والهدف من هذا البروتوكول عزل الرئيسيات نونومان CD34+ الخلايا من نخاع العظم معبي، للجينات-تعديل هذه الخلايا مع ناقلات لينتيفيرال، وإعداد منتج لضخ في المضيف ذاتي. طول إجمالي البروتوكول ما يقرب من 48 ساعة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
إعداد وتعديل الجينات الرئيسيات نونومان الجذعية المكونة للدم والخلايا السلف
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
زرع الخلايا (هسبك) الجذعية والسلف المكونة للدم كان حجر زاوية في علاج لسرطان الدم وغيرها من أنواع السرطان لما يقرب من نصف قرن، يكمن وراء العلاج الوحيد المعروف للإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية (فيروس نقص المناعة البشرية-1)، وتبشر بخير هائلة في علاج الأمراض الوراثية مثل الثلاسيميا بيتا. مجموعتنا قد وضعت بروتوكولا للعلاج الجيني هسبك النموذجي في المقدمات نونومان (NHPs)، يسمح للعلماء لتحسين العديد من نفس الكواشف والتقنيات التي تطبق في العيادة. هنا، يمكننا وصف طرق لتنقية CD34+ هسبكس وطويلة الأجل استمرار الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSC) مجموعات فرعية من معبي نخاع العظم (بي أم). يمكن أن تستخدم تقنيات مماثلة لتنقية مصادر هسبك أخرى (مثلاً، الدم المحيطي تعبئة الخلايا الجذعية [ببسكس]). المبين هو بروتوكول يوم 2 التي الخلايا هي تنقية ومثقف وتعديل مع لينتيفيروس (LV) وعلى استعداد لضخ العودة إلى المضيف ذاتي. قراءات أساسية للنجاح تشمل نقاء CD34+ هسبك السكان، وقدرة هسبكس المنقي تشكل مستعمرات شكلياً متميزة في وسائل الإعلام سيميسوليد، والأهم من ذلك، كفاءة التعديل الجيني. أن الميزة الأساسية للعلاج الجيني هسبك هو القدرة على توفير مصدر للخلايا المعمرة التي تؤدي إلى جميع أنواع الخلايا المكونة للدم. على هذا النحو، استخدمت هذه الأساليب للعلاج النموذجي للسرطان والأمراض الوراثية والأمراض المعدية. في كل حالة، أنشأتها الفعالية العلاجية هو تعزيز وظيفة ذرية هسبك متميزة، بما في ذلك خلايا الدم الحمراء وخلايا T وخلايا ب، مجموعات فرعية النقوي. الأساليب لعزل، تعديل، وإعداد هسبك المنتجات مباشرة المنطبقة وقابل للنقل لأمراض متعددة في المرضى البشرية.
المقدمة
العلاج الجيني في الخلايا الجذعية وسيلة قوية للتصدي لمجموعة واسعة من الأمراض البشرية. العلاج الجيني هسبك هو نهج جاذبية خاصة، بسبب ط) السهولة النسبية لجمع هذه الخلايا من المرضى، والثاني) ثروة المعارف التي تتوفر بخصوص تعمل الخلية السطحية والسابقين فيفو ثقافة المعلمات، كالمجال يتسع، لأن الثالث) ويقدم العلماء مربع أدوات استراتيجيات تعديل الجينات لتلائم مختلف الأمراض ذات الأهمية المتزايدة. أننا نحقق بنشاط هسبك نهج العلاج الجيني من زوايا متعددة، بما في ذلك العلوم الأساسية هسبك علم الأحياء وانجرافتمينت من هسبكس المعدلة وراثيا الإكلينيكية في النماذج الحية، وتطبيق للسكان المريض ذات الصلة. نحن وآخرون اتسمت خلية النمط الظاهري السطحي متميزة وظيفيا هسبك مجموعات فرعية،
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وتجري زرع الخطتين ذاتي، فتيلة (تعبئة)، والمجموعة من الخلايا، وتعديل الجينات متسقة مع البروتوكولات المنشورة سابقا26. جميع إجراءات تجريبية يتم استعراضها والموافقة عليها برعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة بمركز أبحاث فريد هاتشينسون السرطان وجامعة واشنطن (البروتوكول #3235-01). تجري جميع الدراسات الصارمة وفقا للتوصيات الواردة في الدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية "المعاهد الوطنية للصحة" ("دليل")؛ وانتدب الحيوانات عشوائياً للدراسات.
1-إثراء CD34+ هسبكس والثقافة بين عشية وضحاها (اليوم-1)
- حصاد BM وشرط عليه.
- تعبئة نهبس مع عامل تحفيز مستعمرة المحببات (جكسف) لمدة 4 أي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
بروتوكول الموصوفة أعلاه يهدف إلى عزل والجينات-تعديل الخطتين CD34+ هسبكس، التي يمكن أن تكون غرست فيما بعد العودة إلى المضيف ذاتي (الشكل 1 و الشكل 2). عند اتباع هذا البروتوكول، نحن عادة الحصول على تصل إلى 8 × 109 مجموع الكريات البيضاء من BM معبي من ضفيرة macaques وفي بعض الأحيان، ضعف هذا المبلغ من macaques الريسوسي. في كلا من الأنواع، عدد CD34+ هسبكس نحن إثراء غير متناسب إلى مدخلات العدد الإجمالي لم.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
ناقل LV الهندسة هو الأسلوب الأفضل تتسم للجينات-تعديل أنواع الخلايا مثل CD34+ هسبكس، لزرع اللاحقة المجراة في. تم تصميم البروتوكول هو موضح هنا لزيادة عدد هسبكس المعدلة وراثيا التي ما زالت قائمة طويلة الأجل في فيفو، وتوفير الفوائد السريرية للمرضى بمختلف الأمراض الخبيثة والمعدية والوراثية. على الرغم من أن استراتيجيات تحرير الجينات ظهرت العقد الأخير، تعديل LV الخلايا هي الأفضل درس في المختبر، في نماذج حيوانية، والمرضى1،،من820
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
يشكر المؤلفون كراوفورد هيلين لإعداد هذه المخطوطة وجيم وولسي لتصميم الرسوم البيانية، ونيلسون فيرونيكا وكريموو ديفيكا للمشاركة في تطوير البروتوكول. تم دعم هذا البروتوكول من المنح المقدمة من المعهد الوطني للحساسية في المعاهد الوطنية للصحة والأمراض المعدية (R01 AI135953 و AI138329 إلى H.P.K.) والوطني للقلب والرئة والدم معهد (R01 HL136135، HL116217، P01 HL122173، وآسيا تحت 19 عاماً HL129902 إلى H.P.K.)، فضلا عن OD010425 P51 المعاهد الوطنية للصحة، وفي جزء آخر من خلال "مركز السرطان" المعاهد الوطنية للصحة/NCI، CA015704 P30 منحة الدعم. H.P.K. هو "محقق الطب الجزيئي ماركي" وتلقى الدعم كمستلم خوسيه كاريراس/هاء "دونال توماس هبت الرئيس" الافتتاحية لأبحاث السرطان ورئيسة وهبت القفص ف....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Stemspam SFEM II ("HSPC") خلية جذعية للوسائط | 09655 | ||
| الملح المتوازن من هانك | جيبكو | 14175095 | |
| ملحي مخزن بالفوسفات | جيبكو | 14190-144 | |
| البنسلين / الستربتومايسين | جيبكو | 15140-122 | |
| ثنائي ميثيل سلفوكسيد | سيجما ألدريتش | D2650-100 | |
| 100٪ مختبرات إيثانول | ديكون | M18027161M | |
| سيكلوسبورين | سيجما | 30024-25 مجم | |
| 500 ملي EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
| مصل بقري الجنين المعطل بالحرارة | سيجما ألدريتش | PS-0500-A | |
| CH-296 / RetroNectin (2.5 مل ، 1 وميكرو ؛ ز /& مايكرو ؛ ل) | TaKaRA | T100B | |
| مصل الأبقار الألبومين | Sigma | A7906-100g | |
| HEPES | Sigma | H9897 | |
| الفئران المضادة للفأر IgM الخرز المغناطيسي | Miltenyi Biotec | 130-047-301 | |
| الخلايا الجذعية البشري المؤتلف (SCF) | Peprotech | 300-07 | |
| المؤتلف Thrombopoietin البشري (TPO) | Peprotech | 300-18 | |
| المؤتلف البشري الشبيه ب FMS التيروزين كيناز 3 (FLT-3) | Peprotech | 300-19 | |
| كبريتات البروتامين | Sigma | P-4505 | |
| 14 مل من مادة البولي بروبيلين ذات الأنبوب المستدير | Corning | 352059 | |
| Colony Gel 1402 | ReachBio | 1402 | |
| QuadroMACS فواصل | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| أعمدة MACS L25 | Miltenyi biotec | 130-042-401 | |
| 10 ملي مولار PGE2 | كايمان كيميكال | 14753-5 ملغ | |
| قوارير T-75 المعالجة TC Bioexpress | T-3001-2 | ||
| قوارير T-75 غير المعالجة TC | Thermo-Fisher | 13680-57 | |
| 20 مل محاقن | BD Biosciences | 302830 | |
| 16.5 G إبر | BD غطاء طرف الحقنة | 305198 | |
| الدقة BD Biosciences | 305819 | ||
| QuickExtract DNA | Solution Epicenter | QE09050 | |
| غطاء شريطي 8 أنابيب أنابيب PCR الولايات | المتحدة الأمريكية العلمية | 1402-2708 | |
| 96 جيدا Thermocycler | Thermo-Fisher | 4375786 | |
| مرشحات ما قبل الفصل | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| مصفاة ، خلية. BD فالكون. عقيم; شبكة النايلون حجم الشبكة: 70um ؛ اللون: أبيض. 50 / CS | فيشر العلمي | 352350 | |
| Ultracomp ebeads | eBioscience | 01-2222-42 | |
| MACSmix أنبوب دوار | Miltenyi | 130-090-753 | |
| 3 مل محاقن Luer-Lock | Thermo-Fisher | 14823435 | |
| 35 مم × 10 مم طبق ثقافة الخلية | Corning | 430165 | |
| 60 مم × 15 مم طبق ثقافة | الخلية Corning | 430196 | |
| 150 مم × 25 مم طبق ثقافة الخلايا | Corning | 430599 | |
| غير TC معالج قوارير | Falcon | 353133 | |
| Qiagen استخراج الحمض النووي | Qiagen Qiagen | 51104 | |
| PE Anti-Human CD90 (Thy1) استنساخ: 5E10 | Biolegend | 328110 | |
| PE-CF594 الفأر المضاد للإنسان استنساخ CD34: 563 | BD | الأفق 562449 | |
| استنساخ ماوس APC-H7 مضاد للإنسان CD45RA: 5H9 | BD Pharmingen | 561212 | |
| V450 ماوس مضاد ل NHP CD45 استنساخ: d058-1283 | BD Biosciences | 561291 | |
| مصل ذاتي | المنشأ تم جمعه من مضيف ذاتي المنشأ ومحفوظ بالتبريد قبل تعبئة وجمع CD34 + HSPCs | N / A | بيرد ، بي سي وآخرون. اختيار فعال ومستقر بوساطة MGMT للخلايا الجذعية لإعادة توطينها على المدى الطويل في الرئيسيات غير البشرية. مجلة التحقيقات السريرية. 120 (7) ، 2345-2354 ، (2010). |
| الوسائط المكيفة بالفيروسات (VCM) | مختبر كيم ، مركز FHCRC التعاوني للتميز في أمراض الدم (CCEH) | N / A | Beard، B. C. et al. اختيار فعال ومستقر بوساطة MGMT للخلايا الجذعية المعاد توطينها على المدى الطويل في الرئيسيات غير البشرية. مجلة التحقيقات السريرية. 120 (7) ، 2345-2354 ، (2010). |
| الجسم المضاد المضاد ل CD34 ، Clone 12.8 | Kiem Lab | N / A | Beard ، B. C. et al. اختيار فعال ومستقر بوساطة MGMT للخلايا الجذعية طويلة الأمد لإعادة التوطين في الرئيسيات غير البشرية. مجلة التحقيقات السريرية. 120 (7) ، 2345-2354 ، (2010). |
| Lenti F التمهيدي: AGAGATGGGTGGCGAGCGTCA | تقنيات الحمض النووي المتكاملة | N / A | Peterson، C.W. et al. النقش متعدد النسيلة للخلايا المعدلة جينيا Cal-1 والاختيار في الجسم الحي بعد عدوى SHIV في نموذج رئيسي غير بشري لمرض الإيدز. طرق مول ثير Clin Dev. 3 16007 ، (2016). |
| Lenti R التمهيدي: TGCCTTGGTGGGTGCTACTCCTAA | تقنيات الحمض النووي | المتكاملة N / A | Peterson، CW et al. النقش متعدد النسيلة للخلايا المعدلة جينيا Cal-1 والاختيار في الجسم الحي بعد عدوى SHIV في نموذج رئيسيات غير بشرية من الإيدز. طرق مول ثير Clin Dev. 3 16007 ، (2016). |
| Actin F التمهيدي: TCCTGTGGCACTCACGAAACT | Integrated DNA Technologies | N / A | Peterson، C.W. et al. تطعيم متعدد النسيلة للخلايا المعدلة جينيا Cal-1 والاختيار في الجسم الحي بعد عدوى SHIV في نموذج رئيسيات غير بشري لمرض الإيدز. طرق مول ثير Clin Dev. 3 16007 ، (2016). |
| برايمر Actin R: GAAGCATTTGGCGGTGGACGAT | Integrated DNA Technologies | N / A | Peterson، C.W. et al. النقش متعدد النسيلة للخلايا المعدلة جينيا Cal-1 والاختيار في الجسم الحي بعد عدوى SHIV في نموذج رئيسيات غير بشري لمرض الإيدز. طرق مول ثير Clin Dev. 3 16007 ، (2016). |
المراجع
- Radtke, S., et al. A distinct hematopoietic stem cell population for rapid multilineage engraftment in nonhuman primates. Science Translational Medicine. 9 (414), eaan1145 (2017).
- Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
