Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Ett protokoll för transkraniell Photobiomodulation terapi hos möss

Published: November 18, 2018 doi: 10.3791/59076
Automatic Translation
1,2, 3, 4,5,6, 1, 1, 7, 8,9,10, 1
1Neurosciences Research Center, Tabriz University of Medical Sciences, 2ProNeuroLIGHT LLC, 3LiteCure LLC, 4Department of Psychiatry, Harvard Medical School, 5Depression Clinical and Research Program, Department of Psychiatry, Massachusetts General Hospital, 6Center for Anxiety and Traumatic Stress Disorders, Department of Psychiatry, Massachusetts General Hospital, 7Research Institute for Applied Physics and Astronomy, University of Tabriz, 8Department of Medical Physics, Tabriz University of Medical Sciences, 9Department of Medical Bioengineering, Tabriz University of Medical Sciences, 10School of Medical Sciences, University of Aberdeen

Summary

Photobiomodulation terapi är en innovativ noninvasiv modaliteten för behandling av ett brett spektrum av neurologiska och psykiatriska sjukdomar och kan också förbättra friska hjärnans funktion. Detta protokoll innehåller en stegvis guide för att utföra hjärnan photobiomodulation hos möss av transkraniell ljus leverans, som kan anpassas för användning i andra laboratorium gnagare.

Abstract

Transkraniell photobiomodulation är en potentiell innovativa noninvasiv behandlingsmetoder för att förbättra hjärnans bioenergetik, hjärnans funktion i ett brett spektrum av neurologiska och psykiatriska sjukdomar och minnesförbättringar i åldersrelaterad kognitiv försämring och neurodegenerativa sjukdomar. Vi beskriver ett laboratorium protokoll för transkraniell photobiomodulation terapi (PBMT) hos möss. Åldern BALB/c-möss (18 månader gamla) behandlas med en 660 nm laser transcranially, en gång dagligen i 2 veckor. Transmittans laserdata visar att cirka 1% av det infallande röda ljuset på hårbotten når ett 1 mm djup från kortikala ytan, genomträngande dorsala hippocampus. Behandlingsresultat bedöms av två metoder: en Barnes labyrint test, som är en hippocampus-beroende spatial inlärning och minne uppgift utvärdering, och mäta Hippocampus ATP-nivåer, som används som ett bioenergetik index. Resultaten från Barnes uppgiften visar en förbättring av det rumsliga minnet i laser-behandlade åldern möss jämfört med åldersmatchade kontroller. Biokemisk analys efter laserbehandling indikerar ökade Hippocampus ATP-nivåer. Vi postulerar att förstärkningen av minnesprestanda potentiellt beror på en förbättring i hippocampus energiomsättning induceras av röd laserbehandling. Observationerna i möss skulle kunna utvidgas till andra djurmodeller eftersom detta protokoll kan potentiellt anpassas till andra arter som ofta används i translationell neurovetenskap, såsom kanin, katt, hund eller apa. Transkraniell photobiomodulation är en säker och kostnadseffektiv modalitet som kan vara en lovande terapeutisk metod i åldersrelaterad kognitiv försämring.

Introduction

PBMT, eller låg nivå laser ljusterapi (LLLT), är en allmän term som hänvisar till terapeutiska metoder som bygger på stimulering av biologiska vävnader av ljus energi från laser eller lysdioder (LED). Nästan alla PBMT behandlingar tillämpas med rött till (NIR) nära infrarött ljus våglängder från 600 till 1100 nm, en uteffekt som sträcker sig från 1 till 500 mW och en fluence alltifrån < 1 till > 20 J/cm2 (se Chung et al.1).

Transcranial PBMT är en icke-invasiv ljus leveransmetod som utförs av bestrålning av huvudet med en extern ljuskälla (laser eller lysdioder)2. För djur program innehåller metoden kontakt eller beröringsfri placering av LED eller laser sonden på djurets huvud. Beroende på regionen terapeutiska av intresse, kan en ljusledaren placeras antingen över hela huvudet (för att täcka alla hjärnområden) eller över en viss del av huvudet, såsom den prefrontala, frontal eller parietala regionen. Partiell överföring av röd/NIR ljus genom hårbotten, skalle och dura mater kan nå den kortikala ytan och ge en mängd fotonenergi som är tillräcklig för att ge terapeutiska fördelar. Därefter skulle de levererade ljus fluence på kortikal nivå spridas på grå och vit hjärnan saken tills den når de djupa strukturerna i hjärnan3.

Ljus i spektrala banden på röd till mån (600-680 nm) och tidig NIR-region (800-870 nm) motsvarar absorptionsspektrum av cytokrom c oxidas, enzymet terminal av mitokondriell respiratoriska kedja4. Det är en hypotes om att PBMT i de röda/NIR-spektrumet orsakar vattenmolekylens av kväveoxid (NO) från cytokrom c oxidas, vilket medförde höjningar i mitokondriell elektrontransport och, slutligen, ökade ATP generation5. Med avseende på neuronal applikationer, neurostimulatory fördelarna med hjärnan PBMT använda transkraniell bestrålning metoder har rapporterats i olika prekliniska studier, inklusive gnagare modeller av traumatisk hjärnskada (TBI) skada6, akut stroke7, Alzheimers sjukdom (AD)8, Parkinsons sjukdom (PD)9, depression10och åldrande11.

Hjärnans åldrande anses ett neuropsykologiska tillstånd som negativt påverkar vissa kognitiva funktioner, såsom inlärning och minne12. Mitokondrierna är de primära organeller som är ansvarig för ATP produktionen och neuronala blockeringar. Mitokondriell dysfunktion är kända för att vara associerade med åldersrelaterade underskott i hjärnområden som är kopplade till spatial navigering minne, till exempel hippocampus13. Eftersom kraniell behandling med röd/NIR ljus primärt akter genom modulering av mitokondriell bioenergetik, kan tillräcklig levererade ljus dosering till hippocampus resultera i förbättring av rumsliga minne resultat14.

Syftet med det nuvarande protokollet är att demonstrera transkraniell PBMT förfarandet hos möss, med låga nivåer av rött ljus. Krävs lasermätningar ljustransmission genom huvudet vävnader i åldern möss beskrivs. Dessutom Barnes labyrint, som en hippocampus-beroende spatial inlärning och minne uppgift och Hippocampus ATP-nivåer, som ett index med bioenergetik används för utvärdering av behandling inverkan på djur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla förfaranden genomfördes i enlighet med guiden för skötsel och användning av laboratoriedjur av National Institutes of Health (NIH; Publikation nr 85-23, reviderad 1985) och godkänts av regionala etikkommittén Tabriz University of Medical Sciences.

Varning: Detta protokoll omfattar tillämpning av klass 3B laser instrument och kräver ordentlig utbildning och följsamhet till riktlinjer för säkerhet. Klass 3B lasrar kan allvarligt skada ögonen och kan värma huden. Klass 3B lasrar anses inte en brännskador. Ögon skydd skyddsglasögon skall användas vid alla tillfällen när du använder laser enheten.

1. laser ljustransmission experiment

Obs: Används här erhölls tre 18-månader gammal BALB/c hanmöss från djuranläggningen Tabriz University of Medical Sciences. En 60 mW laser (660 nm) med en cirkulär stråle form av 2,5 mm i diameter används som ljuskälla. Laserkällan producerar ett cirkulärt polariserat ljus med en Gaussisk intensiteten profil och drivs i kontinuerlig våg läge. En kommersiell fotodiod kraftmätare med en 10 nW-upplösning, en fyrkantig 1 cm2 fotodiod aktivt område och spektrala intervallet 400 till 1100 nm används för att mäta den överförda ljus makten genom proverna.

  1. Provberedning
    1. För att få färska prover, djupt söva musen med en blandning av ketamin (100 mg/kg) och xylazin (10 mg/kg).
    2. Dissekera musens huvud med vanlig sax, start från den punkt strax ovanför axlarna.
    3. Rotera huvudet så att den ventrala sidan av käken är vänd uppåt. Skjut vinklade dissektion sax smidigt genom munhålan tills motståndet av mandibular korsningen är märkt. Skär alla stora muskler länka underkäken ben till skallen och kassera dem.
    4. Ta bort Palatinen ben, med vinklad dissektion sax.
    5. Kassera alla köttet kring skallen, med böjda pincetten.
    6. Dissekera den nedre delen av skallen, och ta sedan försiktigt hjärnan ur återstående skallbenet, med en böjd spatel.
    7. Fixa intakt hjärnvävnaden i en 2% agarosgel så vävnaden kommer att vara lämpliga för skivning.
      Obs: För att erhålla en intakt skalle plus hårbotten prov, hjärnvävnaden bör tas bort från den ventrala sidan av djurets huvud utan några skador i den dorsala delen av huvudet.
  2. Hjärnan som skivning förfarande
    1. Sprida en droppe superlim (~0.05 mL) på ytan av vibratome montering blocket.
    2. Försiktigt bifoga agaros blocket till den vibratome montering block så att den ventrala ytan av hjärnan är nedåt och justera dess position.
    3. Något matchar vibratome bladet på övre ytan av agaros blocket och registrera cutter värdet som den primära nivån.
    4. Fyll vibratome tanken med iskall normal saltlösning.
    5. Justera vibratome parametrar (t.ex. segment tjocklek [1 mm], hastighet [5 av 5 på enheten enhet] och vibrationer frekvens [5 av 5 på enheten enhet]) för att erhålla tillfredsställande skivning.
    6. Skär hjärnan tvären i ett segment med en 1000 µm tjocklek.
      Obs: Slice är del av hjärnvävnaden avgränsas av kortikala ytan och ett plan placerad 1000 µm underlägsen den kortikala ytan (dorsala hippocampus).
    7. Lägg en droppe vatten (~0.05 mL) på optiskt glasytan och Lägg hjärnan skiva ovanpå den. Sedan lägga en droppe vatten på den hjärnan slice och försiktigt placera det andra optiska glaset ovanpå den.
      Obs: En droppe vatten bör läggas till provet glas gränserna för att förhindra vävnad torkning och ljus spridning från grova ytor.
  3. Mätning av ljustransmission genom huvudet vävnader
    1. Ställa in optisk utrustning, inklusive laser enheten, reflekterande speglar och mätaren kraftenheten.
      FÖRSIKTIGHET: Pålagda skyddande öga glasögon innan han på laser.
    2. I avsaknad av ett prov på wattmetern, aktivera laser enheten och fokusera laserstrålen på spegeln som ligger på rätt avstånd för att styra strålen vinkelrätt mot den fotodiod aktivt område.
      Obs: Ljustransmission mätningar måste utföras i ett mörkrum vid rumstemperatur (23-25 ° C), inom 30 min efter huvud vävnader har utvunnits.
    3. Utföra mätningar på skivad hjärnvävnaden.
      1. Placera två tomma optiska glasögon på ytan av wattmetern.
      2. Läs den överförda ljus makten (jag0) från wattmeterns skärmen och spela in värdet.
      3. Försiktigt placera hjärnan provet, som är omfattas av två optiska glas, på ytan av wattmetern, fokusera strålen på vävnadens respektive område, Läs den överförda kraften och registrera mätvärdet.
    4. Utföra mätningar på skallen plus hårbotten.
      1. Placera en tom optiskt glas på ytan av wattmetern.
      2. Läs den överförda ljus makten (jag0) från wattmeterns skärmen och spela in värdet.
      3. Lätt placera ett optiskt glas med färska skalle plus hårbotten vävnad på ytan av wattmetern, matcha ljusstrålen på zonen bregma, läsa den överförda kraften och registrera mätvärdet.
      4. För att maximera det signal-brus-förhållandet, upprepa ljustransmission mätning minst 3 x för alla prover.
        Obs: Zonen bregma placeras i en cirka 3 mm rostralt om en linje dragen genom främre basen av öronen. Tjockleken på skallen plus hårbotten vävnad mäts av en standard bromsok.

2. Photobiomodulation terapi (PBMT)

Obs: Fyrtiofem manliga BALB/c-möss som tilldelats tre grupper av 15 möss varje användes. Grupperna bestod av ung-kontroll möss (2 månader gammal) som fick sham-PBMT, åldern-kontroll möss (18 månader gammal) som fick sham-PBMT och äldre-PBMT möss (18 månader gammal) som fick PBMT. Sham-PBMT behandlingen bestod av behandling som är identisk med PBMT gruppen men med laser inaktiva. Möss erhölls från djuranläggningen Tabriz University of Medical Sciences och var inrymt i djuret hålla enheten av neurovetenskap Research Center (NSRC) vid 24-25 ° C och 55% relativ luftfuktighet, med en 12 timmar ljus och 12 h mörka fotoperiod. Mat och vatten lämnades ad libitum. Alla möss var acklimatiserad i minst 1 vecka före behandling.

  1. Laser behandling förfarande
    Obs: En GaAlAs diodlaser med kontinuerlig våg läge vid 660 nm våglängd användes för transkraniell PBMT behandling. Laser enheten drevs på en uteffekt på 200 ± 2 mW och en irradians 6,66 W/cm2, med en strålpunkt 0,03 cm2. En genomsnittlig fluence 99,9 J/cm2 per varje session levererades till hårbotten ytan för 15 s av bestrålning. Bestrålning var administrerade 1 x dagligen i 2 veckor.
    1. Ta möss i sina hem burar till terapi rum, ca 20 min innan du påbörjar behandlingen.
    2. Ansluta en elektrisk skydd till vägguttaget.
    3. Stickproppen laser enheten till en elektrisk beskyddare.
    4. Täcka spetsen av laser sonden med en transparent nylon film för att förhindra eventuella repor på ytan.
    5. Anslut försiktigt sonden kanalen för laser enheten.
    6. Slå på laser enheten och vänta några sekunder för att värma upp.
    7. Justera laserbehandling/parametrar, inklusive det bestrålning tid och drift läget.
    8. I avsaknad av alla prover, bestämma den genomsnittliga lasereffekten genom att kontakta spetsen på sonden till det aktiva området av wattmetern på laser enheten. Registrera mätvärdet.
    9. Upprepa kalibreringen (steg 2.1.8) minst 5 x, Läs de infallande befogenheterna från wattmeterns skärm och registrera värdena.
    10. Försiktigt hålla en mus av dorsala huden av djurets hals i en handflata och immobilisera dess huvud.
      Obs: I det nuvarande protokollet, laser sonden placeras på den bregma zonen, som är ~ 3 mm rostralt om en linje dragen mellan inre basen av öronen.
    11. Lätt Placera spetsen på sonden direkt på hårbotten vid mittlinjen, ca 3 mm rostralt om en linje dragen genom främre basen av öronen.
      Obs: Håll sonden på en ca 45° vinkel mot planet av buken.
    12. För att undvika direkt bestrålning till djurets ögon, först kontakta sondens spets på huvudet och slå sedan på laser enheten.
    13. Slå på laser och stabilt Håll sonden fram till slutförandet av bestrålning.
    14. Efter slutet av terapin, frånträda huvudet laser sonden och försiktigt tillbaka musen till sin bur.
    15. Stäng av laser enheten och koppla sonden från enheten.
    16. Ren laser sonden med ett lämpligt optiska renare.
    17. Överföra möss till djuranläggningen.

3. beteendemässiga uppgifter

  1. Öppna-fältprov
    1. Bedöma den motoriska aktiviteten i varje mus av den totala tillryggalagda under en öppna-fältet test, som beskrivs tidigare15.
  2. Barnes labyrint uppgift
    1. Apparater
      Obs: Spatial inlärning och minne uppgiften utförs i en Barnes labyrint16. Den apparat som används för neurologiskt betingade aktiviteten består av en cirkulär plattform tillverkad av svart trä (95 cm i diameter) med 20 ekvidistanta, 5 cm-diameter runda hål som finns på plattformen, 3 cm från omkretsen. Apparaten är förhöjda 50 cm från golvet för att hindra djur från att klättra. En lös svart plast fly box (20 x 15 cm x 5 cm) är placerad under flykten hålet. En svart labyrint används för att testa vita möss, och en svart matta bör placeras under labyrinten när en programvara spårande system används.
      1. Placera apparaten labyrint i mitten av ett tyst rum med ljusa storbildsprojektor.
      2. Placera ett ”Skriv” tecken på utsidan av dörren uppgift rum.
      3. Bifoga visuell-spatial ledtrådar till yttre murar.
      4. Placera en digital videokamera över labyrint plattform.
      5. Rengöra ytan på den labyrint plattformen med 70% etanol att ta bort oönskad lukt ledtrådar.
      6. Lägga till en liten mängd sängkläder från djurets buren på insidan av rutan escape att fungera som en lukt cue.
    2. Anpassning session
      1. Ta varje mus till den uppgift rum ca 30 min innan experimentet, för musen för att blivit vana.
      2. Ta bort musen från sin bur och försiktigt placera djuret i rutan fly för 1 min.
    3. Träningspasset
      Obs: Träningspasset upprepas för varje mus på 4 dagar.
      1. Ta försiktigt bort musen från rutan fly.
      2. Placera musen i mitten av arenan; sedan placera start kammaren överst på musen.
      3. Ta bort start kammaren efter 10 s, och låt musen för att utforska arena för 3 min.
      4. Lugnt gå till datorområdet och pålagda brusreducerande hörlurar.
      5. Utlösa en negativ auditiv stimulans bestående av ett högt vitt brus av ungefärligt 80 dB på nivån plattform och börja videofilmade musen.
      6. Stäng av det vitt bruset och stoppa videofilmning när musen kommer in rutan fly. Låt djuret att förbli ostörd i rutan för 1 min.
      7. Ta bort musen från rutan fly och Lägg tillbaka i sin bur.
      8. Upprepa steg 3.4.2 genom 3.4.7 4 x per dag, med 3 minuters mellanrum mellan upprepade försök.
        Obs: Mellan alla prövningar, bort urin eller avföring från arena ytan och rengör labyrinten med 70% etanol.
    4. Sonden försökssession
      1. Efter den senaste utbildning rättegången, 24 h senare, ta bort rutan fly från labyrinten plattformen och upprepa steg 3.4.2 genom 3.4.5.
      2. Efter 3 min, Stäng av det vitt bruset och stoppa videofilmning. Ta bort musen från labyrinten arena och Lägg tillbaka i sin bur.
      3. Efter att alla djur har testats, ren labyrinten plattformen och start kammare. Stäng av rummet ljus och ta bort skylten ”inte anger” från dörren.
      4. Lagra videoinspelningarna från testning sessioner till en extern hårddisk för vidare analys.
      5. Ställ in video-spårning programvara och extrahera parametrarna av intresse från det inspelade videor, inklusive latens tiden att hitta målet hål under 4 dagar av utbildningstillfällen och tiden tillbringade i målet kvadranten under sonden prov session.

4. biokemiska bedömning

  1. ATP-nivåer i hippocampus
    1. Djupt söva varje mus med en intraperitoneal injektion av en blandning av ketamin (100 mg per gram kroppsvikt) och xylazin (10 mg per gram kroppsvikt).
    2. Halshugga djuret och snabbt ta bort hjärnvävnad från skallen.
    3. Dissekera ut hippocampus och homogenisera vävnaden i iskall prov buffert (tillhandahålls av satsen) med en vävnad Homogenisatorer.
    4. Centrifugera omedelbart Homogenatet vid 2000 x g under 3 minuter vid 4 ° C.
    5. Överför supernatanten till en ren röret.
    6. Bedöma de Hippocampus ATP-nivåer, använda den spektrofotometrisk metod som tidigare beskrivits11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Statistiska analyser

Den statistiska analysen av data som erhållits från Barnes träningspassen analyserades av tvåvägs ANOVA; de andra beteendemässiga tester och analys av hippocampus ATP nivåer bland grupperna genomfördes av envägs ANOVA, följt av Tukey's post hoc-test. Alla data uttrycks som betyder ± standardavvikelsen för medelvärdet (SEM), utom laser överföring data, vilka visas som betyder ± standardavvikelsen (SD). Signifikansnivån sattes till p < 0,05.

Laser ljustransmission

Laserljuset (660 nm) överföring genom skallen plus hårbotten vävnad (med en prov tjocklek 0,85 ± 0,09 mm) i de åldern möss var 15,67% ± 0,87% när en laserstråle var fokuserad på bregma (figur 1). Utifrån detta ljustransmission, sedan den inledande fluence på hårbotten ytan var 99,9 J/cm2 (6,66 [W/cm2] x 15 [s]), uppskattas det att en ungefärlig fluence 16 J/cm2 nådde kortikala ytan.

Den laser transmittans, genom en 1 mm bit av åldern hjärnvävnad, var 10.10% ± 0,95% (figur 1). Från dessa värden, kan det uppskattas att de lätta fluence minskat från 16 J/cm2 på cerebral cortex vävnad nivå till cirka 1,6 J/cm2 på 1 mm djup från kortikala ytan.

Öppna fälttest

Det fanns inga statistiskt signifikanta skillnader i rörelseaktivitet i öppna-fältet testet bland alla experimentella grupper (figur 2).

Barnes labyrint uppgift

När flykt fördröjningen analyserades under 4 dagar av träning och med experimentella grupper under uppgiften Barnes labyrint, en tvåvägs ANOVA visade signifikanta effekter av dag (p < 0,001) och grupp (p < 0,001), men inte gruppen x dag (p = 0,47). En tvärpolitisk grupp analys av data visade att latens tider av åldern-kontroll djuren var betydligt längre än de i gruppen ung-kontroll på tredje (p < 0,01) och fjärde (p < 0,001) dagar under träningspasset. Latens tider av PBMT-behandlade år mössen var dock betydligt kortare på den fjärde dagen (p < 0,05), jämfört med de äldre-kontroll möss (p < 0,01) (figur 3). I sonden prov session tillbringade åldern-kontroll möss betydligt kortare tider i målet kvadranten, jämfört med ung-kontroll möss (p < 0,01). Dock den PBMT-behandlade åldern möss tillbringade betydligt längre gånger i målet kvadranten jämfört med åldern-kontroll möss (p < 0,05) (figur 4).

Hippocampus ATP-nivåer

Åldern-kontroll möss hade en signifikant minskning i hippocampus ATP-nivåer, jämfört med ung-kontroll möss (p < 0,05). Genomsnittliga ATP innehållet i hippocampus av äldre-PBMT mössen var dock betydligt större än i de åldern-kontroll möss (p < 0,05) (figur 5).

Figure 1
Figur 1 : Laser ljustransmission data genom skallen plus hårbotten och hjärnvävnaden. Data är uttryckta som medelvärde ± SD. SD = standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Rörelseaktivitet data från det öppna-fältet test Uppgifter uttrycks som den medelvärde ± SEM. PBMT = photobiomodulation terapi; SEM = standardavvikelsen för medelvärdet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Fly latens för möss grupper under de 4 dagarna utbildningstillfällen. Värdena representerar det medelvärde ± SEM. **p < 0,01 och ***p < 0,001, jämfört med ung-kontroll möss. # p < 0,05, jämfört med de äldre-kontroll möss. PBMT = photobiomodulation terapi; SEM = standardavvikelsen för medelvärdet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Träningstid i den mål kvadranten i sonden session, i olika grupper. Värdena representerar det medelvärde ± SEM. **p < 0,01, jämfört med ung-kontroll möss. # p < 0,05, jämfört med de äldre-kontroll möss. PBMT = photobiomodulation terapi; SEM = standardavvikelsen för medelvärdet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 : ATP innehållet i hippocampus vävnaden. Värdena representerar det medelvärde ± SEM. *p < 0,05, jämfört med ung-kontroll möss. # p < 0,05, jämfört med de äldre-kontroll möss. PBMT = photobiomodulation terapi; SEM = standardavvikelsen för medelvärdet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi beskriver ett protokoll för genomför ett transkraniell PBMT förfarande hos möss. Detta protokoll är specifikt riktad till neurovetenskap laboratorier som utför photobiomodulation forskning fokuserat på gnagare. Detta protokoll kan dock anpassas till andra försöksdjur som används frekvent inom neurovetenskap, såsom kanin, katt, hund eller apa.

För närvarande finns det ökade intresset för utreda transkraniell PBMT med röd/NIR lasrar och lysdioder. För att framgångsrikt genomföra hela behandlingsförfarandet hos gnagare, finns det några viktiga steg att överväga.

Det första är det kritiskt att, innan du försöker några behandlingar hos levande djur, ljuspenetrering just mäts genom de djura huvud vävnaderna för att leverera en optimal photon dosering (J/cm2).

För det andra, utifrån vilka områden i hjärnan är påverkas av patologi och måltavlan för behandling, flera parametrar måste optimeras, maximera ljuspenetrering och öka sannolikheten för positivt utfall. Dessa inkluderar bestrålning tid, behandlingsintervall, tillämpad irradians och fluence. Till exempel i de åldern djurmodeller är det avgörande att leverera en tillräcklig stråldos till hjärnans hippocampus och frontala cortex eftersom dessa regioner är kopplade till åldersrelaterade sjukdomar2. En optimal fluence i målvävnad är en annan viktig faktor i PBMT. De flesta forskare diskuterar faktorer som påverkar ljustransmission men ofta försummar att överväga att en bifasisk reaktion i hjärnan målvävnad existerar inte bara för fluence (J/cm2) men också för från fluence leverans. Med andra ord, är en fluence 1 J/cm2 levereras över 1 min inte motsvarar 1 J/cm2 levereras över 1 s17,18.

I området i närheten finns det flera ytterligare faktorer som bör beaktas innan den verkställer transkraniell PBMT studier. Transcranial PBMT hos gnagare är vanligen tillämpas med hjälp av laser eller lysdioder sonder med sonden tip storlek skalas till djurets hjärna storlek. För tillämpning i gnagare, måttlig-power lasrar (med en uteffekt på ≤ 500 mW) kan leverera en stor mängd ljus energi på kort tid och minska både behandlingstid och behandlingsrelaterade stress för djuret. Även om klass 3B lasrar inte har betydande photothermal effekter i PBMT dosering spänner (≤20 J/cm2), rekommenderas kylning hårbotten ytan med ett transparent optiskt ämne, såsom is eller gel, under transkraniell ansökan.

I vissa experimentella transkraniell PBMT studier används optisk fiber istället för en laser- eller LED probe, på grund av dess fördelar för bestrålning av ett visst litet område på huvudet. För exempel, fokal ischemisk stroke, TBI, och PD-modeller, en korrekt bestrålning av det skadade området är motiverad. Optiska fibrer har dock generellt en liten stråle område, så detta kommer att påverka den totala mängden energi som levereras i en session och kommer att kräva forskare att upprepa proceduren i mer än en plats för att kompensera för minskad området. I mest experimentella transkraniell PBMT studier bedrivs bestrålning av huvudet i den alert, unanesthetized djuren. För att säkerställa djurens stabilitet, rekommenderas manuell huvud innehavet och användningen av fasthållningsanordningar. I den manuellt håller metod, på grund av det faktum att detta djur kan flytta plötsligt och eventuellt flytta sitt huvud från zonen bestrålning, en del av lätt bestrålas kan vara bortkastade. Dessutom båda metoderna kan framkalla extra stress för djuret och kan vara en potentiell confounding faktor. I vissa fall utförs förfarandet bestrålning på sövda djur. Det bör noteras att för mycket anestesi kan påverka de experimentella resultaten i neurovetenskap studier. Därför övervägas kortare bestrålning intervall noga i dessa typer av experiment.

I den aktuella studien, Vi mätte först överföring av ljus genom skallen plus hårbotten av manliga BALB/c åldern möss för att avgöra mängden 660 nm laser energi som nådde kortikala ytan. Resultaten indikerade att 16% av det ursprungliga ljuset på ytan av orakad hårbotten sändes via till hjärnan. Överföring data från andra laboratorier i manliga BALB/c-möss har visat att endast 1,2% av 670 nm laserljus kunde penetrera intakt skalle19. Det har också rapporterats att cirka 90% av 670 nm LED-ljus är försvagade inuti musen kranium20.

Effektiva neurostimulatory doseringen av den röda lasern på kortikal vävnad nivå bekräftades i en tidigare studie på vårt laboratorium11. Vi visade att en daglig kortikala fluence av en 8 J/cm2 laser på 660 nm har procognitive effekter i en mus som åldrande modell11. I avsnittet behandling av den aktuella studien för att leverera cirka 16 J/cm2 till kortikala ytan, vi behövde lämna lasern på för 15 s, som tolererades av möss. I detta arbete mätte vi även ljus makt inkom hippocampus ytan. Baserat på resultaten av experimentet, mättes ett ungefärligt värde på 10% som laser transmittans genom en 1 mm bit av åldern hjärnan, motsvarar en ljus fluence ungefärligt 1.6 J/cm2 når 1 mm djup från kortikala ytan. Data från andra studier med BALB/c mus hjärnan har avslöjat en 65-procentig minskning av 670 nm LED ljus intensitet över varje millimeter av cerebral vävnad21. Det har också visat att cirka 2,5 procent av 670 nm LED-ljus når ett djup i hjärnvävnad på 5 mm, avståndet från skallen ytan till den substantia nigra compacta (SNc) område22.

Hippocampus har en huvudsaklig roll i konsolideringen av rumsliga minne23. I själva verket är Hippocampus bioenergetik kapaciteten associerade med spatial navigering minne och inlärning. Resultaten presenteras här tyder på att en lätt dos av ungefärligt 1.6 J/cm2 på hippocampus nivå kan vara tillräckligt för att åstadkomma en förbättring av rumsliga minne utfall i åldern möss. Det kunde antas att en förbättring av minnesprestanda i kognitiv beteendeterapi uppgift (Barnes labyrint) kan bero på en förbättring av hippocampus energiomsättning tycks induceras av en röd laser en viss våglängd på 660 nm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

P.C.'s lön stöddes av Harvard psykiatri avdelningen (Dupont-Warren gemenskap och Livingston Award) av hjärnan och beteende Research Foundation (publicerade Young Investigator Award) och av Photothera Inc. obegränsad grant. Drogen donationen kom från TEVA. Resor ersättning kom från Pharmacia-Upjohn. P.C. har fått samråd avgifter från Janssen forskning och utveckling. P.C. har lämnat in flera patent relaterade till användningen av infrarött ljus i psykiatri. PhotoMedex, Inc. levererade fyra enheter för en klinisk studie. P.C. har fått obegränsad finansiering från Litecure Inc. att genomföra en studie på transkraniell photobiomodulation för behandling av stora depressiva störningar och att genomföra en studie på friska försökspersoner. P.C. tillsammans grundade ett företag (Niraxx ljus Therapeutics) fokuserade på utvecklingen av nya metoder för behandling baserat på infrarött ljus; Han är även konsult för samma företag. P.C. fick finansiering från Cerebral vetenskaper att genomföra en studie på transkraniell photobiomodulation för generaliserat ångestsyndrom. Andra författarna har inga intressekonflikter avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av ett bidrag från Tabriz University of Medical Sciences (bevilja nr 61019) till S.S.-E. och en publikation bidrag från LiteCure LLC, Newark, DE, USA till L.D.T. Författarna vill tacka immunologi avdelning och utbildning utveckling Center (EDC) av Tabriz University of Medical Sciences för deras vänliga hjälp.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine Alfasan #1608234-01
Xylazine Alfasan #1608238-01
Agarose Sigma #A4679
Superglue Quickstar
Vibratome Campden Instruments #MA752-707
Optical glass Sail Brand #7102
Power meter Thor labs #PM100D
Photodiode detector Thor labs #S121C
Caliper Pittsburgh
GaAlAs laser Thor Photomedicine
Etho Vision Noldus
Centrifuge Froilabo #SW14R
Earmuffs Blue Eagle
Digital camera Visionlite #VCS2-E742H
Sterio amplifier Sony
Ethanol Hamonteb #665.128321
Barnes maze Costom-made
ATP assay kit Sigma #MAK190
Elisa reader Awareness #Stat Fax 2100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chung, H., et al. The nuts and bolts of low-level laser (light) therapy. Annals of Biomedical Engineering. 40 (2), 516-533 (2012).
  2. Salehpour, F., et al. Brain Photobiomodulation Therapy: a Narrative Review. Molecular Neurobiology. , 1-36 (2018).
  3. Hamblin, M. R. Shining light on the head: photobiomodulation for brain disorders. BBA Clinical. 6, 113-124 (2016).
  4. Karu, T. I., Pyatibrat, L. V., Kolyakov, S. F., Afanasyeva, N. I. Absorption measurements of a cell monolayer relevant to phototherapy: reduction of cytochrome c oxidase under near IR radiation. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 81 (2), 98-106 (2005).
  5. de Freitas, L. F., Hamblin, M. R. Proposed mechanisms of photobiomodulation or low-level light therapy. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 22 (3), 348-364 (2016).
  6. Xuan, W., Vatansever, F., Huang, L., Hamblin, M. R. Transcranial low-level laser therapy enhances learning, memory, and neuroprogenitor cells after traumatic brain injury in mice. Journal of Biomedical Optics. 19 (10), 108003 (2014).
  7. DeTaboada, L., et al. Transcranial application of low-energy laser irradiation improves neurological deficits in rats following acute stroke. Lasers in Surgery and Medicine: The Official Journal of the American Society for Laser Medicine and Surgery. 38 (1), 70-73 (2006).
  8. De Taboada, L., et al. Transcranial laser therapy attenuates amyloid-β peptide neuropathology in amyloid-β protein precursor transgenic mice. Journal of Alzheimer’s Disease. 23 (3), 521-535 (2011).
  9. Oueslati, A., et al. Photobiomodulation suppresses alpha-synuclein-induced toxicity in an AAV-based rat genetic model of Parkinson’s disease. PloS One. 10 (10), e0140880 (2015).
  10. Xu, Z., et al. Low-level laser irradiation improves depression-like behaviors in mice. Molecular Neurobiology. 54 (6), 4551-4559 (2017).
  11. Salehpour, F., et al. Transcranial low-level laser therapy improves brain mitochondrial function and cognitive impairment in D-galactose–induced aging mice. Neurobiology of Aging. 58, 140-150 (2017).
  12. Grady, C. The cognitive neuroscience of ageing. Nature Reviews Neuroscience. 13 (7), 491 (2012).
  13. Beal, M. F. Mitochondria take center stage in aging and neurodegeneration. Annals of Neurology. Official Journal of the American Neurological Association and the Child Neurology Society. 58 (4), 495-505 (2005).
  14. Lu, Y., et al. Low-level laser therapy for beta amyloid toxicity in rat hippocampus. Neurobiology of Aging. 49, 165-182 (2017).
  15. Seibenhener, M. L., Wooten, M. C. Use of the open field maze to measure locomotor and anxiety-like behavior in mice. Journal of Visualized Experiments. (96), e52434 (2015).
  16. Rosenfeld, C. S., Ferguson, S. A. Barnes maze testing strategies with small and large rodent models. Journal of Visualized Experiments. (84), e51194 (2014).
  17. Huang, Y. Y., Chen, A. C. H., Carroll, J. D., Hamblin, M. R. Biphasic dose response in low level light therapy. Dose Response. 7 (4), 358-383 (2009).
  18. Mohammed, H. S. Transcranial low-level infrared laser irradiation ameliorates depression induced by reserpine in rats. Lasers in Medical Science. 31 (8), 1651-1656 (2016).
  19. Zhang, Y., Zhang, C., Zhong, X., Zhu, D. Quantitative evaluation of SOCS-induced optical clearing efficiency of skull. Quantitative Imaging in Medicine and Surgery. 5 (1), 136 (2015).
  20. Shaw, V. E., et al. Neuroprotection of midbrain dopaminergic cells in MPTP-treated mice after near-infrared light treatment. Journal of Comparative Neurology. 518 (1), 25-40 (2010).
  21. Moro, C., et al. Photobiomodulation inside the brain: a novel method of applying near-infrared light intracranially and its impact on dopaminergic cell survival in MPTP-treated mice. Journal of Neurosurgery. 120 (3), 670-683 (2014).
  22. Reinhart, F., et al. The behavioural and neuroprotective outcomes when 670 nm and 810 nm near infrared light are applied together in MPTP-treated mice. Neuroscience Research. 117, 42-47 (2017).
  23. Sadowski, M., et al. Amyloid-β deposition is associated with decreased hippocampal glucose metabolism and spatial memory impairment in APP/PS1 mice. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 63 (5), 418-428 (2004).

Tags

Indragning fråga 141 transkraniell photobiomodulation låg nivå laserterapi rött ljus optiska egenskaper åldrande lärande minne hippocampus mus
Ett protokoll för transkraniell Photobiomodulation terapi hos möss
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Salehpour, F., De Taboada, L.,… More

Salehpour, F., De Taboada, L., Cassano, P., Kamari, F., Mahmoudi, J., Ahmadi-Kandjani, S., Rasta, S. H., Sadigh-Eteghad, S. A Protocol for Transcranial Photobiomodulation Therapy in Mice. J. Vis. Exp. (141), e59076, doi:10.3791/59076 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter