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Neuroscience

Photoactivatable निकोटीन के लेजर फ्लैश Photolysis के माध्यम से माउस मस्तिष्क स्लाइस में कोर्टेक्स Acetylcholine रिसेप्टर समारोह की जांच

Published: January 25, 2019 doi: 10.3791/58873
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 1
1Department of Pharmacology, Northwestern University Feinberg School of Medicine, 2Department of Physiology, Northwestern University Feinberg School of Medicine, 3Janelia Research Campus, Howard Hughes Medical Institute

Summary

यह लेख निकोटीन uncaging द्वारा माउस मस्तिष्क स्लाइस में कोर्टेक्स acetylcholine रिसेप्टर्स (nAChRs) का अध्ययन करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है. जब एक साथ पैच दबाना रिकॉर्डिंग और 2-फोटॉन लेजर माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग के साथ युग्मित, निकोटीन uncaging सेलुलर आकृति विज्ञान के साथ कोर्टेक्स रिसेप्टर समारोह जोड़ता है, कोलीनर्जिक तंत्रिका जीव विज्ञान की एक गहरी समझ प्रदान.

Abstract

Acetylcholine (पीटीएच) रिसेप्टर्स के माध्यम से कार्य करता है के लिए ंयूरॉन प्रक्रियाओं की एक किस्म मिलाना, लेकिन यह गया है, जहां इस समारोह से बाहर किया जाता है कोशिकाओं के भीतर उपसेलुलर स्थान के साथ इस तरह के लिए पीटीएच रिसेप्टर समारोह लिंक चुनौतीपूर्ण है । कोर्टेक्स के सेलुलर स्थान का अध्ययन करने के लिए (nAChRs) देशी मस्तिष्क ऊतक में, एक ऑप्टिकल विधि electrophysiological रिकॉर्डिंग के दौरान असतत झिल्ली के पास अलहदा स्थानों पर निकोटीन की सटीक रिहाई के लिए विकसित किया गया था. मस्तिष्क स्लाइस में पैच clamped न्यूरॉन्स डाई से भर रहे हैं 2 के दौरान उनकी आकृति विज्ञान कल्पना करने के लिए फोटॉन लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी, और निकोटीन uncaging एक या एक से अधिक सेलुलर झिल्ली के पास एक ४०५ एनएम लेजर बीम ध्यान केंद्रित करके एक प्रकाश फ्लैश के साथ मार डाला है. सेलुलर वर्तमान विक्षेपन मापा जाता है, और एक उच्च संकल्प तीन आयामी (3 डी) की छवि दर्ज ंयूरॉन सेलुलर आकृति विज्ञान के साथ nAChR प्रतिक्रियाओं के सामंजस्य की अनुमति देने के लिए किया जाता है । इस विधि जटिल ऊतक की तैयारी में nAChR कार्यात्मक वितरण के विस्तृत विश्लेषण के लिए अनुमति देता है, कोलीनर्जिक neurotransmission की समझ बढ़ाने का वादा ।

Introduction

कोलीनर्जिक संकेतन ध्यान नियंत्रण, इच्छाशक्ति आंदोलन, और1,2इनाम सहित कई मस्तिष्क प्रक्रियाओं, संग्राहक है । दवाओं है कि acetylcholine (कोलीनर्जिक) संचरण बढ़ाने के लिए अल्जाइमर रोग के साथ जुड़े संज्ञानात्मक हानि के इलाज के लिए उपयोग किया जाता है, अनुभूति3में सिस्टम के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका का अर्थ है । स्वस्थ और रोगग्रस्त राज्यों में कोलीनर्जिक रिसेप्टर्स और सर्किट की एक बेहतर समझ कई तंत्रिका विज्ञान के रोगों के लिए अच्छा चिकित्सकीय दृष्टिकोण के लिए नेतृत्व कर सकते हैं/

कोर्टेक्स (nAChRs) ligand के एक परिवार gated आयन चैनल है कि फ्लक्स cations के जवाब में अंतर्जात या तंबाकू उत्पादों से निकोटीन exogenous । तथ्य यह है कि वे बहुत पहले न्यूरोट्रांसमीटर रिसेप्टर्स के बीच थे को देखते हुए4वर्णित किया जा करने के लिए, nAChR औषध विज्ञान और मांसपेशी फाइबर में स्थान अच्छी तरह से समझ में आता है मांसपेशी प्रकार रिसेप्टर्स. इसके विपरीत, अपेक्षाकृत थोड़ा औषध विज्ञान और मस्तिष्क में देशी nAChRs के उपसेलुलर वितरण के बारे में जाना जाता है । ज्ञान में यह अंतर हाल ही में एक उपंयास रासायनिक जांच कि सेलुलर इमेजिंग और electrophysiological5रिकॉर्डिंग के दौरान मस्तिष्क के ऊतकों में nAChRs के स्थानिकी प्रतिबंधित और तेजी से सक्रियण के लिए अनुमति देता है विकसित करके संबोधित किया गया था । यहां, प्रमुख methodological कदम इस दृष्टिकोण में शामिल है, की क्षमता को बढ़ाने के समग्र लक्ष्य के साथ वर्णित कर रहे है nAChR कार्य को न्यूरॉन संरचना के साथ कनेक्ट ।

Photoactivatable निकोटीन (PA-Nic; रासायनिक नाम: 1-[7-[बीआईएस (carboxymethyl)-अमीनो] अनंतमूलि-4-yl] मिथाइल-निकोटीन) के साथ photolyzed जा सकता है ~ ४०५ एनएम लेजर चमक को कुशलतापूर्वक जारी निकोटीन5,6। uncaging करने से पहले, पीए-एनआईसी समाधान में स्थिर है और कोई अप्रिय औषधीय या photochemical सुविधाओं का प्रदर्शन5. photolysis के बाद, जारी निकोटीन जाहिर है nAChRs सक्रिय करता है और uncaging शोधकार्य औषधीय5निष्क्रिय कर रहे हैं । एक सतत-तरंग लेजर एक उत्पादन शक्ति के साथ photolysis प्रकाश स्रोत के रूप में प्रयोग किया जाता है > 1 नमूने पर मापा मेगावाट । जब स्थानीयकृत, लक्षित फोटो उत्तेजना 2-फोटॉन लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (2PLSM) के साथ सेलुलर झिल्ली का पता लगाने की क्षमता के साथ संयुक्त है, और इस दृष्टिकोण के दो प्रमुख लाभ पूरी तरह से महसूस कर रहे हैं: photolysis गति और स्थानिक परिशुद्धता.

अधिकांश मामलों में, PA-Nic के photolysis मस्तिष्क स्लाइस के भीतर रिसेप्टर्स करने के लिए nAChR लाइगैंडों देने के अन्य तरीकों से बेहतर है. इस तरह के दृष्टिकोण एक puffer पिपेट8 के माध्यम से स्नान आवेदन7 और स्थानीय दवा वितरण शामिल हैं । जबकि पूर्व दृष्टिकोण पर लागू दवा के दीर्घकालिक प्रभाव पर जोर देता है, उत्तरार्द्ध दृष्टिकोण परीक्षणों और कोशिकाओं के बीच प्रतिक्रिया कैनेटीक्स में परिवर्तनशीलता से पीड़ित कर सकते हैं । इन वैकल्पिक दृष्टिकोण के न तो पर्याप्त रूप से एक ही ंयूरॉन से अलग सेलुलर स्थानों में रिसेप्टर गतिविधियों भेद कर सकते हैं । Optogenetically-सक्रिय रिलीज के लिए उपयोग किया गया है की जांच के लिए देशी nAChRs9,10,11, लेकिन यह उपयोगी साबित नहीं है सेलुलर nAChR स्थानों मानचित्रण के लिए । इसके अलावा, सबसे इस दृष्टिकोण का उपयोग अध्ययन एक ChR2-व्यक्त बैक्टीरियल कृत्रिम गुणसूत्र ट्रांसजेनिक माउस के साथ असामान्य कोलीनर्जिक संचरण पर भरोसा किया है12,13,14, 15 , 16 , 17. शी.

PA-Nic photolysis कोलीनर्जिक रिसेप्टर्स का अध्ययन करने के लिए केवल ऑप्टिकल दृष्टिकोण नहीं है । एक बंदी carbachol को कार्यात्मक रूप से कल्चरल सेल18 और ब्रेन स्लाइस19में पीटीएच रिसेप्टर गतिविधियों को मैप करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, लेकिन पीए-एनआईसी के विकास के दौरान तुलनात्मक अध्ययन के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं था । एक ruthenium बीआईएस (bipyridine)-निकोटीन जटिल (रूबि-निकोटीन) को निकोटीन uncaging20के लिए अनुमति देने के लिए सूचित किया गया था, लेकिन रूबि के वाणिज्यिक तैयारी-निकोटीन एक सिर से सिर तुलना अध्ययन5में पीए एनआईसी के लिए अवर साबित कर दिया. यह गैर के साथ इस तरह के तुलनात्मक प्रयोगों को दोहराने उपयोगी हो सकता है वाणिज्यिक, उच्च शुद्ध रूबि-निकोटीन, के रूप में अपनी दिखाई अवशोषण कोलीनर्जिक अध्ययन के लिए PA-एनआईसी की सुविधाओं की तारीफ कर सकता है । अंत में, nAChRs भी ऑप्टिकली फोटो स्विच लाइगैंडों और आनुवंशिक रूप से संशोधित रिसेप्टर्स21का एक संयोजन का उपयोग कर हेरफेर किया गया है । यह दृष्टिकोण फिलीस्तीनी अथॉरिटी के पूरक है मस्तिष्क ऊतक में एनआईसी photolysis, की क्षमता के साथ/संशोधित nAChR दोनों एक लाभ और एक खामी के रूप में देखा की आनुवंशिक लक्ष्यीकरण की आवश्यकता है ।

इस दृष्टिकोण की कई प्रमुख आवश्यकताओं पर ध्यान दिया जाना चाहिए । सबसे पहले, एक उपयुक्त दृश्य विधि को सही ंयूरॉन झिल्ली का पता लगाने की जरूरत है । पारंपरिक महामारी के साथ इमेजिंग-प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी जब प्रसंस्कृत कोशिकाओं का अध्ययन पर्याप्त हो सकता है, लेकिन मस्तिष्क स्लाइस या अन्य मोटी ऊतक की तैयारी, 2PLSM या फोकल माइक्रोस्कोपी में न्यूरॉन्स से रिकॉर्डिंग के लिए एक आवश्यकता है. दूसरा, एक उपयुक्त विधि photolysis लेजर बीम की स्थिति की जरूरत है । इस दृष्टिकोण दो स्वतंत्र एक्स-वाई के साथ एक दोहरे गैल्वेनोमीटर स्कैन सिर का इस्तेमाल इमेजिंग बीम और प्वाइंट photoactivation uncaging लेजर बीम22,23,24का उपयोग कर के रैस्टर स्कैनिंग के लिए दर्पण । अंय, और अधिक सीमित समाधान संभव है, जैसे (1) एक एकल गैल्वेनोमीटर स्कैन सिर कि वैकल्पिक रूप से रैस्टर इमेजिंग बीम और uncaging बीम, या (2) बस देखने के क्षेत्र के केंद्र के लिए uncaging किरण निर्देशित ऐसी है कि सेल के लिए लाया जाता है स्कैन फ़्लैश photolysis के लिए यह स्थिति । तीसरे, एक प्रणाली एक साथ electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए आवश्यक है अगर एक प्रयोगों के दौरान शारीरिक संकेतों को इकट्ठा करना चाहता है । उपर्युक्त आवश्यकताओं को एक उपयुक्त सभी ऑप्टिकल इमेजिंग तकनीक के साथ मुलाकात की जा सकती है, जैसा कि हाल ही में5वर्णित है । नीचे, एक विस्तृत प्रोटोकॉल शामिल है जो इस approach के प्रमुख चरणों का वर्णन करता है ।

Protocol

मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी से संबंधित काम की समीक्षा की और पश्चिमोत्तर विश्वविद्यालय पशु देखभाल और उपयोग समिति (प्रोटोकॉल #IS00003604) द्वारा अनुमोदित किया गया था ।

सावधानी: बिंदु फोटो उत्तेजना के लिए इस्तेमाल पराबैंगनीकिरण दिखाई कक्षा IIIb पराबैंगनीकिरण जो आंखों को नुकसान का कारण है की क्षमता है । 2PLSM एक निकट अवरक्त (NIR) कक्षा चतुर्थ लेजर (> 500 मेगावाट) की आवश्यकता है, जो क्षमता है कि आंखों को गंभीर नुकसान का कारण और अंय ऊतकों में भी जलता है । उचित लेजर बीम रोकथाम, सिस्टम इंटरलॉकिंग, प्लस इंजीनियर और प्रशासनिक नियंत्रण के लिए लेजर आधारित उपकरणों के सुरक्षित संचालन सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक हैं । पराबैंगनीकिरण के साथ काम करते समय हमेशा बाहर स्थानीय लेजर सुरक्षा कर्मियों की तलाश ।

1. अंशांकन और Uncaging लेजर (ओं) का सत्यापन

  1. लेजर शक्ति यों तो नमूने को दिया जाता है ।
    1. ४०५ एनएम लेजर चालू करें (5 वी नियंत्रण संकेत के साथ १०० मेगावाट अधिकतम शक्ति) और लेजर प्रणाली के बारे में 10 मिनट के लिए गर्म ।
      नोट: लेजर अभी भी (0 वी ड्राइव के साथ) बंद है और वहां कोई उत्पादन शक्ति है जब तक लेजर एक नियंत्रण वोल्टेज के लिए उत्पादन शक्ति मिलाना भेजा है ।
    2. ऊतक नमूना विमान में एक बिजली मीटर या संघनित्र लेंस के स्थान पर रखें । मैंयुअल रूप से ऑप्टिकल पथ के सापेक्ष मीटर केंद्र/
    3. सही तरंग दैर्ध्य रेंज (400-1100 एनएम) के लिए मीटर सेट करें । उचित बटन निराशाजनक द्वारा मीटर शूंय ।
    4. सॉफ्टवेयर नियंत्रण का उपयोग, का चयन करें १०० (बाहर मैक्स १०००; १००० = 5 वी) के लिए ४०५ एनएम लेजर शक्ति है, जो पूरी शक्ति का 10% करने के लिए लेजर सेट । यदि वांछित, लेजर नियंत्रण वोल्टेज भी VoltageRecord के माध्यम से PrairieView प्रणाली में खिलाया जा सकता है कमांड संकेत समय और बिजली के स्तर का एक डिजिटल रिकॉर्ड प्रदान करते हैं ।
    5. बिजली मीटर से रीडिंग का रिकॉर्ड ।
    6. ४०५ एनएम लेजर बिजली उत्पादन के लिए १५० (मैक्स १००० का 15%) का चयन करें और बिजली मीटर से पढ़ने के रिकॉर्ड । इस दोहराने के लिए निंनलिखित उत्पादन शक्तियों के लिए एक लेजर शक्ति को इकट्ठा वक्र: २००, २५०, ३००, ३५०, ४००, ४५०, ५००, ५५०, ६००, ६५०, ७००, ७५०, ८००, ८५०, ९००, ९५०, और १००० ।
  2. uncaging लेजर galvanometers जांचना । जब भी वहां प्रणाली के ऑप्टिकल घटकों के लिए एक परिवर्तन है निंन चरणों का निष्पादन, जब भी वहां सटीक स्थान स्थिति के बारे में एक चिंता का विषय है, या नियमित रूप से हर महीने ।
    1. 60x जल-सूई माइक्रोस्कोप उद्देश्य लेंस है कि photostimulation और इमेजिंग प्रयोगों में इस्तेमाल किया जाएगा स्थापित करें । अधिग्रहण/इमेजिंग सॉफ्टवेयर में, 60x उद्देश्य लेंस और 1 का एक ऑप्टिकल ज़ूम सेटिंग का चयन करें (चरण 3.1.4.2 देखें.) ।
    2. एक लाल स्थाई मार्कर के साथ एक साफ गिलास माइक्रोस्कोपी स्लाइड पर एक भरा चक्र मार्क । उद्देश्य की ओर मार्कर के साथ, माइक्रोस्कोप मंच पर स्लाइड रखें ।
    3. पहले एक 4x या 10x उद्देश्य के साथ लाल मार्कर क्षेत्र पर माइक्रोस्कोप ध्यान केंद्रित । लाल मार्कर डॉट के शीर्ष पर पानी की 1-2 मिलीलीटर जोड़ें/और फिर 60x उद्देश्य के लिए स्विच और पानी में उद्देश्य जलमग्न । पतली लाल मार्कर क्षेत्र पर उद्देश्य लेंस ध्यान केंद्रित ।
    4. 2-फोटॉन लेज़र स्कैनिंग पर स्विच करें । सबसे प्रणालियों के लिए, #1 स्थिति के लिए बुर्ज चाल, प्रकाश पथ के बाहर trinocular चश्मे चाल, सामने करने के लिए स्कैन सिर दर्पण चाल, और लेजर तरंग दैर्ध्य सेट करने के लिए ~ ९०० एनएम. छवि अधिग्रहण मापदंडों, जो उत्तेजना दर्पण अंशांकन दिनचर्या के लिए डिफ़ॉल्ट पिक्सेल तत्व है के लिए ५१२ x ५१२ पिक्सेल बॉक्स विकल्प का चयन करें ।
    5. एक इमेजिंग लेजर शक्ति से अधिक ंयूनतम और ठीक धुन पतली लाल मार्कर प्रतिदीप्ति परत पर उद्देश्य ध्यान केंद्रित करने के साथ सिस्टम स्कैनिंग शुरू करो । प्रतिदीप्ति क्षेत्र में एक क्षेत्र चुनें मलबे के स्पष्ट और समान रूप से मार्कर के साथ लेपित ।
      नोट: इस प्रोटोकॉल में सेटअप PrairieView ५.४ प्राप्ति/इमेजिंग सॉफ़्टवेयर का उपयोग करता है ।
    6. उपकरण के भीतर Uncaging Galvo अंशांकन समारोह खोलें -सॉफ्टवेयर के अंशांकन/संरेखण मेनू । दूसरे गैल्वेनोमीटर मिरर जोड़ी के स्थानिक अंशांकन के लिए जला स्पॉट ट्यूटोरियल के माध्यम से चलो ।
      1. के भीतर स्पॉट ट्यूटोरियल जला , ४०५ एनएम लेजर चुनें, ४०० के एक लेजर उत्तेजना शक्ति का चयन करें और 20 ms के एक उत्तेजना अवधि यह छोटे उपज चाहिए (~ 1-5 µm व्यास) लाल मार्कर में छेद ।
        नोट: सेटिंग्स जैसे ~ 2-4 मेगावाट और 1-10 ms आमतौर पर उपयोग किया जाता है, लेकिन सेटिंग्स नमूने द्वारा निर्धारित होते हैं । PA-एनआईसी फोटो-उत्तेजना शक्ति सेटिंग्स लाल मार्कर स्लाइड में एक दृश्य छेद ablate करने के लिए अंशांकन के दौरान आवश्यक शक्ति की तुलना में अभी तक कम होने की संभावना है । इस अंशांकन दिनचर्या photostimulation धब्बे का पता लगाने के लिए उपयोगी है, लेकिन शारीरिक प्रतिक्रियाओं के दौरान निरपेक्ष photostimulation मात्रा का अनुमान करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए ।
      2. केंद्र स्थान को बर्न करने के बाद छवि को उत्तेजित करने और ताज़ा करने के लिए अद्यतन का चयन करें और गोल लाल संकेतक को वास्तविक स्पॉट स्थान पर ले जाएं । केंद्र स्थान के लिए यह मत करो, सही केंद्र स्थान, कम केंद्र स्थान है, और अंत में नौ स्थानों की एक ग्रिड के लिए (सभी कोनों और किनारों से अधिक छवि के केंद्र) ।
        नोट: केंद्र, ठीक है, और कम सही जगह स्थानों उत्तेजना गैल्वेनोमीटर वोल्टेज का निर्धारण करने के लिए सच केंद्र और एक्स और वाई को परिभाषित कारकों को इमेजिंग दर्पण जोड़ी को उत्तेजना दर्पण जोड़ी मैच निर्धारित करते हैं । सॉफ्टवेयर पैमाने पर होगा, और अद्यतन, सभी अनुवर्ती MarkPoints प्रयोगों स्थानिक अंशांकन ज़ूम से अलग ज़ूम सेटिंग्स पर प्रदर्शन किया.
    7. परीक्षण अंशांकन MarkPoints विंडो खोलने और मैन्युअल रूप से निर्धारित स्थान (s) में उत्तेजना मापदंडों को सक्रिय नमूना के एक नए क्षेत्र में. सुनिश्चित करें कि सही, नवीनतम अंशांकन फ़ाइल MarkPoints विंडो में लोड किया गया है । MarkPoints/समूह या MarkPoints श्रृंखला सुविधा को एक निर्धारित स्थान (s) पर सक्रिय करें या लाइव स्कैनिंग के दौरान छवि पर कहीं भी माउस क्लिक करने के लिए live/पृथक सुविधा का उपयोग एक परीक्षण पल्स लागू करने के लिए और सही अंशांकन सत्यापित करने के लिए ।
      नोट: लेजर जला जगह अब पूरी तरह से MarkPoints संकेतक पर केंद्रित होना चाहिए ।
    8. मॉनिटर और VoltageRecord कार्यक्रम में बंद ड्राइव वोल्टेज दोहन से लेजर पल्स शक्ति और लौकिक अवधि के सक्रियकरण रिकॉर्ड (1.1.4 कदम देखें) । इसी तरह, फोटो उत्तेजना गैल्वेनोमीटर दर्पण की जोड़ी से व्युत्पंन प्रतिक्रिया संकेतों से एक स्केल्ड वोल्टेज संकेत का उपयोग कर प्रत्येक उत्तेजना स्थान की स्थिति रिकॉर्ड ।

2. Photoactivatable निकोटीन की तैयारी (फिलीस्तीनी अथॉरिटी-एनआईसी)

  1. भंडारण से lyophilized photoactivatable दवा के एक aliquot पुनः प्राप्त ।
    नोट: निम्न प्रोटोकॉल PA-Nic के लिए विशिष्ट है; अन्य photoactivatable दवाओं के लिए आवश्यकतानुसार समायोजित करें । हालांकि PA-एनआईसी असाधारण स्थिरता को दर्शाता है5, यह तैयारी और/या प्रयोगों के दौरान उज्ज्वल प्रकाश के लिए जोखिम से बचाने के लिए उचित सावधानियों ले । यह केवल कम रोशनी में काम करके पूरा किया जा सकता है; लाल फ़िल्टर की गई लाइट को प्रतिबंधित करना आवश्यक नहीं है ।
  2. देहात-एनआईसी के स्थानीय आवेदन करते हैं ।
    1. 20-40 µm के एक खोलने व्यास के साथ एक प्रोग्राम पिपेट खींचने के साथ एक गिलास micropipette खींचो ।
    2. एक ०.२२ µm फिल्टर के साथ रिकॉर्डिंग समाधान की ~ 1 मिलीलीटर फ़िल्टर । 2 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता उपज के लिए फ़िल्टर्ड रिकॉर्डिंग समाधान में पीए एनआईसी की एक मात्रा resuspend । उदाहरण के लिए, फ़िल्टर की गई रिकॉर्डिंग समाधान के ५० µ l में १०० nmol lyophilized aliquot को भंग करना.
      नोट: एक सुझाव रिकॉर्डिंग समाधान संरचना हाल के प्रकाशनों में पाया जा सकता है5,PA-एनआईसी photolysis रोजगार6 ।
    3. बैक-2 एमएम पीए-एनआईसी के ५० µ एल के साथ स्थानीय आवेदन पिपेट भरें ।
    4. एक micromanipulator पर घुड़सवार एक पिपेट धारक में स्थानीय अनुप्रयोग पिपेट सुरक्षित । एक दबाव इंजेक्शन प्रणाली निरंतर कम दबाव आवेदन (1-2 साई) में सक्षम करने के लिए उपयुक्त टयूबिंग के माध्यम से पिपेट धारक कनेक्ट ।
    5. micromanipulator का उपयोग करना, extracellular रिकॉर्डिंग समाधान में पिपेट स्थानीय अनुप्रयोग पैंतरेबाज़ी और ब्याज की सेल से ~ ५० माइक्रोन स्थित माउस मस्तिष्क ऊतक से थोड़ा ऊपर पिपेट टिप की स्थिति । माउस मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी और पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग8की एक विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए एक पिछली रिपोर्ट से परामर्श करें ।
    6. संक्षेप में दबाव लागू करके आवेदन मापदंडों की जाँच करें (1-2 psi). ब्याज की सेल का कोई विस्थापन करने के लिए ंयूनतम होना चाहिए । यदि महत्वपूर्ण आंदोलन घटित होता है, तो रुचि के कक्ष से (पार्श्व में और/या अक्षीय दिशा में) स्थानीय अनुप्रयोग पिपेट को फिर से स्थान देता है ।
    7. स्थिर पूरे सेल पैच दबाना प्राप्त करने के बाद (विवरण जिसके लिए एक पूर्व प्रकाशन8में शामिल हैं), दबाव इंजेक्शन डिवाइस पर उचित मैनुअल स्विच का उपयोग कम दबाव (1-2 p.s.i.) आवेदन पर बारी. अगले कदम पर आगे बढ़ने से पहले 1-2 मिनट के लिए पीए एनआईसी के साथ सेल आसपास के ऊतकों को संतृप्त ।
  3. मस्तिष्क टुकड़ा करने के लिए पीए-एनआईसी के स्नान आवेदन (superfusion) प्रदर्शन करते हैं ।
    1. १०० माइक्रोन की एक अंतिम एकाग्रता उपज के लिए निरंतर संचलन के लिए उपयुक्त रिकॉर्डिंग समाधान की एक मात्रा में पीए-एनआईसी की एक मात्रा को भंग. उदाहरण के लिए, एक मानक 15 मिलीलीटर ट्यूब का उपयोग कर रिकॉर्डिंग समाधान के 10 मिलीलीटर में एक 1 μmol aliquot भंग ।
    2. छिड़काव प्रणाली में उचित प्रवाह नियंत्रण खोलने के द्वारा 1.5-2 मिलीलीटर/मिनट की दर से PA-Nic समाधान का पुनः प्रचलन शुरू करें । रिकार्डिंग की अवधि के लिए recirculation होता है । मूल्यवान दवा के संरक्षण के लिए, एक न्यूनतम भीतरी व्यास के साथ ट्यूबिंग का उपयोग करके संचलन मात्रा को कम करने, और/या छिड़काव प्रणाली में इस्तेमाल टयूबिंग की कुल लंबाई को छोटा करके ।
      नोट: इन चरणों को लेकर, स्नान परिसंचरण के लिए मात्रा पीए-एनआईसी समाधान के 5 मिलीलीटर को कम किया जा सकता है । PA-एनआईसी समाधान अक्सर एक ही सप्ताह के भीतर दो लगातार रिकॉर्डिंग दिन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है अगर प्रकाश से 4 डिग्री सेल्सियस पर सुरक्षित संग्रहीत ।
    3. संचलन के दौरान, लगातार carbogen के साथ समाधान बुलबुला (5% हे2, ९५% CO2) और ३२ डिग्री सेल्सियस पर स्नान के तापमान को बनाए रखने ।
    4. कम रोशनी की स्थिति में पीए-एनआईसी के साथ काम करते हुए रिकॉर्डिंग समाधान में मस्तिष्क टुकड़ा बरकरार रखें ।

3. इमेजिंग न्यूरॉन्स के साथ 2-फोटॉन लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी

  1. कक्ष का लाइव दृश्य निष्पादित करें ।
    1. पहचानें/कल्पना एक औसत दर्जे का habenula (एमएचबी) ंयूरॉन का उपयोग कर संचारित प्रकाश या बुनियादी लाल अंतर हस्तक्षेप इसके विपरीत (IR/) प्रकाशिकी और एक वीडियो कैमरा और एक स्थिर पूरी सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग की स्थापना । एक पिछले प्रोटोकॉल के लिए विवरण के लिए पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग पर तीव्रता से तैयार माउस मस्तिष्क स्लाइस में ंयूरॉंस से देखें8।
    2. उच्च प्रतिरोध (> 1 GΩ) सेल संलग्न विंयास स्थापित करने के बाद, लेकिन तोड़ने से पहले, सेट अप और लेजर स्कैनिंग मोड के लिए सॉफ्टवेयर स्विच ।
    3. के बाद तोड़ में, लेजर स्कैनिंग का उपयोग करने के लिए सत्यापित करें कि एक इमेजिंग डाई (100-200 µ मीटर की एक अंतिम एकाग्रता को पतला एक मानक intracellular पिपेट समाधान में पहले8वर्णित) निष्क्रिय है (प्रसार द्वारा) ंयूरॉन भरने । डाई की अनुमति दें (जैसे, alexa Fluor ४८८ ग्रीन photomultiplier ट्यूब में [pmt] चैनल, पीएमटी 2; या alexa Fluor ५६८ या ५९४ लाल पीएमटी चैनल में, पीएमटी 1) के दृश्य की आवश्यकता है कि प्रयोगों का प्रयास करने से पहले न्यूनतम 20-30 मिनट के लिए सेलुलर डिब्बों को भरने के लिए सोमा के बाहर कोई सेलुलर डिब्बा.
      नोट: बाहर डिब्बों (वृक्ष संरचनाओं, spins, axons, आदि)को पूरी तरह से25को भरने के लिए 30-40 मिनट की आवश्यकता हो सकती है ।
    4. सॉफ्टवेयर लाइव स्कैन समारोह का उपयोग करने के लिए ब्याज की ंयूरॉन और सेलुलर डिब्बे कल्पना । ऐसे इमेजिंग पैरामीटर चुनें जो न्यूरॉन सुविधाओं के सटीक लाइव दृश्य के लिए अनुमति देते हैं । प्रदर्शन विज़ुअलाइज़ेशन (कंट्रास्ट), रिज़ॉल्यूशन, सिग्नल-टू-शोर (S/N) अनुपात, और छवि फ़्रेम प्राप्ति समय को प्रभावित या परिवर्तित करने के लिए विभिन्न सेटिंग्स में हेरफेर:
      1. लुक-अप-टेबल (LUT)। किसी भी छवि विंडो के किनारे पर उपयुक्त चिह्न का उपयोग कर LUT विंडो खोलें । एक बार खोलने के लिए, स्क्रीन पर दिखाए गए संकेत कंट्रास्ट के दृश्य को एंहांस करने के लिए विशिष्ट छवि चैनल की LUT तल (min) और छत (अधिकतम) सेटिंग समायोजित करें । कम अधिकतम मूल्य ~ १००० (४०९६, 12 बिट का पता लगाने), जो पहले कोशिकाओं, संकेत, और संरचना के लिए खोज जब dimmer संकेतों को बाहर खींचने में मदद मिलेगी के लिए ।
        नोट: ये सेटिंग्स केवल प्रदर्शित संकेत को प्रभावित करती हैं, न कि खोजे गए/ मानव आंखें आम तौर पर केवल बाहर कर सकते है ~ ५० ग्रे स्तर26के विपरीत ।
      2. ऑप्टिकल ज़ूम। 1x ऑप्टिकल ज़ूम का चयन करें और ऊतक में वांछित क्षेत्र का पता लगाने के लिए panning नियंत्रण का उपयोग करने के लिए सॉफ्टवेयर नियंत्रण का उपयोग करें । इस ज़ूम सेटिंग को देखने के सबसे बड़े वर्ग, स्कैन क्षेत्र पैदावार, और गैल्वेनोमीटर दर्पण के लिए सबसे बड़ा वोल्टेज/स्कैन कोण भेजता है ।
        नोट: डिफ़ॉल्ट विन्यास 12 मिमी नमूना के अंदर उद्देश्य आवर्धन द्वारा विभाजित करने के लिए अनुवाद करता है जो स्कैन सिर के अंदर देखने के 12 मिमी x 12 मिमी क्षेत्र के लिए है. इसलिए, एक 60x उद्देश्य लेंस की पैदावार २०० µm की छवियों को स्कैन 1x ऑप्टिकल ज़ूम में प्रति पक्ष । उच्च ऑप्टिकल ज़ूम मान कम क्षेत्र को स्कैन । 2x ऑप्टिकल ज़ूम अक्सर पूरे ंयूरॉंस visualizing के लिए सबसे उपयोगी सेटिंग है । 4x ंयूरॉंस के सेलुलर पहलुओं visualizing के लिए उपयोगी हो सकता है ।
      3. पिक्सेल की संख्या । 1x ऑप्टिकल ज़ूम पूरक करने के लिए, सॉफ्टवेयर नियंत्रण का उपयोग कर लाइन प्रति १०२४ x १०२४ पिक्सेल का चयन करें । पर कब्जा कर लिया और प्रदर्शित छवि में प्रति पंक्ति पिक्सेल की संख्या निर्धारित उद्देश्य लेंस से संभव विवरण खोना नहींहै । एक 60x/1.0 संख्यात्मक एपर्चर (NA) के लिए निंन व्यावहारिक पिक्सेल मानों का उपयोग करें उद्देश्य: ज़ूम 1 के लिए १०२४ x १०२४, ज़ूम 2 के लिए ५१२ x ५१२, और जूम 4 के लिए २५६ x २५६ । अंत पिक्सेल आकार (~ ०.१७ µm; 12 mm/आवर्धन/ज़ूम/पिक्सेल) आधा होना चाहिए, या कम, उद्देश्य लेंस द्वारा परिभाषित पार्श्व संकल्प की ।
        नोट: छवि संकल्प केवल लेजर तरंग दैर्ध्य द्वारा परिभाषित किया गया है और उद्देश्य एनए (०.४ µm संकल्प से दो-फोटॉन उत्साहित [2PE] ९२० एनएम और एक १.० ना उद्देश्य के साथ)27। पूर्ण उत्तेजना ना के लिए मानदंड, लेंस पर सूचीबद्ध के रूप में, यह है कि 1/ई लेजर बीम व्यास मैचों की तीव्रता (या "भरता है") प्रवेश द्वार शिष्य (2 x ट्यूब लेंस फोकल लंबाई x ना/आवर्धन) उद्देश्य लेंस के । यहां वर्णित प्रणाली में ट्यूब लेंस १८० मिमी की एक फोकल लंबाई है ।
      4. पिक्सेल निवास का समय . पिक्सेल निवास समय, एक उपयोगी डिफ़ॉल्ट मान के लिए 4 µs का चयन करने के लिए सॉफ़्टवेयर नियंत्रणों का उपयोग करें ।
        नोट: पिक्सेल निवास समय बदलने से पता चला मतलब संकेत बदल नहीं है; यह केवल अंतर पिक्सेल औसत को प्रभावित करता है और इन परिवर्तनों के माध्यम से छवि गुणवत्ता के माध्यम से visualized किया जा सकता है S/ छवि पिक्सेल निवास समय हमेशा ०.४ µs इकाइयों की एक बहु है, और बड़ा आवास बार के लिए 12-bit-प्रत्येक छवि पिक्सेल के सीमित तीव्रता मूल्य ०.४ µs नमूनों की औसत है । के बाद से एस/एन अनुपात में सुधार पिक्सेल प्रति समय के नमूनों की संख्या के वर्ग जड़ के रूप में (4 µs दस नमूनों के बराबर होती है, या s/n में ३.१६ गुना सुधार), छवि गुणवत्ता में सुधार बहुत 12 µs से बड़ा मूल्यों के लिए रिटर्न कम पहुंचता है ।
      5. स्कैन रोटेशन और ब्याज के क्षेत्र (रॉय) । छवि कोण सेट करने के लिए 0 ° रोटेशन सॉफ्टवेयर नियंत्रण का उपयोग (कोई क्रिया की जरूरत हो सकती है, के रूप में 0 ° रोटेशन सबसे इमेजिंग प्रणालियों के लिए डिफ़ॉल्ट सेटिंग है) । नमूना एक "उल्टा" अभिविन्यास में रखा गया है, तो छवि "फ्लिप" करने के लिए १८० ° रोटेशन का चयन करें.
        नोट: छवि घूर्णन, किसी भी कोण पर, एक भरे हुए सेल के हित के पूरे क्षेत्र के लिए एक बेहतर फिट प्रदान कर सकते हैं । रोटेशन भी संरचनात्मक परिवर्तन संरेखित करने के लिए और बाद में विश्लेषण करने के लिए एक स्पष्ट आधार उपज कर सकते हैं । किसी दिए गए ज़ूम (चरण 3.1.4.2) पर स्कैन की गई छवि में रुचि के किसी क्षेत्र का चयन करना मूल पिक्सेल संख्या (चरण 3.1.4.3) को बनाए रखता है, लेकिन क्षेत्र और पिक्सेल की कुल संख्या में प्रतिबंध नाटकीय रूप से फ़्रेम दर को बढ़ा सकता है, प्रदान संकेत परिवर्तन का बेहतर लौकिक संकल्प ।
      6. फ़्रेम औसत। सॉफ़्टवेयर नियंत्रणों का उपयोग करके 2 फ़्रेंस की प्रारंभिक फ़्रेम औसत सेटिंग का चयन करें ।
        नोट: अंतिम छवि कंट्रास्ट (S/N) द्वारा परिभाषित किया गया है कुल फोटॉनों एकत्र/पता लगाया छवि के संकेत पिक्सेल में । एकाधिक छवि फ़्रेम का औसत S/N अनुपात में सुधार कर सकते हैं, बशर्ते नमूना नहीं ले जाता है या इमेजिंग के दौरान ब्लीच नहीं है । ब्याज का संकेत है जबकि छवि में शोर औसत फ्रेम की संख्या के वर्ग जड़ से कम है फ्रेम के दौरान एक ही मूल्य रहता है । प्रतिदीप्ति छवियों में छोटे संरचनाओं अक्सर अंतर पिक्सेल औसत की आवश्यकता होती है, छवि के भीतर पिक्सल संयोजन (अक्सर ROIs कहा जाता है), और/ एक औसत करने के लिए चुनता है छवियों की संख्या से समय स्कैनिंग बढ़ जाती है फ्रेम.
    5. स्कैनिंग के समय नमूना स्थान को ओरिएंट करने के लिए पैन नियंत्रण, स्कैन रोटेशन, और ऑप्टिकल ज़ूम टूल का उपयोग करें. यदि मोटर चरण हेरफेर नमूना स्थिति के लिए आवश्यक है, बड़े कदम आकार से बचने के लिए एक्स, वाई, और जेड अक्ष उद्देश्य/संघनित्र collisions, कंपन, या लेजर बीम के प्रदर्शन को प्रतिबिंबित करने वाली सतहों को रोकने के लिए ।
  2. एक जेड-स्टैक लीजिए । Z-श्रृंखला उपकरण का उपयोग करके, किसी प्रारंभ और बंद स्थिति का चयन करें जिसमें रुचि का कक्ष हो । चुनें एक कदम आकार (1 µm) और फिर लगातार छवि हर Z में ंयूरॉन विमान है कि सेल शामिल है ।
    नोट: Z-स्टैक प्राप्ति सेटिंग्स ंयूरॉन प्रकार और भरण डाई के बीच अलग-अलग होगा । Z-स्टैक प्राप्ति के लिए इष्टतम पैरामीटर्स को लाइव इमेजिंग के लिए उपयोग किए गए पैरामीटर्स से स्वतंत्र निर्धारित किया जाना चाहिए । Z-स्टैक प्राप्ति से पहले और/या optopharmacology प्रयोगों के बाद किया जा सकता है । यदि संभव हो, 2PLSM से प्रेरित किसी भी सेलुलर नुकसान से बचने के लिए और छोटे सेलुलर डिब्बों के इष्टतम डाई भरने के लिए अनुमति देने के लिए optopharmacology के बाद जेड-स्टैक अधिग्रहण करते हैं ।

4. Electrophysiological रिकॉर्डिंग के दौरान लेजर फ्लैश Photolysis

नोट: ≥ 1 मेगावाट के ४०५ एनएम या ४७३ एनएम लेजर शक्तियों को लागू उद्देश्य और संघनित्र लेंस के गिलास के अंदर phosphorescence पैदा करता है । यह उत्पंन प्रकाश सीधे लेजर रोशनी शक्ति से संबंधित है; उत्सर्जन हरे और लाल वर्णक्रमीय खिड़कियों में मौजूद है और उत्साहित है एमएस रेंज में राज्य के जंमों । यह पृष्ठभूमि उत्तेजना विरूपण साक्ष्य सभी परीक्षण लेंस में देखा और पानी में उद्देश्य लेंस के सभी प्रमुख निर्माताओं से उद्देश्य लेंस डूबा है । संघनित्र लेंस उद्देश्य लेंस की तुलना में बहुत अधिक phosphorescence उत्पादन । यह "संकेत" संवेदनशील गैलियम आर्सेनाइड phosphide के संरक्षण के लिए यांत्रिक शटर का उपयोग करने के लिए प्रेरित (GaAsP) फोटो उत्तेजना घटनाओं के दौरान पीएमटी कैथोड । एक सामांय रूप से बंद यांत्रिक शटर का प्रयोग (बंद कर दिया जब सक्रिय रूप से स्कैनिंग नहीं) कूल्ड GaAsP PMTs की सुरक्षा के लिए सबसे अच्छा समाधान का प्रतिनिधित्व करता है ।

  1. के लिए एक hourglass प्रकार photostimulation बीम ज्यामिति, प्रकाश पथ प्रकाशिकी कि अंयथा संकीर्ण होगा में किसी भी ध्यान केंद्रित लेंस हटाने/लेजर बीम के रूप में यह उद्देश्य प्रवेश द्वार में प्रवेश करती है ।
  2. MarkPointsका उपयोग करके, एकल स्थान सेटिंग का चयन करें.
    नोट: अन्य फोटो-उत्तेजना सेटिंग्स (कई स्थानों, धब्बे का एक ग्रिड, सर्पिल स्कैनिंग) MarkPointsके भीतर संभव हैं । एकल स्थान सरलतम है । प्रयोगात्मक लक्ष्यों और जैविक मतभेदों को एक अलग सेटिंग जरूरत हो सकता है ।
  3. छवि को संक्षिप्त छवि और ब्याज के उपसेलुलर क्षेत्र का पता लगाने के लिए लाइव स्कैन विकल्प का उपयोग कर अद्यतन करें । समय पर ध्यान में किसी भी संभावित छोटे बहाव की पहचान करने के लिए छवि को अद्यतन करें ।
  4. ऑप्टिकल ज़ूम बढ़ाने के लिए सॉफ़्टवेयर नियंत्रणों का उपयोग करें (यानी, वर्तमान से एक उच्च ऑप्टिकल ज़ूम सेटिंग का चयन करें), यदि आवश्यक हो, तो छोटे संरचनाओं (यानी, spins या बाहर का dendrites) को विज़ुअलाइज़ करने के लिए ।
  5. MarkPoints एकल स्थान क्रॉसहेयर तुरंत आसंन (~ ०.५ माइक्रोन) सेल झिल्ली के लिए जगह है । एक सेलुलर सुविधा पर सीधे फोटो-उत्तेजना जगह नहीं है, के रूप में यह धूप के लिए नेतृत्व कर सकता है ।
  6. MarkPointsमें सॉफ्टवेयर नियंत्रण का उपयोग कर फोटो-उत्तेजना के लिए पैरामीटर सेट करें । प्रारंभिक दिशानिर्देशों निम्नानुसार लागू करें: 1-50 एमएस अवधि, 1-4 मेगावाट लेजर पावर, और ≥ 1 परीक्षण ।
  7. MarkPoints प्रोटोकॉल आरंभ करने और वास्तविक समय में इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी डेटा प्राप्ति का निरीक्षण करने के लिए चलाएं MarkPoints का चयन करें ।
  8. दोहराएँ चरण 4.2-4.7 कई बार संगतता और स्थिरता का मूल्यांकन करने के लिए, या उसके अभाव, प्रतिक्रिया आयाम और कैनेटीक्स.

Representative Results

photolysis उत्तेजना के लिए, जोखिम खुराक (तीव्रता और समय), एक्सपोजर स्थान, और बीम ज्यामिति कुंजी चर रहे हैं । प्रणाली इस लेख में वर्णित दो अलग photostimulation मुस्कराते हुए सक्षम है, photostimulation प्रकाश पथ से बाहर में एक लेंस चलती के माध्यम से समायोज्य है पहले बीम गैल्वेनोमीटर प्रणाली में प्रवेश करती है । इस लेंस के बिना, photostimulation बीम 60x के प्रवेश द्वार के पुतले भरता/1.0 NA पानी की सूई [60x WD] उद्देश्य, एक के पास उत्पादन-विवर्तन-सीमित, उप µm के नमूने के अंदर फोकल विमान में जगह है । यह एक hourglass आकार के साथ photostimulation प्रकाश के साथ जुड़ा हुआ है, ऊपर और ऑप्टिकल धुरी के साथ फोकल स्पॉट सममित नीचे का विस्तार । पथ में डाला लेंस के साथ, photostimulation लेजर प्रकाश उद्देश्य लेंस के प्रवेश द्वार में केंद्रित है और फिर एक पेंसिल की तरह बीम के रूप में बाहर निकलता है । इस बीम, जो एक 60x उद्देश्य के लिए व्यास में ~ 10 µm होने की उंमीद है, नमूना भर में समान रूप से फैली/ इस विधा में, उत्तेजना स्थान के भीतर किसी भी स्थान पर प्रकाश की तीव्रता के पास विवर्तन-सीमित छोटी जगह की तीव्रता का ~ 1% होगा । इस प्रकार, उच्च लेजर शक्तियों आमतौर पर आवश्यक है जब का उपयोग कर ~ 10 µm जगह उत्तेजना । इस आलेख में रिपोर्ट किए गए सभी प्रयोगों के लिए, एक hourglass-प्रकार photostimulation बीम का उपयोग किया गया था ।

दिया नमूना शक्ति इनपुट वोल्टेज की स्थापना के खिलाफ साजिश रची जा सकता है, एक बिजली मीटर का उपयोग कर नमूना पर लेजर शक्ति को मापने के बाद. इन अध्ययनों से 2 मिमी के काम की दूरी के साथ एक 60x WD उद्देश्य का उपयोग करें, लेकिन यह डिटेक्टर तत्व को संभावित नुकसान से बचने के लिए बिजली की माप के लिए पानी में जलमग्न नहीं है. जब सूचीबद्ध NA > ०.९५ के साथ उद्देश्य (विसर्जन द्रव के बिना) हवा में मापा जाता है, तो कम सूचकांक (हवा) के कारण लेंस सामने चेहरा तत्व पर कुल आंतरिक प्रतिबिंब हानि हो सकती है । इस मामले में, एक और अधिक सटीक नमूना शक्ति मापन के लिए (कुल आंतरिक प्रतिबिंब नुकसान के लिए सही करने के लिए), १.० न उद्देश्य (1.0/0.95)2 हवा में मापा द्वारा मापा शक्ति में वृद्धि । चित्र 1a इस अध्ययन में लेजर प्रक्षेपण प्रणाली में शामिल कर रहे हैं कि ४०५ एनएम और ४७३ एनएम दिखाई पराबैंगनीकिरण के लिए एक ठेठ इनपुट/आउटपुट प्लॉट दिखाता है । इन लेजर सिस्टम फोटो उत्तेजना के लिए आदर्श है जोखिम खुराक नियंत्रण निंनलिखित कारणों के लिए: (1) वे पूर्व सीधे रैखिक बिजली उत्पादन इनपुट वोल्टेज के सापेक्ष प्रदान करने के लिए तुले हुए हैं (0-5 V), (2) वे एक मूक शटर आपरेशन प्रदान (कोई लेजर के साथ आउटपुट), और (3) वे तेजी से है, उप एमएस तीव्रता पल्स अवधि नियंत्रण (०.१ ms प्रतिक्रिया). एक लेज़र/galvo प्रणाली के साथ स्पॉट फोटो-उत्तेजना का उपयोग करते समय, MarkPoints धब्बे की दिनचर्या अंशांकन एक आवश्यक कार्य है । चित्र 1b (बाएं पैनल) एक प्रणाली है कि अंशांकन से बाहर है दर्शाता है (फोटो के लिए वांछित बिंदु-उत्तेजित उस बिंदु की सही उत्तेजना में परिणाम नहीं है, के रूप में जला छेद स्थान द्वारा संकेत), अंशांकन के बाद घटनास्थल की सटीक स्थिति के लिए एक वापसी के साथ ( चित्र 1b, दायां फलक) ।

पीए-एनआईसी शील फ्लोरोसेंट (उत्सर्जन पीक पर ~ ५१० एनएम), 350-450 एनएम (1-फोटॉन उत्तेजना) या 700-900 एनएम (2-फोटॉन उत्तेजना)5के बीच प्रभावी उत्तेजना का प्रदर्शन । स्थानीय आवेदन के दौरान pa-एनआईसी कल्पना करने के लिए, pa-एनआईसी (1 मिमी) मस्तिष्क ऊतक के एक साथ इमेजिंग के बाद के पास लागू किया गया था (1) मस्तिष्क ऊतक ऑप्टिकल Dodt कंट्रास्ट के माध्यम से खोदी संचरण संदर्भ और (2) उत्तेजना से उत्सर्जित प्रतिदीप्ति (९०० एनएम) के पीए-एनआईसी. pa-एनआईसी 2PE प्रतिदीप्ति एक स्थानीय अनुप्रयोग पिपेट (चित्रा 2a) से दबाव इंजेक्शन के दौरान आसानी से detectable था. निकोटीन और एक monoalkylcoumarin, 7-carboxymethylamino-4-मिथाइल अनंतमूलि, पीए-एनआईसी photolysis रिएक्शन5के मुख्य photochemical उत्पाद हैं । एक ही इमेजिंग सेटिंग्स/पैरामीटर जो PA-Nic इमेजिंग के लिए उपयोग किए गए थे का उपयोग करते हुए, ऊतक या तो निकोटीन (1 मिमी) या 7-carboxymethylamino-4-मिथाइल अनंतमूलि (1 मिमी) के वितरण के दौरान imaged था । कोई फ्लोरोसेंट संकेत (चित्रा 2a, मध्य और निचले पैनलों) का पता चला था, फिलीस्तीनी अथॉरिटी-एनआईसी परिणामों की विशिष्टता का प्रदर्शन । अंत में, पीए-एनआईसी मस्तिष्क ऊतक और फिलीस्तीनी अथॉरिटी-एनआईसी प्रतिदीप्ति उत्सर्जन के भीतर लागू किया गया था imaged (चित्रा बी) था । इस दृष्टिकोण की पुष्टि करता है कि पीए-एनआईसी स्थानीय आवेदन पिपेट के 100-200 µm के भीतर मौजूद है । एक साथ, इन आंकड़ों की पुष्टि है कि PA-एनआईसी प्रभावी ढंग से स्थानीय आवेदन के माध्यम से मस्तिष्क ऊतक के लिए दिया जाता है ।

इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिकॉर्डिंग सेलुलर संरचनाओं के दृश्य के लिए एक साथ 2PLSM के साथ प्रयोग के दोनों घटकों के लिए विचार संतुलन के लिए जांचकर्ता की आवश्यकता है, और अक्सर एक संकीर्ण समय खिड़की (~ 20 मिनट) वैध के लिए उपलब्ध है नमूना डेटा प्राप्ति एक समझौता कक्ष से । सेलुलर दृश्य पर विचार किए बिना, यह सबसे अच्छा अभ्यास के रूप में तोड़ने के बाद जितनी जल्दी हो सके रिकॉर्डिंग शुरू करने के लिए है क्योंकि रिकॉर्डिंग स्थिरता समय के साथ गिरावट के लिए जाता है । हालांकि, जब इमेजिंग एक आवश्यकता है, electrophysiological विचार प्रतिदीप्ति एकाग्रता बढ़ जाती है के लिए पर्याप्त समय की अनुमति चाहिए छोटे/ यह वक्र28भरने के लिए एक डाई एकाग्रता का परीक्षण करके उदाहरण है, जो कभी जब इमेजिंग एक नया सेल प्रकार प्राप्त करने के लिए उपयोगी है । चित्रा 3 कई उदाहरण 2PLSM के माध्यम से Z-पोट के रूप में छवि ंयूरॉंस से पता चलता है और प्रस्तुति प्रयोजनों के लिए एक अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण में ढह गई । 3 ए चित्रा उच्च गुणवत्ता वाले चित्रों से पता चलता है जहां न्यूरॉन आकृति पूर्ण होने के लिए प्रकट होता है, शोर छोटा है, और मलबे सेलुलर आकृति विज्ञान की व्याख्या के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है. चित्रा बी एक कम संकेत करने वाली पृष्ठभूमि अनुपात और पर्याप्त मलबे के कारण, कम गुणवत्ता की छवियों से पता चलता है. इस मलबे अक्सर तीव्र प्रतिदीप्ति के गोलाकार जेब के रूप में प्रकट होता है, पैच पिपेट से इमेजिंग डाई के इंजेक्शन से उत्पंन करते हुए सेल आ । विशेष रूप से, स्नान में १०० µ एम PA-एनआईसी का समावेश (स्नान आवेदन प्रदर्शन करते समय) संकेत करने वाली पृष्ठभूमि अनुपात को कम करने के लिए जाता है और उप इष्टतम छवि कंट्रास्ट की ओर जाता है । Alexa Fluor ५६८ या ५९४ अक्सर काफी एक खोजक डाई के रूप में या एक सामान्य 2PE संदर्भ के रूप में स्थानीय आवेदन प्रयोगों में उपयोगी है/ इन रंगों के दो-फोटॉन उत्तेजना के लिए एक प्रभावी तरंग दैर्ध्य है ~ ७८० एनएम27, जो पीए एनआईसी और सेलुलर डिब्बों की पहचान के एक साथ दृश्य की अनुमति देता है । यह तरंग दैर्ध्य, तथापि, PA-Nic5के दो-फोटॉन photolysis पूरी तरह से बचने नहीं है । Alexa Fluor ४८८ PA-एनआईसी स्नान में लाभप्रद है-आवेदन प्रयोगों; जब एक उपयुक्त तरंग दैर्ध्य ≥ ९०० एनएम के साथ उत्तेजित, दो-पीए-एनआईसी5 के फोटॉन photolysis से बचा जा सकता है, जबकि अभी भी सेलुलर डिब्बों के उपयुक्त दृश्य बनाए रखने ।

चित्रा 4 स्थानीयकृत पीए के लिए उदाहरण डेटा दिखाता है-एनआईसी लेजर फ़्लैश photolysis मस्तिष्क स्लाइस में एमएचबी न्यूरॉन्स पर. चित्र 4a (ऊपरी पैनलों) एक "संदर्भ" छवि है, जो एक स्क्रीन पिछले 2PLSM MarkPoints प्रोटोकॉल से पहले लिया छवि का कब्जा है का एक उदाहरण से पता चलता है, फोटो उत्तेजना जगह स्थान के साथ मढ़ा । चित्र 4a (कम छवि पैनलों) तस्वीर उत्तेजना सेलुलर आकृति विज्ञान पर मढ़ा स्पॉट के एक ज़ूम दृश्य से पता चलता है । इसी समय-PA-Nic photolysis के लिए संबंधित electrophysiological प्रतिक्रिया चित्रा 4aके निचले पैनलों में दिखाया गया है. पिछले काम का प्रदर्शन किया है कि इन धाराओं nAChR विरोधी5के प्रति संवेदनशील हैं । चित्रा 4b जहां एकल स्थान photolysis या तो 1 एस या 10 एस के अंतराल पर प्रदर्शन किया गया था विभिंन कोशिकाओं से प्रतिनिधि डेटा दिखाता है । जबकि एक 10 एस अंतराल की अनुमति दी आधारभूत वर्तमान होल्डिंग के लिए पर्याप्त वसूली समय, एक छोटे 1 एस अंतराल के नेतृत्व में एक होल्डिंग वर्तमान में क्रमिक वृद्धि के रूप में प्रोटोकॉल आगे बढ़ना । बढ़ती वर्तमान पता चलता है कि निकोटीन पर्याप्त समय के लिए 1 हर्ट्ज अंतराल29के साथ प्रणाली से दूर फैलाना नहीं था । nAChRs के neuropharmacology कक्ष प्रकार के बीच अलग हो सकता है के रूप में इस तरह के लौकिक प्रतिक्रिया विश्लेषण, किसी भी नए सेल प्रकार का अध्ययन किया जा रहा है पर de नोवो किया जाना चाहिए ।

Figure 1
चित्रा 1: Photostimulation लेजर अंशांकन । (क) फोटो-उत्तेजना लेजर बिजली उत्पादन । नमूना विमान में बिजली (एक 60x/1.0 ना पानी की सूई उद्देश्य के माध्यम से) ४०५ एनएम और ४७३ एनएम फोटो के लिए मापा गया था संकेत उत्पादन सेटिंग में लेजर उत्तेजना । (ख) फोटो-उत्तेजना लेजर अंशांकन । स्क्रीन कैप्चर छवियां इच्छित फ़ोटो उत्तेजना स्थान और इसी स्थान के बीच स्थानिक संबंध दिखाती हैं, जहां फ़ोटो-उत्तेजना (बाएं) से पहले और (दाएं) MarkPointsमें अंशांकन चलाने के बाद (बर्न-होल) होती है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: फिलीस्तीनी अथॉरिटी-एनआईसी स्थानीय अनुप्रयोग । (a) एक स्थानीय अनुप्रयोग पिपेट से PA-Nic का पता लगाना. 1 मिमी पीए-एनआईसी, photolysis द्वारा उत्पाद, या निकोटीन ACSF में भंग किया गया, एक स्थानीय अनुप्रयोग पिपेट में भरी हुई, और 2PLSM (९०० एनएम उत्तेजना) इमेजिंग के दौरान मस्तिष्क के ऊतकों पर तिरस्कृत प्रत्येक दवा के लिए एक ही इमेजिंग सेटिंग्स का उपयोग कर. लेजर स्कैनिंग Dodt इसके विपरीत संचरण छवि से पता चलता है ऊतक/पिपेट जबकि एक GaAsP कैथोड पीएमटी प्रतिदीप्ति उत्सर्जन को पकड़ने के लिए इस्तेमाल किया गया था । (ख) pa-एनआईसी (1 मिमी) मस्तिष्क ऊतक में perfused और 2PLSM के माध्यम से imaged में किया गया था (क) अपने आंतरिक प्रतिदीप्ति का उपयोग कर पीए-एनआईसी के पार्श्व प्रसार को दिखाने के लिए. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3:2 के अधिग्रहण-फोटॉन लेजर माइक्रोस्कोपी छवियों स्कैनिंग । (क) इष्टतम 2PLSM Z-पोट । 2PLSM Z-स्टैक अधिकतम तीव्रता अनुमानों के दो उदाहरण अच्छी तरह से हल dendrites और कोई हस्तक्षेप मलबे के लिए थोड़ा के साथ एमएचबी न्यूरॉन्स के लिए दिखाए जाते हैं. (ख) उप इष्टतम 2PLSM Z-पोट । 2PLSM के दो उदाहरण Z-स्टैक अधिकतम तीव्रता अनुमानों एमएचबी न्यूरॉन्स मलबे से घिरा के लिए दिखाए जाते हैं (सेल दृष्टिकोण के दौरान पिपेट से निष्कासित डाई). ऐसी छवियों को (a) में दिखाए गए लोगों की तरह छवियों से व्याख्या करने के लिए और अधिक कठिन हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: पीए-एनआईसी के लेजर फ्लैश photolysis । (क) MarkPoints संदर्भ छवियां और आवक धाराओं फिलीस्तीनी अथॉरिटी द्वारा पैदा-एनआईसी photolysis । एक एमएचबी ंयूरॉन के लिए, कच्चे संदर्भ छवियों MarkPoints फोटो उत्तेजना परीक्षणों के लिए एक एकल (संकेत) सेलुलर स्थान पर दिखाया गया है । ध्यान दें कि कुछ फोटो-उत्तेजना स्थानों के लिए (इस श्रृंखला में सही-सबसे छवि), वृक्ष संरचना ध्यान में है, लेकिन सोमा और समीपस्थ dendrite नहीं कर रहे हैं । प्रत्येक संदर्भ छवि के नीचे, निकोटीन uncaging-पैदा आवक वर्तमान साजिश रची है । (ख) पीए-एनआईसी photolysis के लिए अंतर-उत्तेजना अंतराल । अनुकरणीय रिकॉर्डिंग एमएचबी न्यूरॉन्स के लिए दिखाया गया है जहां निकोटीन एक अंतर उत्तेजना अंतराल के साथ एक ही perisomatic स्थान पर एक बार uncage किया गया था 1 s या 10 एस. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

PA-एनआईसी आवेदन/वितरण विधि का चुनाव इस स्थानीयकृत फोटो उत्तेजना तकनीक में सबसे महत्वपूर्ण कदम है । दो तरीकों, स्नान आवेदन और स्थानीय छिड़काव, प्रत्येक प्रस्ताव अलग लाभ और सीमाएं हैं । चुनाव मुख्यतः ब्याज के सेल प्रकार में nAChR कार्यात्मक अभिव्यक्ति स्तर से प्रभावित है । यह अक्सर स्नान आवेदन का उपयोग करने के लिए बेहतर है जब कार्यात्मक अभिव्यक्ति स्तर उच्च रहे हैं, के रूप में स्नान आवेदन एक वर्दी जांच दर्ज की गई सेल के आसपास एकाग्रता के लिए अनुमति देता है, डेटा व्याख्या की सुविधा । स्नान आवेदन भी ऊतक में एक दूसरे छिड़काव पिपेट के लिए की जरूरत समाप्त, पूरी प्रक्रिया को आसान बनाने. हालांकि, महंगे यौगिकों के स्नान आवेदन प्रयोग प्रति अधिक लागत ।

आमतौर पर, समस्या निवारण क्यों कोई nAChR सक्रियण फ़्लैश photolysis निंनलिखित देखा है समझने की कोशिश कर शामिल है । जब एक सेल प्रकार है कि पहले PA-एनआईसी के साथ अध्ययन नहीं किया गया है के साथ काम कर रहे, जांचकर्ता स्थानीय कश-के आवेदन करना चाहिए या निकोटीन के लिए निर्धारित है कि पर्याप्त रिसेप्टर्स कार्यात्मक5व्यक्त कर रहे हैं । सत्यापित करने के लिए कि प्रणाली photolysis प्रतिक्रियाओं का पता लगाने में सक्षम है, नियंत्रण प्रयोगों औसत दर्जे का habenula ंयूरॉंस में किया जाना चाहिए कि बड़ी मात्रा में रिसेप्टर30व्यक्त करते हैं । इस मस्तिष्क क्षेत्र में, PA-एनआईसी स्नान आवेदन संभव है, जो सत्यापन प्रयोगों के लिए बेहतर है । केवल ये मांयता प्रयोग करने के बाद एक को एक अध्ययन कक्ष प्रकार पर ले जाना चाहिए । यदि प्रयोगात्मक प्रणाली को मान्य किया गया है और प्रतिक्रियाओं बहुत छोटे या undetect रहते हैं, यह PA-Nic की एकाग्रता में वृद्धि करने के लिए वारंट किया जा सकता है, फ्लैश तीव्रता या नाड़ी अवधि में वृद्धि, nAChR को बढ़ाने के लिए एक nAChR सकारात्मक allosteric संग्राहक जोड़ें गतिविधि6, या इनमें से कुछ संयोजन ।

कभी-कभार, uncaging प्रतिसाद भी बड़े होते हैं, जिनमें महत्वपूर्ण nAChR सक्रियण के साथ अप्रत्यक्ष वोल्टेज gated Na+ चैनल सक्रियण और अनबंद आवक धाराओं के कारण खराब स्थान दबाना होता है. इन कलाकृतियों, जो पूरी तरह से अस्पष्ट nAChR आवक धाराओं और डेटा व्याख्या असंभव बनाने, रिकॉर्डिंग पिपेट में QX-३१४ (2 मिमी) के शामिल किए जाने से समाप्त किया जा सकता है । वे भी पीए एनआईसी की एकाग्रता को कम करने या फ्लैश तीव्रता या नाड़ी अवधि को कम करने से समाप्त किया जा सकता है । सभी दृश्य प्रकाश फोटो उत्तेजना प्रयोगों में, देखभाल जब उत्तेजना साइटों का चयन करने के लिए अनायास उत्तेजना/photolysis ऊपर या नीचे वांछित फोकल विमान से बचने के लिए प्रयोग किया जाना चाहिए । इसके अतिरिक्त और जब लागू, लेजर शक्ति हमेशा शारीरिक प्रतिक्रियाओं को पुन: पेश करने के लिए titrated होना चाहिए । यह विशेष रूप से जेड के बारे में पता होना महत्वपूर्ण है अक्ष photostimulation जब बंदी लाइगैंडों के साथ काम कर रहे हैं, के रूप में लाइगैंडों कि ऊपर/फोकल स्पॉट नीचे अभी भी फैलाना और जैविक प्रणाली (यानी के साथ बातचीत कर सकते हैं, रिसेप्टर्स) अध्ययन के तहत ।

पीए-एनआईसी लेजर फ्लैश photolysis सभी जांचकर्ताओं के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है, के रूप में कई सीमाएं मौजूद हैं । पहले एक उपयुक्त सेट अप की अपेक्षाकृत उच्च लागत है । जब बरकरार मस्तिष्क स्लाइस के साथ काम कर रहे हैं, dendrites की तरह छोटे व्यास संरचनाओं के पास uncaging एक परिष्कृत दृश्य प्रणाली जैसे एक 2-फोटॉन माइक्रोस्कोप के रूप में की आवश्यकता है । एक तिवारी की उच्च लागत के अलावा: नीलमणि, स्वरित्र आईआर स्पंदित लेजर 2 प्रदर्शन के लिए-फोटॉन माइक्रोस्कोपी, एक दोहरे गैल्वेनोमीटर प्रणाली स्वतंत्र रूप से स्थिति में सक्षम दो लेजर बीम आगे प्रणाली लागत बढ़ जाती है । कुल सिस्टम लागत एक घर निर्मित प्रणाली का उपयोग करके कम किया जा सकता है अगर अन्वेषक पर्याप्त विशेषज्ञता और निर्माण करने के लिए समय है, समस्या निवारण, और इस तरह के एक प्रणाली को बनाए रखने. एक दूसरी सीमा अक्सर कम nAChR कार्यात्मक अभिव्यक्ति है, जो आंशिक रूप से कदम उठाने के रूप में ऊपर उल्लेख किया है, लेकिन यह सफलता की गारंटी नहीं हो सकता है का शमन शामिल है । आमतौर पर, अगर एक उपाय नहीं कर सकते ligand-सक्रिय धाराओं के बाद पफ-एगोनिस्ट के आवेदन, फिलीस्तीनी अथॉरिटी-एनआईसी फ्लैश photolysis वोल्टेज दबाना के तहत स्वीकार्य परिणाम नहीं हो सकता है । एक तीसरी सीमा पीए एनआईसी के आंतरिक प्रतिदीप्ति शामिल है । pa-एनआईसी अवशोषित ~ ४०५ एनएम प्रकाश और हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन के रूप में एक समान श्रेणी में उत्सर्जन करता है (GFP) या Alexa ४८८5। जब पीए-एनआईसी सांद्रता ~ 1 मिमी से अधिक है, इस प्रतिदीप्ति संपत्ति यह एक साथ करने के लिए चुनौतीपूर्ण ंयूरॉंस संरचनाओं कल्पना कर सकते हैं । इस को कम करने के लिए, यह छिड़काव पिपेट से पीए-एनआईसी के प्रवाह को आसानी से नियंत्रित करने के लिए सक्षम होना करने के लिए महत्वपूर्ण है । समय पर, PA-एनआईसी प्रवाह फ्लोरोसेंट अणुओं को दूर फैलाना करने की अनुमति देने के लिए बंद कर दिया गया था । इस uncaging बीम के स्थान की स्थिति की जाँच के लिए ंयूरॉन के पुनः इमेजिंग की अनुमति दी । उल्लेख करने के लिए एक चौथी संभावित सीमा photolysis के लिए ४०५ एनएम प्रकाश का उपयोग शामिल है । ऐसे ४०५ एनएम के रूप में छोटे तरंग दैर्ध्य और अधिक जटिल ऊतक में एक मस्तिष्क टुकड़ा के रूप में तितर बितर करने के लिए प्रवण हैं । इस प्रकार, एक दिया फ्लैश तीव्रता और अवधि में, uncaging प्रतिक्रिया आयाम और क्षय कैनेटीक्स अंतर से स्लाइस के भीतर uncaging ध्यान की गहराई से प्रभावित हो सकता है । nAChRs के जैविक पहलुओं के बारे में निष्कर्ष खाते में इस महत्वपूर्ण चेतावनी लेना चाहिए ।

इस स्थानीयकृत लेजर फ़्लैश photolysis तकनीक हाल ही में nAChR तंत्रिका जीव विज्ञान के बारे में नए विवरण को उजागर किया गया है । उदाहरण के लिए, जीर्ण निकोटीन जोखिम औसत दर्जे का habenula ंयूरॉंस में perisomatic और वृक्ष nAChR समारोह को बढ़ाता है5। यह भी प्रदर्शन में मदद करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, पहली बार के लिए, कि ventral tegmental क्षेत्र ग्लूटामेट ंयूरॉंस उनके perisomatic और वृक्ष सेलुलर कंपार्टमेंट6में कार्यात्मक nAChRs व्यक्त करते हैं । इस तकनीक के कई संभावित भविष्य का उपयोग करता है, और दृष्टिकोण अंय प्रमुख ंयूरॉन प्रकार है कि nAChRs व्यक्त करने के लिए जाना जाता है के लिए लागू किया जा सकता है, जैसे cortical हवामहल न्यूरॉन्स31 या न्यूरॉन्स सेरेब्रल प्रांतस्था में३२, striatum३३ , व हिप्पोकैम्पस19. इस तकनीक को भी औषध विज्ञान और/या nAChR जीन संपादन३४ के साथ जोड़ा जा सकता है अलग ंयूरॉन डिब्बों के लिए विशिष्ट रिसेप्टर उपप्रकारों information । दृष्टिकोण आसानी से अंय अनंतमूलि-बंदी यौगिकों, सहित के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, लेकिन तक सीमित नहीं है, उन फिलीस्तीनी अथॉरिटी के साथ समानांतर में विकसित-एनआईसी5। अंत में, PA-एनआईसी फ़्लैश photolysis एक दिन में इस्तेमाल किया जा सकता है एक जाग/व्यवहार जानवर उपंयास व्यवहार औषधि मानदंड में है निकोटीन कार्रवाई का अध्ययन ।

Disclosures

D.L.W. Bruker नैनो प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए एक भुगतान सलाहकार के रूप में कार्य करता है ।

Acknowledgments

लेखक निंनलिखित उत्तर पश्चिमी मुख्य जांचकर्ताओं के प्रयोगशाला सदस्यों को धंयवाद: रयान Drenan, डी जेंस Surmeier, Yevgenia Kozorovitskiy, और अनीस ठेकेदार । यह काम अमेरिका के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (NIH) (पलाश DA035942 और DA040626 को R.M.D.), PhRMA फाउंडेशन (M.C.A. को फैलोशिप), और HHMI द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Instruments, Consumables, and Miscellaneous Chemicals
Multiclamp 700B Molecular Devices Corp. Patch clamp amplifier
Pneumatic Picopump World Precision Instruments PV820
Micropipette puller Sutter Instrument Co P-97
Temperature Controller Warner Instruments TC-324C
Vibrating blade microtome Leica Biosystems VT1200S
Ultrafree-MC Centrifugal Filter MilliporeSigma UFC30GV0S internal solution filter
Borosilicate Glass Capillaries World Precision Instruments 1B150F-4 patch and local application pipette
(-)-Nicotine hydrogen tartrate salt Glentham GL9693 nicotine salt
7-carboxymethylamino-4-methyl coumarin Janelia Research Campus PA-Nic by-product
1-[7-[bis(carboxymethyl)- amino]coumarin-4-yl]methyl-nicotine Janelia Research Campus PA-Nic
Euthasol (Pentobarbital Sodium and Phenytoin Sodium) Virbac ANADA #200-071
Alexa FluorTM 488 Hydrazide ThermoFisher A10436 green fill dye
Alexa FluorTM 568 Hydrazide ThermoFisher A10437 red fill dye
6-carboxy-AF594 (Alexa Fluor 594) Janelia Research Campus red fill dye
QX 314 chloride Tocris 2313 voltage-gated sodium channel blocker
Power Meter  ThorLabs S120C
Name Company Catalog Number Comments
Chemicals for Solutions
N-Methyl-D-glucamine Sigma M2004
Potassium chloride Sigma P3911
Sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma S9638
Sodium bicarbonate Sigma S6014
HEPES Sigma H3375
D-(+)-Glucose Sigma G5767
(+)-Sodium L-ascorbate Sigma A4034
Thiourea Sigma T8656
Sodium pyruvate Sigma P2256
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma 230391
Calcium chloride dihydrate Sigma 223506
Sodium chloride Sigma S9625
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid Sigma E3889
Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt Sigma A9187
Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate Sigma G8877
Name Company Catalog Number Comments
Components of 2-Photon Microscope
 Ultima Laser Scanner for Olympus BX51 Microscope Bruker Nano, Inc. imaging software and galvos
    Imaging X-Y galvanometers Cambridge Technology
        Mai Tai HP1040 Spectra-Physics Tuneable IR laser
            Pockels cell M350-80-02-BK with M302RM Driver Conoptics, Inc. for IR laser attenuation
                Integrating Sphere Photodiode Power Sensor Thorlabs, Inc laser power pick-off photodiode
    Uncaging X-Y galvanometers Cambridge Technology
        Helios 2-Line Laser Launch Bruker Nano, Inc. uncaging laser components
            OBIS LX/LS 405 nm (100 mW) Coherent, Inc.
            OBIS LX/LS 473 nm (75 mW) Coherent, Inc.
            Point-Photoactivation / Fiber Input Module for Limo Sidecar - Uncaging Bruker Nano, Inc.
Name Company Catalog Number Comments
Upright Microscope  Olympus BX51WIF Upright microscope chasis
    Objective: Olympus M Plan FL 10x; NA 0.3 WD 11 mm  Olympus 10x objective
    Objective: Olympus M Plan Fluorite 60x/1.0 WD=2mm NIR  Olympus 60x water-dipping objective
    X-Cite 110, four-LED LLG coupled epi-fluorescence light source Excelitas Technologies LED Light Source
        Epi-Fluorescence Filter: ET-GFP (FITC/CY2) for Epi-Turret Chroma Technologies LED Filter for blue light excitation
        Epi-Fluorescence Filter: ET-DsRed (TRITC/CY3) for Epi-Turret Chroma Technologies LED Filter for green light excitation
    B&W CCD camera; Watec, 0.5 in B/W CCD Watec Co., LTD. CCD camera for patch clamp recording
Name Company Catalog Number Comments
External Detectors - Dual Reflected Emission - Olympus Upright (Multi-Alkali, GaAsP) Bruker Nano, Inc.
    Multi-alkali side-on PMT Hamamatsu R3896 red channel PMT
        595/50m Chroma Technologies red channel emission filter
            565lpxr Chroma Technologies dichroic beam splitter
    GaAsP end-on PMT Hamamatsu 7422PA-40 green channel PMT
        525/70m Chroma Technologies green channel emission filter
            High-Speed Shutter for Hamamatsu H7422 PMT Vincent Associates / Bruker 517329 PMT shutter mount
Name Company Catalog Number Comments
Dodt Gradient Contrast Transmission Detection Module Bruker Nano, Inc.
    Multi-alkali side-on PMT Hamamatsu R3896 Dodt PMT

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक १४३ Photolysis uncaging निकोटीन कोलीनर्जिक कोर्टेक्स 2-फोटॉन इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी इमेजिंग रिसेप्टर acetylcholine
Photoactivatable निकोटीन के लेजर फ्लैश Photolysis के माध्यम से माउस मस्तिष्क स्लाइस में कोर्टेक्स Acetylcholine रिसेप्टर समारोह की जांच
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Arvin, M. C., Wokosin, D. L., Banala, S., Lavis, L. D., Drenan, R. M. Probing Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices via Laser Flash Photolysis of Photoactivatable Nicotine. J. Vis. Exp. (143), e58873, doi:10.3791/58873 (2019).

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