本方案以可视化方式展示了脑干-脊髓制备过程，并全面、分步详解了脑干横切片的制备方法。该方案旨在提高实验可重复性，并增加成功获取存活时间长、具有节律性活性、可用于记录脑干呼吸区神经输出信号的脑片的可能性。
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本文内容
摘要
摘要
哺乳动物的吸气节律由延髓一个称为前包钦格复合体（pBC）的神经元网络产生，该网络发出信号驱动吸气肌的节律性收缩。可通过多种方法研究pBC产生的节律性神经活动及其向其他神经元群传递以支配呼吸肌的过程，包括整体神经记录和横切脑片记录。然而，以往发表的方法并未以透明且可重复的方式充分描述脑干-脊髓的解剖过程，不利于后续研究。本文详细介绍了一种可重复制备具有节律活性的脑干脑片的方法，该脑片包含生成和传递吸气驱动所必需且充分的神经环路。本研究在既往脑干-脊髓电生理实验方案的基础上进行了优化，提高了稳定获得可用于记录的、具有节律活性且状态良好的脑片的可能性，以便记录来自前包钦格复合体（pBC）、舌下神经前运动神经元（XII pMN）以及舌下神经运动神经元（XII MN）的神经输出信号。本工作在以往已发表方法的基础上进一步拓展，提供了从完整新生大鼠幼崽到包含舌下神经根丝的体外脑片的详细分步解剖图示。
引言
脑干呼吸神经网络为理解节律性神经网络的一般特性提供了丰富的研究领域。特别是，研究关注新生啮齿类动物呼吸的发育过程，以及呼吸节律是如何形成的。可通过多层次方法开展此类研究，包括在体全动物体积描记法、离体脑干-脊髓标本神经记录，以及包含呼吸节律发生器的离体脑片记录。在探究发育中啮齿类动物脑干-脊髓区域呼吸节律发生机制及神经环路时，简化式的离体脑干-脊髓标本和脑片记录是一种优势方法。发育中的呼吸系统包含约40种细胞类型，这些细胞类型可根据其放电模式进行表征，其中包括中枢呼吸相关细胞1,2中枢呼吸网络包含一组位于延髓腹外侧头端的节律性活跃神经元1,3哺乳动物呼吸节律的产生源于一个被称为preBötzinger复合体（pBC）的自主节律性中间神经元网络，该结构已通过实验手段实现定位。 通过 新生哺乳动物脑干-脊髓的切片及整块标本制备3,4,5,6,7,
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方案
以下方案已获得洛马林达大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）的接受和批准。实验室开展的所有动物实验均遵循美国国立卫生研究院（NIH）关于动物伦理待遇的指南。执行本方案的人员均严格遵守各项伦理标准。
1. 溶液
- 制备人工脑脊液（aCSF）。
- 在实验前一晚，按以下配方配制1 L批次的新鲜aCSF：7.250 g NaCl（124 mM）、0.224 g KCl（3 mM）、2.100 g NaHCO3（25 mM）、0.069 g NaH2PO4 • H2O（0.5 mM）、0.247 g MgSO4 • 7H2O（1.0 mM）、5.410 g D-葡萄糖（30 mM）和0.221 g CaCl2 • 2H2O（1.5 mM）。CaCl2 • 2H2O必须最后加入。
- 将各组分溶解于1 L去离子水中，搅拌20–30分钟。
- 测量aCSF的pH值，并用少量稀释的NaOH、KOH或HCl（通常<0.5 mL）调节至7.40 ± 0.02。
注意：配制好的aCSF可在冰箱中（4 °C，p....
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结果
本文介绍的方法可帮助研究人员稳定、可靠地制备具有节律性活性的脑干切片，获得可长期记录“拟态”运动输出的健康、功能完整的薄切片。使用该方法可在薄切片中包含生成和传递吸气节律所需的全部基本神经回路元件。这些元件包括：前包钦格复合体（preBötzinger Complex）、投射至舌下神经运动神经元（pXII MNs）的中间神经元、舌下神经运动神经元（XII MNs）以及舌下神经根丝。前包钦格复合体（pBC）、舌下神经（XIIn）和C4神经根丝常用于吸气节律记录，如图7所示。
成功实施本方案可在10至15分钟内获得具有活性且节律性活动良好的整体标本，或获得具有节律性活动的脑片 <30 分钟。在分离出整体脑干-脊髓或薄片后，标本在记录 chamber 中平衡 15 分钟即可产生稳定的拟态运动输出。对于脑片而言，将细胞外 [K+] 提高至约 8–9 mM，根据本实验室经验，可产生强健的神经驱动，.......
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讨论
将本文所述方案调整为整体组织块（en bloc）或脑片工作流程，对于希望采用整体脑干-脊髓组织块和/或薄切片制备进行电生理记录的实验室和研究而言具有显著优势。本研究所展示的解剖与切片方法，结合先前其他研究者已报道的方法17,18,19，可实现稳定、活性良好且可重复的组织制备，广泛适用于利用啮齿类动物后脑或脊髓开展的多种实验。本文提供的解剖方法极为详尽，包括背侧和腹侧椎板切除术，并详细说明了在进行切片前脑干-脊髓组织的定位方向。该详细的解剖与切片方案使研究人员能够保留生成和传递吸气节律所必需的全部神经环路。使用本方法可涵盖的主要神经元群/结构包括：舌下神经前运动神经元、舌下神经运动核以及preBötzinger复合体。需注意的是，本方案所述制备过程不包含脑干中存在中枢CO2感受器或呼气节律产生回路（RTN/pFRG）的区域20,.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
S.B.P 获得了洛马林达大学暑期本科生研究奖学金。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P5405-1KG | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-1 | |
| NaH2PO4 •H2O | Sigma Aldrich | S9638-25G | |
| CaCl2•2H2O | Sigma Aldrich | C7902-500G | |
| MgSO4•7H2O | Sigma Aldrich | M7774-500G | |
| D-葡萄糖 | Sigma Aldrich | G8270-1KG | |
| 冷光源卤素灯 150 W | AmScope | H2L50-AY | |
| 解剖显微镜 | Leica | M-60 | |
| Vibratome 1000 Plus | Vibratome | W3 69-0353 | |
| 磁性底座 | Kanetic | MB-B-DG6C | |
| 异氟烷，USP | Patterson Veterinary | NDC 14043-704-06 | |
| Sword Classic 双刃刀片 | Wilkinson | 97573 | |
| Histoclear | Sigma-Aldrich | H2779 | |
| Dumont #5 精细镊子 | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5/45 镊子 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| 手术刀片 #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| 手术刀柄 #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| 直头弹簧剪 | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| 窄齿直头有齿镊 | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Castroviejo 微型解剖弹簧剪；直头 | Roboz | RS-5650 | |
| Vannas 剪刀 3" 弯头 | Roboz | RS-5621 | |
| 昆虫针，0号 | Fine Science Tools/8840604 | 26000-35 | |
| 昆虫针，0号，不锈钢 | Fine Science Tools | 26001-35 | |
| 昆虫针，00号 | Fine Science Tools | 26000-30 | |
| 昆虫针，00号，不锈钢 | Fine Science Tools | 26001-30 | |
| 昆虫针，000号 | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| 昆虫针，000号，不锈钢 | Fine Science Tools | 26001-25 | |
| 显微针，0.10 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| 显微针，0.15 mm | Fine Science Tools | 26002-15 | |
| 显微针，0.2 mm | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Fisher 组织处理石蜡 | fisher | T56-5 | |
| 石墨 | fisher | G67-500 | |
| Delrin 塑料 | Grainger | 3HMT2 | |
| 18 号皮下注射针头 | BD | 305195 |
参考文献
- Hilaire, G., Duron, B. Maturation of the Mammalian Respiratory System. Physiological Reviews. 79, 325-360 (1999).
- Pinkerton, K. E., Joad, J. P. The Mammalian Respiratory System and Critical Windows of Exposure for Children's Health. Environment....
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重印与许可
