Summary
פרוטוקול שלב אחר שלב זה מספק תיאור מפורט של הגדרת הניסוי, ניתוח נתונים להערכה של תגובות דלקתיות ב hiPSC-ECs וניתוח של אדהזיה ליקוציט תחת זרימה פיזיולוגיים.
Abstract
תאי אנדותל (ECs) הם חיוניים עבור הרגולציה של תגובות דלקתיות על ידי הגבלת או להקל על גיוס ליקוציט לרקמות המושפעת דרך מפל מאופיין היטב של קולטני פרו-דבק אשר upregulated על ליקוציט תא השטח על ההדק דלקתיות. תגובות דלקתיות שונות בין אנשים באוכלוסייה, הרקע הגנטי יכול לתרום הבדלים אלה. תאי גזע pluripotent המושרה אנושי (hiPSCs) הוכחו להיות מקור אמין של ECs (hiPSC-ECs), ובכך המייצג את מקור מוגבל של תאים ללכוד את הזהות הגנטית ועל כל גרסאות גנטי או מוטציות של התורם. לכן ניתן להשתמש hiPSC-ECs לסימולציה תגובות דלקתיות בתאים תורם ספציפי. תגובות דלקתיות שניתן למדל על-ידי קביעת ליקוציט הדבקה על hiPSC-ECs תחת זרימה פיזיולוגיים. פרוטוקול שלב אחר שלב זה מספק תיאור מפורט של הגדרת הניסוי, ניתוח נתונים להערכה של תגובות דלקתיות ב hiPSC-ECs וניתוח של אדהזיה ליקוציט תחת זרימה פיזיולוגיים.
Introduction
דלקת ממלא תפקיד מרכזי הרבה מצבים פתולוגיים, כולל לב וכלי דם, הפרעות ניווניות, אלח דם, תגובות לוואי (ADRs). תאי אנדותל (ECs) תפקיד חיוני בוויסות תגובות דלקתיות דרך אינדוקציה של רצפטורים פרו-דבק, כגון בחירת שמלות E, המערכת אדהזיה מולקולה-1 (ICAM-1) ותא וסקולרית אדהזיה מולקולה-1 (VCAM-1) על פני השטח שלהם 1 , 2. microvascular ECs ברקמות שונות ידועים להפגין הטרוגניות תגובות דלקתיות3,4. יתר על כן, הרקע הגנטי או מצבים גנטיים מסויימים עלול לגרום של הבדלי תגובות דלקתיות בין יחידים; לכן חשוב יש גישה אל ה-ECs מאנשים שונים. יותר לאחרונה, אנושי pluripotent המושרה בתאי גזע (hiPSCs)5, זה יכול להיות נגזר כמעט כל אדם, הראו להם לשמש כמקור מתחדשת ואמין של ECs6,7,8, 9. לכן, ההערכה של תגובות דלקתיות, ליקוציט גיוס hiPSC-ECs הוא יקר, לא רק עבור מידול של מחלות גנטיות מסוימות, אלא גם כדי לספק אינדיקציות ההשתנות הבין-אישית וכדי להשתמש ככלי רפואה אישית בעתיד.
מבחני זרימה לספק כלי שימושי ללמוד אנדותל-ליקוציט אינטראקציה. ההתקדמות microfluidic התקנים מאפשרים הרבייה של ותנאים של זרימת נוזל פיזיולוגי עם שליטה מדויקת של כלי הדם המיטה-ספציפיות גזירה רמות. הדמיה חיה מאפשרת ניטור של המפל של אירועים ליקוציט לכידת, גלגול, זחילה, אדהזיה, גלגול. פותחו מספר מבחני זרימה ללמוד אנדותל-ליקוציט אינטראקציה, עם זאת, כולם לנצל העיקרי ECs10,11,12,13. כאן נתאר בפירוט וזמינותו להערכה של לויקוציטים אנושיים הדבקה על hiPSC-ECs תחת זרימה פיזיולוגיים. בהליך זה, אנו מתארים תנאים אופטימליים של hiPSC-EC גירוי עם גירויים הפרו דלקתי, כגון גידול נקרוזה מקדם אלפא (TNFα), דיסוציאציה, זריעה לשבב microfluidic עם שמונה ערוצים מקבילים. לתאר את פרוטוקול צעד אחר צעד עבור זלוף של hiPSC-ECs עם ההשעיה של לויקוציטים fluorescently שכותרתו באסימוני microfluidic, חיים תא הדמיה, אוטומטית ספירה של לויקוציטים חסיד.
פרוטוקול זה שימושי להערכת תגובות דלקתיות ב hiPSC-ECs והתרופות הקרנה, מידול המחלה, רפואה רגנרטיבית אישית.
Protocol
1. הכנת פתרונות, ריאגנטים
- להכין בינוני Endothelial אנושי-SFM מלאה (EC-SFM מלאות) על-ידי הוספת סרום פלזמה, נגזר טסית דם-עני (1%), בסיסי פיברובלסט גורם גידול (bFGF, 20 ng/mL), כלי הדם צמיחה אנדותל (VEGF, 50 ng/mL) כדי האנושי Endothelial-SFM (ראה טבלה של חומרים). לסנן את המדיום דרך מסנן נקבובית מיקרומטר 0.22 ואחסן אותו ב 4 ° C עד 2 שבועות.
- להכין בינוני RPMI מלאה על-ידי הוספת סרום שור עוברית (10%), מרקפטואתנול (0.05 nM),-גלוטמין (1%), פניצילין-סטרפטומיצין (25 U/mL) לבינונית RPMI (ראה טבלה של חומרים). לאחסן ב 4 ° C עד 3 שבועות.
2. ציפוי של Microfluidic צ'יפס
- המקום ביו-שבב סטרילי לתוך צלחת פטרי 10 ס מ סטרילי.
- הכן fibronectin הפתרון עובד על ידי לשחזר את הפתרון מניות ב באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) ללא Ca2 +/Mg2 + כדי ריכוז סופי של 50 µg/mL. מעריכים µL 80 של הפתרון עובד לכל ביו-שבב.
- מזריקים µL 10 של הפתרון עובד fibronectin לתוך כל אחד מהערוצים ביו-שבב. השתמש פיפטה עם טיפים קטנים µL 10 וודא כי ליצור איש קשר הדוק בין הים ערוץ הטיפ פיפטה (איור 1C, משמאל).
- סגור את המכסה של הפטרי המכיל את ביו-שבב ומניחים אותו בתוך תא humidified (איור 2B). חנות התא ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. ללחלוח התא, מקום נקי של ממחטת נייר בתחתית תא humidified, הוסף 5 מ של סטרילי H2O.
- למחרת, לפני וזמינותו, לחמם את ביו-שבב ב 37 מעלות צלזיוס בחממה.
3. הכנת hiPSC-ECs
הערה: בפרוטוקול המתוארים כאן, hiPSC-ECs הבדיל, טיהור, cryopreserved, הקרת כפי שתואר לעיל8.
- הפשרה וצלחת hiPSC-ECs ב מלאה EC-SFM מלא לתוך אחד 0.1% מצופי ג'לטין T75 הבקבוק, שלושה-ארבעה ימים לפני וזמינותו.
- בלילה לפני וזמינותו, לעורר hiPSC-ECs עם TNFα על-ידי הוספת EC-SFM מלא בתוספת 10 ננוגרם למ"ל TNFα, דגירה לילה (~ 12 h) ב 37 מעלות צלזיוס, כפי שתואר לעיל 7.
4. hiPSC-ECs דיסוציאציה, זריעת לתוך השבב Microfluidic
- ביום של וזמינותו, לקחת את הבקבוק של hiPSC-ECs מן החממה ולבחון את התאים במיקרוסקופ. ודא כי hiPSC-ECs 80 – 100% confluent, יש מורפולוגיה EC דמוי טיפוסי.
- להעביר את הבקבוקון וחטף התרבות תאים.
- האחות האמצעי הבקבוק של hiPSC-ECs.
- בקצרה לשטוף את התרבות התא על-ידי הוספת 10 מ"ל של PBS ללא Ca2 +/Mg2 +. מחוק לגמרי מגניב.
- להוסיף 4 מ"ל לכל הבקבוקון של האנזים דיסוציאציה 1 x. תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT) (איור 1B).
- לעצור את התגובה דיסוציאציה על-ידי הוספת 8 מ ל Endothelial אנושי-SFM בינוני לכל את הבקבוק. בעדינות לנתק ולאסוף את המתלה hiPSC-ECs 15 מ"ל צינור חרוטי באמצעות פיפטה 5 מ.
- לספור את המספר הכולל של תאי ההשעיה.
- Centrifuge התאים ב x 300 גרם במשך 3 דקות ב- RT.
- וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend בגדר תא ב- EC-SFM מלא כדי ריכוז סופי של 1.5 x 107 תאים למ"ל.
- להוציא את צלחת פטרי עם ביו-שבב של החממה, להעביר אותו למכסה התרבות תאים.
- האחות הפתרון fibronectin של כל הערוצים של שבב microfluidic.
- מזריקים µL 6 של התליה תא לתוך אחד מהערוצים באמצעות פיפטה עם טיפ קטן µL 10 (איור 1C, התיכון). ודא כי התליה תא מעורבב היטב לפני הזריקה ולהימנע תא משקעים.
- לבחון את ביו-שבב מתחת למיקרוסקופ ולהבטיח כי התאים מפוזרים בצורה אחידה, צפיפות התאים היא גבוהה (איור 2C).
- דגירה של ביו-שבב למשך 15 דקות ב 37 º C.
- הוסף µL 40 של EC-SFM מלא לתוך המאגרים בינוני משני הצדדים של כל ערוץ.
- דגירה של ביו-שבב עבור h 1 ° 37 C (איור 1C, נכון).
- להוסיף עוד 50 µL של EC-SFM מלא לתוך המאגרים משני הצדדים של כל ערוץ.
5. הכנת לויקוציטים אנושיים
הערה: פרוטוקול המתוארים כאן, שימשה קו תא monocytic זמינים מסחרית (THP-1). לחלופין, ניתן להשתמש תאי תאי דם היקפיים או נויטרופילים. בידוד של דם היקפיים ומונוציטים ו נויטרופילים יכול להתבצע באמצעות הליך סטנדרטי11. בצע את כל השלבים המתוארים בפסקה זו בשכונה התרבות תאים.
- איסוף על לויקוציטים צינור חרוטי 50 מ.
- לשטוף את לויקוציטים עם 10 מ"ל של PBS ללא Ca2 +/Mg2 +. Centrifuge התאים ב x 300 גרם במשך 3 דקות ב RT (איור 1D).
- וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend בגדר תא ב 1 מ"ל של PBS עם DiOC6 צבע (λex = 485 ננומטר, λem = 501 ננומטר) (1:5, 000). דגירה התאים בחושך למשך 10 דקות ב- RT.
- לשטוף את לויקוציטים עם 10 מ"ל של PBS ללא Ca2 +/Mg2 +. Centrifuge התאים ב x 300 גרם במשך 3 דקות ב RT. חזור על השלב כביסה עוד פעם אחת.
- לספור את המספר הכולל של תאי ההשעיה.
- וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend בגדר תא בינוני RPMI מלאה כדי ריכוז סופי של 2.5 x 106 תאים למ"ל.
6. הכנת המשאבה Microfluidic
- להרכיב את המשאבה microfluidic עם יריעה ערוץ 8.
- לחבר את המשאבה מחשב עם התוכנה ההפעלה המותקנת.
- להפעיל את התוכנה microfluidic, לטעון את הפרוטוקול על ידי לחיצה על פרוטוקול פתוח ונווט במחשב כדי לבחור את הפרוטוקול microfluidic.
- מחברים את התוכנה המשאבה על-ידי בחירת תיקיית ההתקנה ולחיצה לרוץ צעד וזמינותו.
- להגדיר את הגיאומטריה של הערוצים עבור הפקד קצב זרימה נכונה: בחר עדכון הגיאומטריה בתיקיית ההתקנה הגיאומטריה ולחץ להפעיל שלב וזמינותו.
הערה: ודא הפרטים הגיאומטריה תואמים את המזרק ואת ערוצי כדי לשמש (גאומטריה מזהה = 1, מספר ערוצים = 8, רוחב הערוץ = מיקרומטר 800.0, ערוץ עומק = מיקרומטר 120.0, מזרק נפח = 250 µL), צמיגות של המדגם (צמיגות הנוזל = 1.0). - לשטוף את המשאבה על-ידי הצבת את כניסת כבל (כתום) לתוך הצינור חרוט 50 מ ל המכילה 80% אתנול. מקם את הכבל לשקע (ירוק) בצינור 50 מ ל חרוט ריק (פח אשפה).
- בחר את התיקיה שטיפה/משאבה שטיפה ולחץ על הפעל שלב Assay (לשטוף נפח = 2000 µL, שטיפת נפח שלב = 250 µL, כיוון שטיפה = פלט). חזור על השלב כביסה פעם נוספת.
- חזור על המשאבה שטיפת מדרגות (שלבים 6.6 – 6.7) עם תא תרבות כיתה ומים Endothelial אנושי-SFM תרבות בינוני.
- המשך לשלב הכביסה של יריעה.
- באופן ידני לפתוח את השסתום בין המזרק את סעפת על-ידי הצבת המתאם 3-way אל המיקום הנכון (מחוון OFF מופעל משמאל).
- בחר ערכת זרם ערוץ/פתיחה שלב בתיקיה שטיפה/יריעה לשטוף ' ולחץ על ' לרוץ צעד Assay לפתוח שסתומים של יריעה '.
- לשטוף את יריעה באופן ידני על ידי דחיפת 5 מ ל 80% אתנול מן המזרק, ואחריו 5 מיליליטר מים כיתה של התרבות תאים.
- לשטוף את יריעה על ידי דחיפת 5 מיליליטר Endothelial אנושי-SFM תרבות בינוני של המזרק.
- להסיר את כל הבועות אוויר גדולים כי הם לכודים בתוך יריעה. כדי לעשות זאת, למקם את מתאם ה pin 8-ובכן 10 ס צלחת פטרי עם המדיום ולבצע דוחפים/משיכת עם המזרק עד כל בועות אוויר גדולים נעלמו (בועות קטנות אינם בעיה).
- בחר ערכת זרם ערוץ/סגור שלב בתיקיה שטיפה/יריעה לשטוף ' ולחץ על ' לרוץ צעד Assay לסגור כל השסתומים של יריעה '.
- חבר את הכבל לשקע ירוק מהמשאבה על המתאם סעפת.
- להחליף את השסתום 3-דרך חזרה למצב כבוי כדי לסגור את המזרק.
- בחר תיקיה שטיפה/כבלים שטיפה ולחץ לרוץ צעד Assay לשטוף כל יציאה RPMI בינונית בנפרד, ולהבטיח כי כל הבועות יוסרו כל כבל (לוותר על נפח = 100 µL).
הערה: כל שסתום של סעפת נפתח אחד--אחד, 1 עד 8, ו- 100 μL של המדיום הוא בגליל דרך אחד מהערוצים בודדים תוך שמירה על הערוצים האחרים סגור. ודא כי הנוזל מקשר בין כל סיכה. אם אין נוזל יוצא החוצה, זה מעיד על בועת אוויר או להדביק.
7. הכנת השבב Microfluidic עבור Live הדמיה
- ודא הכיוונונים microfluidic מוכנים, ו תא הדמיה חיה מראש equilibrated ל- 37 ° C רמת CO2 מגיע ל- 5% (איור 3 א, ב').
- קח את ביו-שבב מן החממה ומקם אותה במיקרוסקופ בעל שבב. הר בעל שבב על המיקרוסקופ הדמיה הבמה (איור 3C).
- כדי להתחבר ביו-שבב את המשאבה דרך סעפת, למקם את המתאם 8 פינים קרוב לשקע המאגרים של השבב, להעמיק את כל הפינים במדיום (אך אל תחבר לחלוטין).
- בחר הכשלון | להתחבר שבב תיקיה ולחץ לרוץ צעד Assay כדי לוותר על RPMI בינוני לפני חיבור השבב (לוותר על נפח = 30 מ ל). ברגע המדיום הוא בגליל, הכנס המתאם 8 פינים בשקע של ביו-שבב.
הערה: במהלך שלב זה, כל הערוצים מוגדרים כך על (פתוח) 30 µL של המדיום הוא בגליל דרך כל ערוץ ו בעקבות זאת הערוצים מוגדרות Off (סגור). פעולה זו מבטיחה כי אין אוויר בועות יוכנסו לתוך הערוצים של שבב microfluidic. - בוער המדיום כל כניסת ממאגרים של ביו-שבב עם פיפטה.
- בחר הכשלון | צ'יפ הכשלון תיקיה ולחץ לרוץ צעד Assay perfuse 40 מיליליטר בינוני מלא EC-SFM דרך כל הערוצים אחד--אחד כדי להיפטר התאים מתים/פסולת מן התעלה (שטיפה נפח = 40 µL, מקסימום שטיפה הטיה = 40 dynes/cm2).
8. זרימה אדהזיה Assay התמונה רכישה
- בוער המדיום מן המאגר כניסת של הערוץ מעניין בעזרת פיפטה.
- להוסיף 100 µL של לויקוציטים 5.6 צעד אל המאגר כניסת של הערוץ עניין.
הערה: מערבבים בעדינות את התאים לבצע השעיה תא בודד. - ב וזמינותו תא | תיאור שלב תיקיה, בחר תיאור ערכת זרם ערוץ/שלב , ברשימה של ערוצים, בחר רק את הערוץ הנוכחי של עניין, מוגדר על (פתוח) ולהגדיר כל הערוצים שבעה אחרים מחוץ (סגור).
- בחר וזמינותו תא | תיאור שלב תיקיה ולחץ לרוץ צעד וזמינותו.
הערה: ודא כי משתנה Flow Rate Dispensing חל לחץ שלילי קבוע למשוך את המתלים ליקוציט מן המאגר כניסת דרך הערוץ במשך 5 דקות (הטיה סט = קבוע, גזירה = דיין -0.5/cm2, משך = 05: 00:00, סרוק עיכוב = 00:00:00). ערך שלילי של גזירה מבטיחה הכיוון הנכון של הזרם. - האחות של לויקוציטים שנותרו מן המאגר מפרץ צר.
- להוסיף 100 µL בינוני RPMI מלאה למאגר כניסת המים. בחר תיקיה תיאור תא Assay/שלב ולחץ לרוץ צעד Assay כדי perfuse את ערוץ 5 דקות RPMI בינונית כדי לשטוף את כל שאינו דוגל לויקוציטים (הטיה סט = קבוע, גזירה = דיין -0.5/cm2, משך זמן = 00: 05:00, סריקה עיכוב = 00:00:00).
- לרכוש תמונות לפחות שלוש עד ארבע עמדות שונות של הערוץ לשיקוף של לויקוציטים מודבקת (כדי להבטיח כי אזורים נציג נלכדים).
- חזור על שלבים 8.1-8.7 להערכה תפקודית של כל שאר הערוצים.
הערה: זה אפשרי להפעיל ערוצים מרובים בו-זמנית. לשם כך, פתח כל ערוצי עניין במהלך 8.3 שלב. ולבצע כל השלבים הנ ל 8.4 –8.7 עבור ערוצים מרובים של עניין.
9. השלמת וזמינותו, ניקוי המשאבה Microfluidic
- לאחר סיום הניסוי, לייצא ולשמור כל תמונות בתבנית RAW.
- בעת שמירת התוצאות, להפעיל את המשאבה microfluidic את סעפת ניקוי פרוטוקול.
- המשאבה microfluidic, ראשית הפעל את התיקיה שטיפה/משאבה שטיפה מאת פרפוזיה 4 מיליליטר מים כיתה תרבות תא, ואחריו 4 מ ל 80% אתנול כמתואר בצעדים 6.6 – 6.7 לייבש את המשאבה על-ידי הפעלת האוויר למשך מספר דקות.
- כדי לנקות את סעפת, הפעל את שלב שטיפה/יריעה לשטוף עם המזרק. בצע את השלבים לפתיחת המזרק ושסתומים סעפת כמו שמתואר צעדים 6.10-6.11 לשטוף תחילה עם 80% אתנול הבא עם תא תרבות כיתה מים. יבש את יריעה על ידי דחיפת אויר דרך המזרק. סגור את השסתום מזרק ושסתומים סעפת כמתואר ב- 6.10 שלבים ו- 6.15.
10. סופר של לויקוציטים חסיד
- הורד והתקן את התמונה עיבוד תוכנה14 מ http://cellprofiler.org.
הערה: עיבוד במחקר זה תמונה בוצעה באמצעות תוכנה גירסה 2.1.1. אם משתמש גירסה חדשה יותר, הצינור עשוי לדרוש התאמה משנית. - הורד את הצינור Count_leukocytes.cpipe. לחץ על קובץ | ייבוא | צינור מתוך הקובץ ונווט במחשב כדי לבחור את הצינור Count_leukocytes.cpipe.
- גרור-ושחרר תיקיה עם תמונות RAW הנרכש של לויקוציטים חסיד אל חלון רשימת הקבצים במודולים קלט | תמונות סעיף לניתוח.
- לציין את גודל טיפוסי של לויקוציטים באמצעות מודולים ניתוח | IdentifyPrimaryObjects. לציין את קוטר מינימלי, מקסימלי של לויקוציטים חסיד בפיקסלים.
- בחר את הקריטריונים הסינון באמצעות מודולים ניתוח | FilterObjects. לציין את האזור מקובל מינימלית של אובייקטים בפיקסלים.
- להתחיל את הניתוח על-ידי לחיצה על כפתור ניתוח תמונות .
הערה: כל התמונות RAW יעובדו, התוצאות יישמרו בתיקיית ברירת מחדל פלט. קובץ הפלט Image.txt מכיל את המספרים של לויקוציטים חסיד של כל תמונה מעובד (כל מספר המתאים תמונה אחת, קרי, כל תצוגה של שדה הנרכש).
Representative Results
ראשית, התגובה של hiPSC-ECs הגירוי עם פרו דלקתיים סוכן TNFα צריך להיבדק, תיאר כאמור7. טיפול TNFα 12 h מפעיל קולטנים upregulation של E-בחירת שמלות עם הפסגה ב 6 שעות לאחר התחלת הטיפול. בנוסף, ICAM-1 הוא upregulated 6-12 h שלאחר הטיפול. למרות שלא נתבונן על קולטנים upregulation הצפויה של VCAM-1, הוא ציין בדרך כלל בתאי האנדותל העיקרי הוא יפתור, (HUVECs). מצאנו לילה (12 שעות) TNFα הטיפול להיות הנוחה ביותר עבור אדהזיה ליקוציט וזמינותו.
HiPSC אופטימלית-ECs דיסוציאציה צריך לגרום השעיה תא בודד ללא גושים התא. איור 2C ממחיש את צפיפות מיטבית hiPSC-EC מיד לאחר ההזרקה. בדרך כלל, 15 דקות לאחר ההזרקה, hiPSC-ECs לצרף לתחתית הערוץ ומתחילים להתפשט (איור דו-ממדי). 1 h לאחר ההזרקה, hiPSC-ECs טופס של טפט היטב להפיץ לאורך הערוץ, יהיה מוכן להתחיל וזמינותו זרימה (2E איור).
תיוג של לויקוציטים עם מעקב פלורסנט מועיל לשלב תמונות חדות אוטומטית תמונה כמת, כמו זה מקל את השלב של זיהוי תא, במיוחד כי לויקוציטים לדבוק טפט של ECs, לעתים קרובות קשה לתוכנה להבחין בין סוגי תאים שונים.
בתוכנת עיבוד תמונה חופשית של קוד פתוח הוא מאוד שימושי עבור כימות אוטומטיות של לויקוציטים חסיד. הצינור שמתואר כאן הפרוטוקול מבוסס על זיהוי אובייקט ראשיים באמצעות קביעת סף מסתגלת של פלורסנט תמונות של לויקוציטים (איור 4A). סינון של לזהות אובייקטים בהתבסס על שטח מינימלי בנוסף שמסנן אובייקטים מזוהים באופן כוזב, כגון שאריות תאים, autofluorescence או אחרים שאינם ספציפיים פלורסנט קליטה (איור 4 C, D).
שבב אחד microfluidic עם שמונה ערוצים במקביל מאפשרת ההשוואה של שתי קבוצות עצמאית, למשל, ה-ECs תריז hiPSCs עצמאיים, כגון תורמים בריאים או חולים עם הפרעות גנטיות. בקרות נוספות, כגון ECs אינו מטופל, או טיפול קדם עם נוגדן חסימה ICAM-1 יכול להיות כלול כמו טוב10,11. 2-3 microfluidic צ'יפס יעובד בכל פעם. החוסן של המסקנות, מומלץ מינימום של 3 ניסויים ביולוגיים עצמאית המבוצעת בימים עצמאית.
איור 1 : הכנה של hiPSC-ECs, לויקוציטים וזמינותו זרימה. (א) טיפול טרום hiPSC-ECs עם הגירוי הפרו דלקתיים (TNFα). (B) ייצוג סכמטי של דיסוציאציה אנזימטי hiPSC-ECs צנטריפוגה, resuspension. (ג) ייצוג סכמטי של ציפוי של הערוצים (ג, שמאלה), הזרקה של המתלה hiPSC-EC (C, התיכון) ותא בינוני התרבות תוספת לאחר hiPSC-ECs מצורף בתוך השבב microfluidic. (ד) ייצוג סכמטי של השלב כביסה ליקוציט, תיוג הפלורסנט DiOC6, resuspension. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : Microfluidic שבב עם hiPSC-ECs. (א) Microfluidic םרות 10 ס מ פטרי. (B) תא humidified לשימוש הדגירה. (C, D, E) להחליפן בתמונות של hiPSC-ECs ב microfluidic ערוץ 0 דקות (C), 15 דקות (D), 1 h (E) לאחר ההזרקה. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : הגדרת הניסוי של תא חי הדמיה ולבנות זלוף וזמינותו. (A, B) ייצוג תמונה (א) ומפרטים טכניים (ב) של ההתקנה ניסיוני של תא חי הדמיה וזרימה וזמינותו: (1) - מיקרוסקופ פלורסנט הפוכה עם הנטען בשידור חי הדמיה קאמרית (5% CO2, 37 ° C, humidified), (2) - microfluidic משאבה, (3) - ערוץ 8 מניפולד, מחשב - PC עבור מיקרוסקופ רכישת שליטה ותמונה, (5) - (4) עבור בקרת משאבת microfluidic. (ג) Microfluidic שבב עם הצנרת המוסף של יריעה ערוץ 8 קבוע בעל לוחית והוקמה בשלב ממונע של המיקרוסקופ. (ד) ייצוג סכמטי של הצעדים העיקריים של זרימה וזמינותו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : תמונה ניתוח וזיהוי אוטומטיים של לויקוציטים חסיד. (א) חלון הדו-שיח של התמונה עיבוד תוכנה עם ההגדרות שצוינו עבור זיהוי לויקוציטים. (B) חלון הדו-שיח של תוכנת עיבוד תמונה עם סינון שצוין קריטריונים של האובייקטים מזוהה בהתבסס על מינימלית קיבל שטח (SAmin = 70 px). (ג) דוגמה וסינון של אובייקטים שאינם ספציפיים של קטן שטח הפנים (SA) של זיהוי נכון של לויקוציטים (בקוטר טיפוסי של פיקסל (Min, Max) = (9, 15); סינון קריטריונים SAmin = 70 px). אובייקטים מקובל מתוארים בצבע ירוק, אובייקטים שנמחקו מתוארים בסגול. (ד) דוגמא זיהוי שגוי של לויקוציטים עקב מגוון קוטר טיפוסי שגוי (בקוטר טיפוסי של פיקסל (Min, Max) = (3, 15); סינון קריטריונים SAmin = 70 px). אובייקטים מקובל מתוארים בצבע ירוק, אובייקטים שנמחקו מתוארים בסגול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Discussion
פרוטוקול זה מתאר את האפיון של טיפול hiPSC-EC עם גירויים הפרו דלקתי, כגון TNFα, הערכה תפקודית של ליקוציט הדבקה על hiPSC-ECs ב וזמינותו זרימה באמצעות הדמיה חיה וספירת אוטומטיות של לויקוציטים חסיד.
גירוי לילה של hiPSC-ECs עם TNFα התוצאה מראה מוארך שמציין בדרך כלל של פנוטיפ הפרו דלקתיים מופעל ב- ECs. במהלך שלב אופטימיזציה, ביטוי רמות של E-בחירת שמלות, ICAM-1, VCAM-1 צריך להיות אומתו FACs7,8, ו העיקרי הוא יפתור ECs (HUVECs) הם רצוי לכלול כפקדי חיובי.
HiPSC אופטימלית-ECs דיסוציאציה, זריעה צפיפות צריך להגיע כדי להשיג של טפט confluent מבלי המתוח תא ולתקשר כפכפים. . זה קריטי להשעות מחדש לויקוציטים בדיוק לפני זלוף על מנת להימנע תא משקעים, לשמור על ריכוז קבוע בעת assaying כל ערוץ לויקוציטים אנושיים דם היקפיים, ומונוציטים ו נויטרופילים יכול לשמש, או הקימו שורות תאים monocytic, כגון THP-1 או HL-60 יכול לשמש כחלופה.
במהלך ההרכבה של ההתקנה microfluidic ובמהלך וזמינותו זרימה, חיוני כדי למנוע בועות אוויר מלהיות לכוד אבובים microfluidic ואת ערוצי כפי שהם יכולים לגרום הניתוק של hiPSC-ECs ו/או לויקוציטים חסיד. נוזל-כדי-נוזל ממשק או התאגדות של השלבים כביסה נוספים במהלך ההכנות של ההתקנה microfluidic יכול לעזור למנוע בועות אוויר.
רצוי כי הפרוטוקול מנוהלת על ידי שני אופרטורים שבו אחד מכין את התאים, השני מכין microfluidic מערכת וזרימה וזמינותו. פעולה זו מבטיחה כי ECs הם מצופים לתוך microfluidic צ'יפס בתוך חלון זמן קבוע לפני עיבוד, משפר את הדיוק ואת הפארמצבטית של התוצאות. בנוסף, זה גם מאפשר הגדרת ניסויים עיוור למנוע הטיה בתוצאות.
לצורך זיהוי תאים מוצלח עם תמונה אוטומטי עיבוד צינור, חשוב לרכוש תמונות בפוקוס עם יחס אות לרעש גבוה וכדי להימנע autofluorescence של אובייקטים שאינם ספציפיים, כגון תא גושים. חשיבות מכרעת הוא המפרט הנכון של גבולות מינימלי, מקסימלי של גודל טיפוסי של לויקוציטים חסיד צריך להיות מזוהה. אחד יכולים להעריך את גודל טיפוסי של לויקוציטים באמצעות כלי מדידה קו ב ImageJ. לדוגמא, בניתוח שלנו, השתמשנו את טווח הפיקסלים 9 – 15 התואם לגודל הפיזי של 10.3-17.1 מיקרומטר (איור 4C). בעת שימוש מגוון הלא נכון, למשל, 3-15 פיקסלים (3.4-17.1 מיקרומטר), ליקוציט יחיד מזוהה לא כתא אחד, אבל מעדיף שלה שביצעת מזוהים כאובייקטים נפרדים (איור 4D). זה מוביל מספר האובייקטים שווא להיות מזוהה.
אובייקטים רבים בעוצמה נמוכה קטנים של פני השטח באזור מאשר לויקוציטים ייתכן יזוהו באמצעות השיטה בתנאי סף מסתגלת. . זה עלול לקחת עקב autofluorescence או כל אחרים שאינם ספציפיים אותות פלואורסצנט. עם זאת, אובייקטים שאינם ספציפיים אלה, אם אזור שלהם הוא נמוך יותר מאשר אזור טיפוסי ליקוציט יחיד, ניתן לסנן על-ידי הגדרת את המקובל מינימלית פני השטח (איור 4C).
וזמינותו זרימה המתוארים כאן מאפשר הערכה ישירה של ליקוציט הדבקה על חד-שכבתי EC, שחקרתי את האינטראקציה של תאים אלה שני סוגי, אבל לא לוקח בחשבון תא יקליד, כגון pericytes, כי הם מציגים בדופן כלי דם ויתכן גם משתתפים בוויסות ליקוציט extravasation15. שילוב של microenvironment תרבות 3D עם סוגי תאים אחרים יכולה לשפר את הרלוונטיות פיזיולוגיות של המערכת. למרות מגבלות אלו, וזמינותו זרימה להערכה של תגובות דלקתיות המתוארים כאן מספק כלי רב ערך עבור אפיון ראשוני ומחלות למודלים נומריים של hiPSC-ECs.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים רוצה להכיר המענקים הבאים: המועצה האירופית למחקר (ERCAdG 323182 STEMCARDIOVASC); הולנד איברים על שבב יוזמה, פרוייקט בתחרות הכבידה ממומן על ידי משרד החינוך, התרבות והמדע של ממשלת הולנד (024.003.001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vena8 Endothelial+ biochip | Cellix Ltd | V8EP-800-120-02P10 | |
| Mirus Evo Nanopump | Cellix Ltd | MIRUS-EVO-PUMP | 1 x syringe pump; 1 x VenaFluxAssay Software; 1 x tubing kit; power supply and cables. |
| 8-channel manifold MultiFlow8 | Cellix Ltd | MIRUS-MULTIFLOW8 | |
| Humidified box | Cellix Ltd | HUMID-BOX | |
| Fluorescence imaging system Leica AF6000 | Leica Microsystems | ||
| Electron-multiplying charge-coupled device camera | Hamamatsu | C9100 | |
| Biological safety cabinet/laminar flow-hood | Cleanair | ||
| CO2 cell-culture incubator | Panasonic | MCO-170AICUV | |
| Centrifuge | Hitachi | himac-CT6EL | |
| Handheld pipetman (P-10 (10 mL), P-200 (200 µL), P-1000 (1,000 µL) | Gilson international | 4807 (10µl), 4810 (200µl), 4809 (1000µl) | |
| Sterile plastic pipette | Greiner Bio-One | 606180 (5ml), 607180 (10ml) | |
| Petri dish | VWR/ Duran Group | 391-0860 | |
| Culture flasks (75 cm2) | CELLSTAR | 658,170 | |
| Centrifuge tube (15 mL) | CELLSTAR | 188271 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin from porcine skin, type A | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Fibronectin (Bovine plasma) | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190-169 | |
| Human Endothelial-SFM | Life Technologies | 11111-044 | |
| Human VEGF 165 IS, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-109-386 | |
| Human FGF-2, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-093-842 | |
| Platelet-poor Plasma Derived Serum, bovine | Biomedical Technologies | BT-214 | |
| Recombinant Human TNF-α | Tebu-bio | 300-01A-A | |
| TrypLE Select | Life Technologies | 12563029 | |
| DiOC6(3) | Sigma-Aldrich | 318426 | |
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 21875-034 | |
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Life Technologies | 31350010 | |
| FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-024 | |
| Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) | Life Technologies | 15070-063 | |
| Distilled water | Life Technologies | 15230-089 | |
| Ethanol absolute | Merck | 1.00983.2500 | |
| VCAM-1 | R&D systems | FAB5649P | |
| E-Selectin | R&D systems | BBA21 | |
| ICAM-1 | R&D systems | BBA20 | |
| Name | Company | Software version | Comments |
| Cellrofiler | CellProfiler | 2.1.1 | |
| VenaFluxAssay Software | Cellix Ltd | 2.3.a |
References
- Vestweber, D. How leukocytes cross the vascular endothelium. Nature Reviews Immunology. 15 (11), 692-704 (2015).
- Hajishengallis, G., Chavakis, T. Endogenous modulators of inflammatory cell recruitment. Trends in Immunology. 34 (1), 1-6 (2013).
- Molema, G. Heterogeneity in endothelial responsiveness to cytokines, molecular causes, and pharmacological consequences. Seminars in thrombosis and hemostasis. 36 (3), 246-264 (2010).
- Aird, W. C.
- Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 1-16 (2016).
- Lin, Y., Gil, C. H., Yoder, M. C. Differentiation, Evaluation, and Application of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Endothelial Cells. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (11), 2014-2025 (2017).
- Halaidych, O. V., Freund, C., et al. Inflammatory Responses and Barrier Function of Endothelial Cells Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. , (2018).
- Orlova, V. V., vanden Hil, F. E., Petrus-Reurer, S., Drabsch, Y., ten Dijke, P., Mummery, C. L. Generation, expansion and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (6), 1514-1531 (2014).
- Orlova, V. V., Drabsch, Y., et al. Functionality of endothelial cells and pericytes from human pluripotent stem cells demonstrated in cultured vascular plexus and zebrafish xenografts. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (1), 177-186 (2014).
- Shetty, S., Weston, C. J., Adams, D. H., Lalor, P. F. A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress. Journal of Visualized Experiments. (85), 1-6 (2014).
- Muller, W. A., Luscinskas, F. W.
- Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions. Journal of Visualized Experiments. (66), 1-5 (2012).
- Vajen, T., Heinzmann, A. C. A., et al. Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets. Journal of Visualized Experiments. (134), (2018).
- Carpenter, A. E., Jones, T. R., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), R100 (2006).
- Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte Migration into Inflamed Tissues. Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).
