대장균-셀 무료 단백질 합성 기반: 강력 하 고 유연 하며 액세스할 수 있는 플랫폼 기술에 대 한 프로토콜

Max Z. Levine; Nicole E. Gregorio; Michael C. Jewett; Katharine R. Watts; Javin P. Oza

doi:10.3791/58882

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방법 논문

대장균-셀 무료 단백질 합성 기반: 강력 하 고 유연 하며 액세스할 수 있는 플랫폼 기술에 대 한 프로토콜

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DOI:

10.3791/58882

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2019년 2월 25일

Max Z. Levine^*¹^,² , Nicole E. Gregorio^*²^,³ , Michael C. Jewett⁴^,⁵^,⁶^,⁷ , Katharine R. Watts²^,³ , Javin P. Oza²^,³

¹Department of Biological Sciences, California Polytechnic State University, San Luis Obispo, ²Center for Applications in Biotechnology, California Polytechnic State University, San Luis Obispo, ³Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University, ⁴Department of Chemical and Biological Engineering, Northwestern University, ⁵Chemistry of Life Processes Institute, Northwestern University, ⁶Center for Synthetic Biology, Northwestern University, ⁷Interdisciplinary Biological Sciences Program, Northwestern University

^* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜 세부 단계, 비용, 그리고 대장균을 생성 하는 데 필요한 장비-셀 추출 물 및 단백질 합성 반응을 시험관에서 4 일 안에 구현. 광범위 한 응용 프로그램에 대 한이 플랫폼의 유연한 특성을 활용 하 여 우리는 적응 되 고 최적화 될 수 있는 반응 조건 논의.

초록

지난 50 년 동안 셀 무료 단백질 합성 (CFPS)는 시험관 내에서 셀의 transcriptional 변환 용량을 활용 하는 강력한 기술으로 떠오르고 있다. 고, 세포의 생존 능력을 유지 하는 필요를 만듦으로써 세포 장벽을 제거 함으로써, CFPS 되었습니다 전통적으로 도전 단백질의 biomanufacturing에 신흥 응용 프로그램 뿐만 아니라 응용 프로그램에 기초에 대 한 신속한 프로토 타입 대사 공학 및 기능 유전체학 대장균을 구현 하기 위한 우리의 방법-CFPS 플랫폼을 기반으로 새 사용자가 이러한 응용 프로그램의 대부분을 액세스할 수 허용. 여기, 우리는 풍부한 미디어, 당황 하 고 플라스 크와 가변 쥡니다 기반 세포 세포의 용 해의 재현 방법을 통해 추출 준비 하는 방법을 설명 합니다. 그 적절 한 시 약 주식 미리 준비 된이 추출 다음 단백질 발현 데이터 분석, 실험적인 체제에서 단지 5 h에서 슈퍼 폴더 녹색 형광 단백질 (sfGFP)의 900 µ g/mL 이상의 생산 능력에 대 한 사용할 수 있습니다. 시 약의 예상된 시작 비용 $4500 단백질 생산의 µ g 당 0.021 달러 또는 $0.019 반응의 µ L 당 예상 비용 반응의 수천을 유지할 것입니다. 또한, 단백질 식 방법 거울 최적화 시 사전 믹스, 비용의 일부분에서의 상용 시스템에서 본 반응 설치의 용이성. 광범위 한 응용 프로그램에 대 한 CFPS 플랫폼의 유연한 특성을 활용 하 여 사용자 수 있도록, 다양 한 조정 하 고 사용할 수 있는 리소스와 단백질 식 결과 따라 최적화 될 수 있는 플랫폼의 측면 확인 했습니다. 원하는.

서론

셀 무료 단백질 합성 (CFPS) 등에 대 한 단백질 생산, 기능 유전체학, 대사 공학, 지난 50 년¹^,²내에서 새로운 기회의 번호를 잠금 해제는 기술로 떠오르고 있다. 표준 vivo에서 단백질 식 플랫폼에 비해, CFPS 세 가지 주요 이점을 제공 합니다: 1) 플랫폼의 셀 무료 자연 수는 잠재적으로 독성 또는 셀³^,^{4 외국 것 단백질의 생산} ^,^,⁵⁶; 2) 게놈 DNA의 비활성화 및 서식 파일의 gene(s)를 인코딩 하는 DNA의 소개의;는 protein(s)의 생산에 대 한 반응 내에서 조직의 에너지의 모든 채널 그리고 3) 플랫폼의 오픈 자연 수정 하 고 반응 조건 및 실시간⁷^,