acetyltransferases (모자)에 의해 아 세 틸 그룹의 추가 세포 성장과 분화 시 아 세 틸 그룹 히스톤 deacetylases (HDACs)에 의해 제거 될 수 있습니다. 히스톤 꼬리에 리 (K) 잔류물에 특정 acetylation 패턴 결정 (1) 영향을 미치는 핵심 히스톤 어셈블리에 의해 transcriptionally 활성 또는 transcriptionally 억압 chromatin와 (2) 모집 시너지 사이의 동적 항상성 또는 전사 사이트에 대립 chromatin 관련 단백질. 히스톤 꼬리 PTMs의 복잡 한 자연의 근본적인 규제 메커니즘 셀 성숙에 정상 및 병 적인 모두 개발 차별화 chromatin 템플릿 기반 프로세스와 변경의 대부분을 좌우 한다. 현재 보고서의 목표 세포와 뇌 조직에서 핵심 히스톤 단백질을 순화 하 고 안정적으로 히스톤 H3 및 H4 acetylation 표시를 계량 하는 효율적인 방법으로 초보자를 제공 하는입니다.
기간 epigenetics 변화 DNA 시퀀스1,2에서 독립적으로 발생 하는 유전자 활동에 상속 변화를 말합니다. 유전자 전사와 억압 (1) 염색체 DNA는 octamer 코어 히스톤 단백질 (2 복사 각 H2A, H2B, H3, H4)의 주위에의 접근에 의해와 (2) 녹음 방송 요인의 가용성에 의해 결정 된다 단백질 발판 특정 발기인 사이트3,4를 채용. 유전자 녹음 방송 특정 DNA 발기인 사이트의 수정 효소 중재 및 히스톤 꼬리5,,67의 PTMs에 의해 통제 된다. N-테르미니 히스톤 H3 및 H4 진 핵 유기 체3, 알려진 가장 높은 보존된 시퀀스 중 그리고 posttranslational 수정 chromatin 구조 결정에서 중심 역할을 광범위 하 게 문서화 되었습니다 및 기능8,9. PTMs (즉, acetylation, 메 틸 화, 인 산화, 및 ubiquitination) 히스톤 꼬리에 꼬리의 상호 작용 잠재력을 변경, 구조 상태에 영향을 미칠 및 DNA 접근 통제 접히는 chromatin 섬유의 및 그로 인하여, 그리고4,10,,1112처리. 아 세 틸 그룹에 추가 하 고 특정 상호 작용 하는 히스톤 epigenetic 효소, 즉 모자와 HDACs, 각각13의 집합에 의해 히스톤 꼬리에 K 잔류물에서 제거 됩니다. 예를 들어 (H4K12ac) 리 12에서 H4 히스톤의 acetylation 이전 표시 되었습니다 메모리 수집 및 통합14에 관련 된 유전자의 녹음 방송을 활성화 하. 또한, 여러 줄 증거의 유전자 전사의 효소 중재 후 제어 건강 한 세포 성장과 분화6,15의 중요 한 측면은 것이 좋습니다. 유전자 발현, DNA의 후 성적인 수정 하거나, epigenetic 효소의 돌연변이 의해의 후 성적인 규정에 교대 어디 특정 유전자의 활동에 변화는 각 인은 인간의 질병에 dysregulated로 표시 되었습니다. 병 리 (예를 들어, 암)6,,1617. 따라서, 코어 히스톤 변화의 평가 PTMs 잠재적인 치료 내정간섭에 대 한 높은 가치의 대상으로 떠오르고 있다. 그러나, 풍부를 결정, 상호 작용 파트너 및 히스톤 PTMs의 특정 역할 입증 되었습니다 도전18.
현재 보고서에서 세포와 단일 분수와 히스톤 H3 및 H4 PTMs의 정량화에 대 한 완전 한 프로토콜에서 뇌 조직에서 핵심 히스톤을 정화 하는 최적화 된, 매체 처리량 전략을 설명 합니다. 메모의 현재 산 기반 출판 비록 정화 기술 및 히스톤 항 체 기반 탐지 전략 널리 채택 히스톤 특성화에 대 한, 그들은 따라서 절차의 중요 한 단계에 대해 설명 세부 정보 부족 신속 하 고 복제할 히스톤 추출 및 정량화를 방해. 예를 들어 셀의 처리 추출 하 고 조직 생 검 필요 합니다 다른 도구와 기술을 추출에 대 한. 또한, 현재 원고에 최적화 된 프로토콜에서는 중간 처리량 실용적인 접근 방식을 보여 줍니다. 코어 히스톤 하면 신뢰할 수 있는 다운스트림 항 체 중재 PTM 감지 불순물에서 어떤 간섭 없이 단일, 순수한 부분으로 추출 됩니다. 또한, 현재 원고에 그들의 작은 분자량으로 인해 히스톤 탐지에 관한 과제 피할 되었습니다 있다. 일반적으로, 정화, 정량화, 및 젤 전기 이동 법 프로토콜 간의 호환성 부족 복제할 및 결정적인 결과 얻기에서 과학자를 방해. 여기, 세포와 조직에서 핵심 히스톤을 정화 하 고 다운스트림 PTM 분석을 통해 서쪽 오 점을 위해 그들을 준비 하는 최적화 된 워크플로 제공 됩니다.
현재 프로토콜 (즉, acetylation, 메 틸 화, 및 인 산화) 그들의 네이티브 posttranslational 수정 유지 하면서 코어 히스톤 단백질의 정화 수 있습니다. 그림 1 히스톤 정화 프로토콜의 타임 라인을 보여 줍니다.
현재 작업에서 우리는 코어 히스톤 단백질을 순화 하 고 히스톤 H3 및 H4 PTMs (예를 들어, acetylation)을 계량 하는 최적화 된 방법 시연. 제시 프로토콜은 통합 하는 포괄적인 워크플로 최적화 셀 및 뇌 조직 준비, 원유 히스톤 정화, 그리고 상세한 히스톤 강수량, 차입 및 정량화, 뒤에 관한 절차 히스톤 전기 이동 법 그리고 강력한 히스톤 PTM 정량화입니다. 여기에 제공 된 내용의 다량 히스톤 샘플의 긴 조작에 대 한 필요에도 불구 하 고 높은-품질 데이터의 복제 가능 세대 수 있습니다.
많은 현재 게시 된 프로토콜 히스톤 H3 및 H419의 순수한 분수를 분리 하는 HPLC 사용을 해야 합니다. HPLC는 강력한 기술 이지만, 그 복잡성과 낮은 처리량 대부분의 분자 생물학 및 그것의 빈번한 사용에서 유추 억제. 실제로, HPLC는 많은 실험실을 사용할 수 없습니다 그리고 고도로 숙련 된 인력 악기를 작동 하는 데 필요한. HPLC는 자주 소모, 비싼, 그리고 잠재적으로 위험한. 여기에 제시 된 HPLC 무시는 비슷한 품질의 결과 달성 하는 저렴 한, 중간 처리 전략이 이다. 특수 악기 작업 능력을 필요로 하지 않는 간단한 스핀 열 접근 방식을 사용 하 여 보고 된 전략은 또한 더 실용적이 고 거의 모든 실험실에서 사용 하기에 적합. 또한, 히스톤 H3/H4 tetramer 단일, 순수, 그리고 풍부한 분수, 각 단백질에 보존된 PTMs의 신뢰할 수 있는 정량화 사용으로 추출 됩니다.
PTMs 산화 스트레스와 pH20,21에 변화에 변화에 매우 민감합니다. 따라서, 이전에 게시 방법18, 달리 우리 세포의 최소 변화 소요 보장 혈 청 구성 요소와 네이티브 PTMs의 간섭을 방지 하 고 혈 청 자유로운 미디어에 셀 rinsing의 효율적인 전략을 보고 합니다. 현재 프로토콜 뿐만 아니라 전통적인 핵 격리를 무시 하지만 또한 세포 세포의 용 해 및 핵 집계를 피하 면 서 핵의 보존에 대 한 수 있는 정확한 조직 균질 절차에 대 한 최적의 시간을 제공 합니다. 셀, 셀 형식을 사용, 조직의 크기, 등등의 수에 따라 추출 시간을 조작할 수 있습니다, 비록 확장된 세포 바람직하지 않다로 핵 DNA 자료, 샘플 처리 하기 어려운 하의 lysis로 이어질 수 있습니다. 중요 한 것은, 여러 검문소는 프로토콜 내에서 성공적인 히스톤 정화 (예를 들어, 단계 2.7와 3.2.3)의 유효성 검사에 대 한 존재합니다. 이 전략은 또한 긴 절차를 통해 문제 해결을 지원 합니다.
또 다른 중요 하 고 독특한 제시 프로토콜의 기능은 다운스트림 서쪽 오 점 분석 도구와 다른 사람 그것의 완전 한 호환성 원할 경우. 히스톤 단백질은 ~ 15 kDa13,,2223 에서 검색 되며, 마찬가지로 다른 작은 분자 무게 단백질에 입증 된 표준 immunoblotting 기법에 의해 감지 하는 도전. 최적 해상도 단백질 젤과 함께에서 높은 성능 및 높은 처리량 전송 시스템의 사용 (에 SDS의 부재) 단백질 네이티브 확인 및 SDS 및 높은 전송 효율의 부재에서 활동의 유지 보수에 대 한 허용 따라서 신뢰할 수 있는 히스톤 PTM 정량화를 확보는 낮은 분자량 히스톤 단백질의.
The authors have nothing to disclose.
저자는 플로리다 학과의 건강에 드와 델 Moore 알츠하이머병 연구 프로그램 (보조금 6AZ08 및 7AZ26), NIH NIAAA (그랜트 5R01AA023781-03)와 미국 심장 협회 (그랜트 17PRE33660831) 그들의 감사를 표현 한다.
1.5 mL microcentrifuge tubes | ThermoFiser Scientific | 05-408-129 | or equivalent from other sources |
Sterile water | Gibco | 15-230-204 | or equivalent from other sources |
70% perchloric acid | Sigma Aldrich | 311421 | or equivalent from other sources |
100% acetone | Sigma Aldrich | 270725 | or equivalent from other sources |
pH-indicator strips, non-bleeding | Milliipore Sigma | 1095310001 | |
4x SDS sample buffer | BIO-RAD | 161-0747 | |
Benchtop rotor | Cole-Parmer | UX-04397-34 | or equivalent from other sources |
1.5 mL tube rack | ThermoFiser Scientific | 05-541 | or equivalent from other sources |
Histone purification mini kit | Active Motif | 40026 | spin columns included in the kit |
Protease Inhibitor Cocktail | ThermoFiser Scientific | 78430 | or equivalent from other sources |
Nanodrop instrument | ThermoFiser Scientific | ND-2000 | |
Tissue culture dishes | VWR | 10062-880 | required for histone extraction from cultured cells |
Tissue culute media | varies based on cell line used | varies based on cell line used | required for histone extraction from cultured cells |
Low-serum media | ThermoFiser Scientific | 51985091 | required for histone extraction from cultured cells |
Plastic cell scraper | Falcon | 353086 | required for histone extraction from cultured cells |
SDS-PAGE gradient gel | BIO-RAD | 456-9035 | required for histone extraction from cultured cells |
Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solution | BIO-RAD | 1610436 | required for histone extraction from cultured cells |
Coomassie Brilliant Blue R-250 Destaining Solution | BIO-RAD | 1610438 | required for histone extraction from cultured cells |
Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs | BIO-RAD | 1704156 | required for histone extraction from cultured cells |
Trans-Blot Turbo Transfer System | RIO-RAD | 1704150 | required for histone extraction from cultured cells |
Ponceau S stain | CellSignalling | 59803S | required for histone extraction from cultured cells |
Dounce homogenizer (size/cap sc 7mL) with a small size clearance | Kimble Chase | 885302-0007 | required for histone extraction from tissues |
100% bleach | Clorox | 68973 | required for histone extraction from tissues |
H4K12ac antibody | Active Motif | 39166 | required for PTMs quantification via WB |
H3K27ac antibody | Active Motif | 39134 | required for PTMs quantification via WB |