Summary
Kompleks biyolojik örneklerden her yerde bulunan proteinlerden kaynaklanan diGly peptidlerin arıtılmı, saptanması ve tanımlanması için bir yöntem salıyoruz. Sunulan yöntem çoğaltılabilir, sağlam ve ubiquitinome analizinin derinliği düzeyine göre yayınlanmış yöntemleri geride bırakır.
Abstract
Proteinlerin küçük protein ubiquitin tarafından posttranslational modifikasyonu birçok hücresel olaylarda yer almaktadır. Her yerde bulunan proteinlerin triptik sindiriminden sonra, lisin epsilon amino grubuna konjuge bir diglycine kalıntısı olan peptidler ('K-ε-diglycine' veya sadece 'diGly') orijinal modifikasyon bölgesini izlemek için kullanılabilir. Kitle spektrometresi ile hassas algılama ile birlikte diGly peptidlerin etkin immünpurifikasyonu, bugüne kadar tanımlanan ubikitinasyon bölgelerinin sayısında büyük bir artışa yol açmıştır. We have made several improvements to this workflow, including offline high pH reverse-phase fractionation of peptides prior to the enrichment procedure, and the inclusion of more advanced peptide fragmentation settings in the ion routing multipole. Ayrıca, antikor boncukları korumak için filtre tabanlı bir fiş kullanarak numunenin daha verimli temizlenmesi, diGly peptidler için daha fazla özgüllük sağlar. Bu gelişmeler, hücrede proteozom inhibisyonu üzerine insan servikal kanser hücrelerinden 23.000'den fazla diGly peptidin rutin tespiti ile sonuçlanır (HeLa) hücre lisatları. Bu stratejinin etkinliğini, birkaç farklı hücre tipinin ve beyin dokusu gibi in vivo örneklerinin ubiquitinome profillerinin derinlemesine analizi için gösteriyoruz. Bu çalışma derin hücresel ubiquitinome ortaya çıkarmak için protein ubiquitination analizi için araç kutusuna orijinal bir ek sunuyor.
Introduction
Proteinlere ubiquitin konjugasyonu proteozom tarafından bozulması için onları işaretler ve proteostaz önemli bir süreçtir. Ubikitin C-terminal karboksil grubu hedef protein1,,2lizin ε-amino grubu ile bir izopeptid bağ oluşturur. Buna ek olarak, ubikitin diğer ubikitin modülleri eklenebilir, homojen oluşumu ile sonuçlanan (yani, K48 veya K11) veya dallı (yani, heterojen veya karışık) poliubiquitin yapılar1,3. Ubiquitin en iyi bilinen fonksiyonu proteazomal bozulma rolüdür, K48 bağlı poliubiquitin aracılık. Ancak, hem mono-hem de poliubiquitination da proteozom tarafından bozulmabağımsız birçok süreçte rol oynadığı açık hale gelmiştir. Örneğin, K63 bağlı zincirleri hücre içi ticareti, lizomal bozulma, kinaz sinyalizasyonu ve DNA hasar yanıtı4,,5nondegradative rolleri var. Diğer altı bağlantı türleri daha az bol ve rolleri hala büyük ölçüde esrarengiz, hücredeki işlevleri hakkında ilk göstergeler ortaya çıkıyor olsa da, büyük ölçüde bağlantı-özel algılama sağlamak için yeni araçların geliştirilmesi nedeniyle6,7.
Kütle spektrometresi proteom analizleri için vazgeçilmez bir araç haline gelmiştir ve günümüzde hemen hemen her biyolojik kaynaktan binlerce farklı protein tek bir deneyde tespit edilebilir. Protein aktivitesini modüle edebilen proteinlerin (örn. fosforilasyon, metilasyon, asetilasyon ve her yerde) posttranslational modifikasyonları (PtM'ler) ile ek bir karmaşıklık tabakası sunulur. PTM taşıyan proteinlerin büyük ölçekli tanımlanması da kütle spektrometresi alanındaki gelişmelerle mümkün olmuştur. PBM'leri taşıyan peptidlerin, değiştirilmemiş muadillerine göre nispeten düşük stoiyometrisi teknik bir zorluk teşkil eder ve kütle spektrometresi analizi öncesinde biyokimyasal zenginleştirme adımları genellikle gereklidir. Son yirmi yılda, PTM'lerin analizi için birkaç farklı özel zenginleştirme yöntemi geliştirilmiştir.
Hücrede protein ubiquitination çok yönlü rolleri nedeniyle, proteinler üzerinde ubikitinasyon sitelerinin tespiti için analitik yöntemlerin geliştirilmesi için büyük bir talep var8. Kütle spektrometrik yöntemlerin uygulanması meyve sinek, fare, insan ve maya proteinleri9,10,,11,12,13,14tanımlanan ubiquitination sitelerin in sayısının bir patlamaya yol açmıştır . K-ε-GG kalıntısı motifine (ayrıca 'diglycine' veya 'diGly' olarak da adlandırılır) karşı yönlendirilmiş antikorlar kullanılarak peptid düzeyinde immünopreprezet bazlı zenginleştirme stratejilerinin geliştirilmesi ile önemli bir adım sunulmuştur. Bu diGly peptidler proteazolaraktripsin kullanarak her yerde proteinlerin sindirim üzerine üretilir15 ,16.
Burada, orbitrap kütle spektrometresi tarafından immünpurifikasyon ve sonraki tespiti kullanarak diGly peptidler için zenginleştirmek için optimize edilmiş bir iş akışı saiyoruz. Özellikle numune hazırlama ve kütle spektrometresi aşamalarında mevcut iş akışlarının çeşitli değişikliklerinin bir kombinasyonunu kullanarak, proteozom ile tedavi edilen Tek Bir HeLa hücresi örneğinden rutin olarak 23.000'den fazla diGly peptid tespit edebiliriz. inhibitörü ve tedavi edilmeyen HeLa hücrelerinden ~ 10.000. Bu protokolü, hücre kültüründe (SILAC) etiketli amino asitlerle etiketsiz ve kararlı izotop etiketlemeden gelen lysatlara ve beyin dokusu gibi endojen örneklere uyguladık.
Bu iş akışı, derin ubiquitinome ortaya çıkarmak için her yerde analiz için araçların repertuar değerli bir ek sunuyor. Aşağıdaki protokol, iş akışının tüm adımlarını ayrıntılı olarak açıklar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada açıklanan tüm yöntemler Erasmus MC Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (EDC) tarafından onaylanmıştır.
1. Örnek hazırlama
- Kültürlü hücreler
- İlgi çekici bir hücre hattı (örneğin, HeLa veya osteosarkom [U2OS] hücreleri) seçin ve Dulbecco'nun Minimal Eagle Medium (DMEM) hücreleri% 10 ısı inaktive fetal sığır serumu (FBS) ve 100 adet/ mL penisilin / streptomisin ile takviye hücreleri büyümek.
- Kantitatif proteomik deneyler için, DMEM kültür hücreleri arginin ve lizin yoksun. Ortam %10 diyalizfetal büyükbaş hayvan serumu (FBS), 100 ünite/mL penisilin/streptomisin ve alanin-glutamin ile desteklenmelidir. Konvansiyonel lizin ve arginin ('Işık' Orta) veya lizin-8(13C6; 15N2) ve arginin-10 (13C6; 15N4) ('Ağır' Orta), sırasıyla.
- Heavy Medium kültüründeki tüm proteinlerin ağır kararlı izotop içeren olarak etiketlenmelerini sağlamak için genişleme ve tedaviden önce en az altı katlama için Light Medium (yani etiketlenmemiş) ve Heavy Medium (yani etiketlenmemiş) ve Heavy Medium'daki hücrelerin kültür toplu lukları amino asitler.
- Hücreleri 8 saat boyunca 10 μM proteozomib veya eşdeğer bir DMSO hacmi ile sahte bir tedavi olarak tedavi edin. Hücreleri PBS ile yıkayın, %1 tripsin/EDTA kullanarak ayırın ve hücreleri peletleyin.
- Hücre peletini bir 150 cm2 kültür plakasından 2 mL buz gibi 50 mM Tris-HCl (pH = 8,2) ve %0,5 sodyum deoksikoilat (DOC) test edin. Lysat'ı 95 °C'de 5 dakika kaynatın ve 10 dakika sonicate (Malzeme Tablosundalistelenen sonicator için "H" ayarı) 4 °C'de kaynatın. N-etilmaleimid (NEM) gibi deubiquitinaz inhibitörlerinin kullanılmasını önermiyoruz, çünkü bu peptit tanımlamasını zorlaştırabilecek istenmeyen protein modifikasyonlarına neden olabilir.
- In vivo fare beyin dokusu
- In vivo doku kullanırken, 100 mM Tris-HCl (pH = 8.5), 12 mM sodyum DOC ve 12 mM sodyum N-lauroylsarcosinate17içeren buz gibi bir tampon doku lyse . 4 °C'de 10 dakika (Malzeme Tablosundalistelenen sonicator için "H" ayarı) için lysate'yi sonicate edin ve 95 °C'de 5 dakika kaynatın.
- Kolorimetrik absorbe BCA protein teşp kiti kullanarak toplam protein miktarını hesaplatın. Başarılı bir diGly peptid immünopresipitendivarı (IP) için toplam protein miktarı en az birkaç miligram olmalıdır. SILAC deneyleri için, hafif ve ağır etiketli proteinler toplam protein miktarına göre 1:1 oranında karıştırılır.
- 5m 1,4-dithiothreitol kullanarak tüm proteinleri 50 °C'de 30 dakika boyunca azaltın ve daha sonra karanlıkta 15 dakika boyunca 10 mM iyodoacetamid ile alkilleyin. Protein sindirimini Lys-C (1:200 enzim-substrat oranı) ile 4 saat boyunca, ardından 30 °C'de veya oda sıcaklığında (RT) tripsin (1:50 enzim-substrat oranı) ile gece sindirimini gerçekleştirin.
- Sindirilmiş numuneye trifloroasetik asit (TFA) ekleyin ve tüm deterjanları çökeltmek ve çıkarmak için numuneyi 10.000 x g'de 10.000 x g olarak santrifüj edin. Sonraki fraksiyonu için peptidler içeren supernatant toplamak.
2. Çevrimdışı peptid fraksiyonu
- Triptik peptidleri fraksiyonetmek için boş bir sütun kartuşuna yüklenen polimerik sabit faz malzemesiyle (300 Å, 50 μM; bkz. Malzeme Tablosu)yüklü yüksek pH ters faz (RP) C18 kromatografisi kullanın. Sabit faz yatak boyutu kesirli olması için protein sindirimi miktarına ayarlanmalıdır. ~10 mg protein sindirimi için 0,5 g sabit faz malzemesi ile doldurulmuş boş bir 6 mL sütun kartuşu hazırlayın (Bkz. Malzeme Tablosu). Protein sindirimi nin sabit faz oranı yaklaşık 1:50 (w/w) olmalıdır.
- Peptitleri hazırlanan kolona yükleyin ve kolon %0,1 TFA'nın yaklaşık 10 sütun hacmi yle yıkayın ve ardından yaklaşık 10 sütun hacmi H2O'yu takip edin.
- Peptitleri sırasıyla %7, %13,5 ve %50 asetonitril (AcN) ile 10 mM amonyum formatı çözeltisi (pH = 10) olmak üzere 10 sütun hacmine sahip üç fraksiyona ayırın. Tamlığa tüm kesirleri lyophilize.
- DiGly peptidlerin immünzenginleştirilmesi için protein a agarose boncuklar konjuge ubiquitin kalıntı motifi (K-ε-GG) antikorları kullanın. Boncuk toplu başına antikor tam miktarı tescilli bilgi ve üretici tarafından açıklanmadığından, karışıklık önlemek için üretici yaptığı gibi boncuk bir toplu için aynı tanımı kullanılması tavsiye edilir. Bu boncuklardan bir parti 2x PBS ile yıkayın ve boncuk bulamacını altı eşit kesire bölün. Ayrıntılı bir deneysel şema için Şekil 1'e bakın.
- Adım 2.3'te toplanan üç peptit fraksiyonunu 50 mM MOPS, 10 mM sodyum fosfat ve 50 mM NaCl (pH = 7,2) oluşan bir tamponun 1,4 mL'sinde çözün ve enkazı aşağı doğru döndürün.
- Kesirlerin süpernatantlarını diGly antikor boncuklarına ekleyin ve bir rotator ünitesinde 4 °C'de 2 saat kuluçkaya yatırın. Boncukları aşağı çevirin ve süpernatant'ı yeni bir antikor boncuk partisine aktarın ve 4 °C'de 2 saat boyunca tekrar kuluçkaya yatırın.
- Sonraki küresel proteom (GP) analizi için süpernatantları saklayın.
- Boncukları korumak için boncukları her fraksiyondan GF/F filtre fişi ile donatılmış 200 μL'lik pipet ucuna aktarın. Boncuklu pipet ucunu santrifüj ucu adaptörü ile donatılmış 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe koyun. Boncukları 3x 200 μL buz gibi IAP tamponu yla yıkayın ve daha sonra 3x 200 μL buz gibi miliQ H2O. Her yıkama adımından önce 2 00 x g'de 2 dk'da kolona doğru çevirin, ancak sütunun kurumasına izin vermemeye dikkat edin. %0,15 TFA'nın 50 μL'lik 2 döngüsü kullanılarak peptidleri eute.
- C18 kademeli uç (aslında iki C18 diskli 200 μL pipet ucu) kullanarak peptidleri tuzlayın ve vakum santrifüjü kullanarak tamlığa kadar kurulayın.
3. Nanoflow LC-MS/MS
- Nanoflow LC sistemine bağlı hassas bir kütle spektrometresi üzerinde LC-MS/MS deneyleri yapın.
- CSH130 reçine (3,5 μm, 130 Å) ile paketlenmiş 75 μm iç çapı ile bir şirket içi paketlenmiş 50 cm ters faz lı kolon kullanın ve 300 nL/dk'da 120 dk'nın üzerinde %2−28 (AcN, %0,1 FA) bir degrade ile peptidleri yakınlaştırın, alternatif olarak benzer özelliklere sahip ticari olarak mevcut LC sütunları kullanın. Sütunu bir sütun fırını kullanarak 50 °C'de tutun (bkz. Malzeme Tablosu).
- Kütle spektrometresi analizini yapın.
- Kütle spektrometresi veriye bağlı kazanım (DDA) modunda çalıştırılmalıdır. MS1 kütle spektrumları yüksek çözünürlükte (örn. 120.000), otomatik kazanç kontrolü (AGC) hedef ayarı 4E5 ve Orbitrap kütle spektrometresi durumunda maksimum 50 ms enjeksiyon süresi ile toplanmalıdır.
- Önce "Önce En Yüksek Yoğunluk" modunda kütle spektrometresi analizini yapın. Bu şekilde, en yoğun iyon parçalanma için ilk seçilir, daha sonra ikinci en yüksek, ve benzeri, 3 s toplam çevrim süresi ile en yüksek hız yöntemi kullanılarak. Daha sonra, "Önce En Düşük Yoğunluklu" modunda ikinci bir DDA MS analizi turu gerçekleştirin, böylece en az yoğun iyon önce, sonra ikinci en düşük ve benzeri seçilir. Bu strateji, çok düşük bolluk peptidlerin en iyi şekilde algılanmasını sağlar.
- Öncül iyonları şarj durumlarına (2-7 şarj) ve monoizotopik atamaya göre filtreleyin. Daha önce sorgulanmış öncülleri 60 s. Dörtkutuplu kütle filtresi 1,6 Th genişliğe ayarlanmış peptid öncülerini izole edin.
- Maksimum enjeksiyon süresi 50 ms ve HCD çarpışma enerjisi %30 olan 7E3 AGC'de iyon kapanında MS2 spektrumlarını toplayın.
4. Veri analizi
- Andromeda arama motoru18,dayalı serbestçe kullanılabilir MaxQuant yazılım paketi gibi uygun bir arama motoru kullanarak kütle spektrometresi ham dosyaları analiz ,19. MaxQuant'ta, aşağıda belirtilen birkaç uyarlamaiçeren varsayılan ayarları seçin. Enzim özgüllüğünü tripsin olarak ayarlayın ve en fazla kaçırılan dekolte sayısı üçe yükseltilir. DiGly kalıntısı (+114.04 Da) ile lizin ayarlayın, metiyonin ve N-terminal asetilasyonunun oksidasyonu değişken modifikasyonlar olarak ve sistein karbamidometilasyonunu sabit bir modifikasyon olarak ayarlayın.
- Veritabanı aramalarını, örneğin, Tek prot deposu(https://www.uniprot.org/downloads)ile birlikte indirilen protein dizilerini içeren bir FASTA dosyasına karşı gerçekleştirin ve otomatik olarak MaxQuant tarafından sağlanan standart bir ortak kirletici veritabanıile birlikte yapın. Yanlış bulma oranını (FDR) %1'e ayarlayın ve değiştirilmiş (diGly) peptidler için minimum puanı 40 (varsayılan değer) olarak ayarlayın. C-terminal diGly modifiye lisin kalıntısı ile tanımlanan peptidleri daha ileri analizlerden dışlayın.
- SILAC deneme dosyalarının nicel analizi için, çokluğu "2" olarak ayarlayın ve 4.2 adımını yineleyin.
- MaxQuant yazılım paketinin Perseus modülü20 ile tüm downstream analizlerini (örn. istatistikler, gen ontoloji analizleri) gerçekleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ubikitinated proteinler, proteinler tripsin ile sindirildiğinde hedef lizin kalıntısında 114.04 Da diglycine kalıntısı bırakırlar. Bu motifin neden olduğu kütle farkı, bir kütle spektrometresi deneyinde her yerde bulunan yeri kesin olarak tanımak için kullanılmıştır. Burada tanımladığımız strateji, nanoflow LC-MS/MS(Şekil 1A)ile diGly peptidlerin zenginleşmesi ve sonraki tanımlaması için son teknoloji ürünü bir yöntemdir. Bu çalışmada, hem kültür hücreleri hem de in vivo materyal proteinlerin biyolojik kaynağı olarak kullanılmıştır, ancak bu protokol herhangi bir protein kaynağı ile uyumludur. Protokoldeki adımları takiben, 2-20 mg protein girdisinden 10.000-25.000 diGly peptidin tanımlanması kolay olmalıdır. Hücrelerde protein ubiquitination ölçüde artırmak için, bortezomib veya MG132 gibi bir proteozom inhibitörü hücreleri hasat birkaç saat önce eklenebilir. Proteozom inhibitörü kullanılmamışsa, tanımlanan diGly peptidlerin sayısı anlamlı olarak daha düşüktür (%30-40).
Mevcut protokollerde çeşitli iyileştirmeler yaptık. İlk olarak, peptit karışımının karmaşıklığını azaltmak için ters faz kromatografisine ve yüksek pH'da sonraki elüsasyona dayalı üç fraksiyona kaba bir fraksiyon yapılır. Bu kesirler peptid tanımlamalarında çok düşük bir çakışma gösterir ve fraksiyon başına karşılaştırılabilir sayıda diGly peptid tanımlanmalıdır(Şekil 2). Bu, bu kesirlerin her birinde tanımlanan yüksek sayıda benzersiz diGly peptidler ile sonuçlanır. Daha da önemlisi, kesirlerden biri (genellikle ikinci) ubiquitin kendi K48 değiştirilmiş triptik diGly peptid LIFAGK(GG)QLEDGR (m/ z 730.39) içermelidir. Bu kadar immünopsipitated fraksiyonu en bol peptid ve LC kromatogram(Şekil 1B)yoğun ve geniş tepe ile karakterizedir. Bu bir kıyaslama kromatografik zirve ve kromatogram yok ise IP büyük olasılıkla başarısız oldu.
Başka bir gelişme DDA analiz prosedürüadaptasyonu kütle spektrometre iyon yönlendirme multipole olduğunu. Geleneksel üst N veribağımlı edinimde (DDA), parçalanma için MS1 spektrumundaki N zirveleri seçilir. Bu parçalanma şeması önce en yüksek yoğunluklu tepe ile başlar, ardından ikinci en yüksek yoğunluk zirvesi, ve saire. Alternatif bir parçalanma düzeninde, en az yoğun tepe ilk seçilir, ikinci en yoğun zirve, vb takip Bu seçim sırasının ardındaki mantık, çok düşük bol peptidleri parçalamak için yeterli zaman olmasıdır. Aslında, "en yüksek ilk" ve "en düşük ilk" DDA çalıştırmaları standart DDA ayarlarına sahip yinelenen LC-MS analizine kıyasla birleştirildiğinde peptit tanımlamalarının sayısının arttığını bulduk (yani, ilk en yüksek). Daha kapsamlı ubiquitinome profilleme için, bu nedenle veri analizi yordamında LC-MS çalışır "en yüksek ilk" ve "en düşük ilk" parçalanma rejimleri ile birleştirmek için tavsiye edilir. Bu "en düşük ilk" strateji, sadece konvansiyonel DDA rejimi kullanıldığında tespit edilmeyen 4.000'den fazla benzersiz diGly peptid üretebilir(Şekil 2).
Son olarak, ilk IP'den sonra flowthrough ek IP'ler başka bir ~ 2.500 benzersiz diGly peptidler üretebilir(Şekil 2).
Her yerde profilleme literatürde Makaleler genellikle 10.000 civarında tespit diGly peptidler12,21. Burada, üç biyolojik çoğaltma ekranı üzerinde tanımlanan tüm diGly peptidler, >9,000 her üç mevcut iken,>17,000 üç çoğaltma en az iki mevcuttu(Şekil 3). Tipik olarak, burada açıklanan protokolü izleyerek bir standart cst antikor boncuk ları kullanarak 15-20 mg protein örneğinden >21.000 adet benzersiz diGly peptid saptanmalıdır. Saflık ve seçicilik açısından tanımlanan diGly peptidler ile değiştirilmemiş peptidler arasındaki oran her zaman >0.5 olmalıdır. DiGly peptid tanımlamalarının sayısı protein giriş materyalinin miktarına son derece bağlıydı. Yaklaşık 2.500 diGly peptid tanımlaması üretilen sadece 1 mg giriş materyali ile yapılan bir IP, 10 mg protein giriş materyali ile >15.000 diGly peptid tanımlaması üretildi. Tablo 1, her durum için tanımlanan diGly peptidlerin beklenen sayısını listeler. Bu sayıların sadece tahmin olduğu ve kullanılan kütle spektrometresinin türüne bağlı olduğu unutulmamalıdır. Şekil 4, düşük, orta ve yüksek miktarda giriş materyali ile diGly peptid tanımlamaları arasındaki örtüşmeyi göstermektedir.
Yukarıda açıklanan ubiquitination site analizi için iyileştirmeler katma değerini göstermek için, biz de proteozom inhibitörü bortezomib ile tedavi edildi SILAC etiketli HeLa hücrelerinin kantitatif ubiquitinomic analizi yapıldı çoğaltılmış etiket takas tahlilde tedavi edilmemiş kontrol hücreleri ile karşılaştırıldığında. Yarısından fazlası (>55%) IP üzerine eluate tüm tespit peptidler diGly peptidler edildi. 19.000'den fazla benzersiz diGly peptid ler tespit edildi, bu da SILAC olmayan bir etiketteki örneğe göre sadece biraz daha az. Bunun nedeni peptit tepe çiftleri varlığı nedeniyle bir SILAC tsay MS1 spektrumların yüksek karmaşıklığı olabilir. SILAC analizinde, sadece ileri durumda tanımlanan diGly peptid lerin sayıları arasında nispeten büyük farklar gözlenmiştir (örn. bortezomib ağır kanalda hücreleri tedavi, ışık kanalında kontrol hücreleri) ve bu sadece ters durumda tanımlanan (yani, bortezomib ışık kanalında hücreleri tedavi, ağır kanalda kontrol hücreleri), Bu durumda 1,752 karşı 6,356(Ek Tablo 1). MaxQuant yazılımını "çokluk = 2" (yani iki kanallı SILAC) modunda çalıştırırken, ağır kanalda sıfır yoğunlukta (hemen hemen hepsi ters deneyde gelir) ve ışık kanalında sıfır olmayan yoğunluk değeriile 7.555 diGly peptid tanımlanmıştır. Buna karşılık, hiçbir diGly peptidler ışık kanalında sıfır yoğunluk değeri eşliğinde ağır kanalda sıfır olmayan yoğunluk değeri ile tespit edildi. Aynı veri kümesi üzerinde bir MaxQuant analizi diGly moiety ve etiketli amino asit tek bir değişken modifikasyon u kombine ile "çokluk = 1" modunda yapıldığında, birçok ağır diGly peptit varyantları tespit edildi, bu peptit hiçbir ışık muadili tespit edilemese bile. Bunun için en olası açıklama, yazılımın sadece ağır kanalda bulunan diGly peptidlerin tanımlanması ile başa çıkamamasıdır. Proteozomin inhibisyonu yeni her yerde bulunan sitelerin oluşumunu tetikleyeceği için bu fenomenin yoğun olarak ortaya çıkma olasılığı yüksektir. MaxQuant,bu sorunlarla başa çıkmak için geliştirilen ve bunun düzeltilmesi gereken "requantify" seçeneği onay kutusunu işaretlemek, bu sorunu tamamen önlemek için yetersiz görünüyor. Açıkçası, diGly peptidlerin çok çoğunluğu proteozom inhibisyonu üzerine de novo upregulated veya oluşan, peptit havuzunun üçte ikiden fazla en az 1,5 H:L oranları var çünkü(Şekil 5B).
Son olarak, bu ubiquitination site analiz yöntemini in vivo doku örneğine uyguladık. Etkinliğini değerlendirmek için, taze fare beyninden yaklaşık 32 mg protein çıkardık (ıslak doku ağırlığının ~%10'u proteindir). Beyin materyali proteozom inhibitörleri veya genel protein ubiquitination artırabilir başka bir reaktif ile tedavi edilmedi. Bu örnekten 10.871 adet benzersiz diGly peptid saptandı (Ek Tablo 2). Bu dokuda tanımlanan tüm diGly peptidler sabit durumda her yerde endojen bölgelerden kaynaklanmaktadır. Küresel her yerde yaygınlaşmayı artırmak için hiçbir tedavi (örn. proteozom inhibisyonu) uygulanmadı. Bu nedenle bu ubikitinasyon siteleri en azından kısmen ortaya çıkan (poli)her yerde olmayan proteozom aracılı hücresel sinyalizasyon olayları, literatürde önerilen fikirler ile uyum içinde olan5,16,22.
Sonuç olarak, burada açıklanan yöntem tekrarlanabilir bir şekilde ubiquitinome derinlemesine araştırılması için izin verir. Bu işlemle elde edilen tipik sonuçlara genel bir bakış içinbkz.
Şekil 1: Deneysel genel bakış. (A) Deneysel yaklaşıma genel bakış. Örnekler yüksek pH elüsasyonu ile ters faz kromatografi si kullanılarak üç fraksiyona ayrıldı, denemiş ve üç fraksiyona ayrılmıştır. Ticari α-diGly peptid antikor boncuklarından bir kısmı altı eşit fraksiyona bölündü ve üç peptit fraksiyonu daha sonra boncuk fraksiyonlarının üçüne yüklendi. DiGly peptidler immünopurified edildi, eluted, ve toplanan, ve akış daha sonra kalan üç taze boncuk fraksiyonları transfer edildi. Toplanan diGly peptidler, lumos Orbitrap kütle spektrometresi üzerindeki kütle spektrometresi ile en yoğun zirvelerin ilk olarak peptit parçalanması için seçildiği ve en yoğun zirvelerin ilk seçildiği bir döngüyü birleştiren iki katmanlı bir şemaya göre analiz edildi. NLC-MS/MS çalıştırmalarının tamamı MaxQuant kullanılarak analiz edildi. (B) Kesirlerden biri ubiquitin kendi K48 modifiye triptik diGli peptid LIFAGK(GG)QLEDGR (m/z 730.39) içermelidir. Bu kadar immünopsipitated fraksiyonu en bol peptid ve 120 dk degrade 50-55 dakika arasında LC kromatogramda yoğun ve geniş tepe ile karakterize oldu. Bu kıyaslama zirvesi kromatogramda yoksa IP büyük olasılıkla başarısız oldu. Bu rakam Van Der Wal ve ark.23'tendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Üç iyileştirme adımının her biri için saptanan diGly peptid sayısı. (A) İmmünyağış öncesi ham fraksiyonun etkisi. Üç ayrı fraksiyonda tanımlanan diGly peptit popülasyonları arasındaki örtüşme gösterilmiştir. (B) Birinci ve ikinci kuluçka adımlarının etkisi. (C) Ayarlanmış peptit parçalanma rejiminin sonuçları. Bu rakam Van Der Wal ve ark.23'tendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Bortezomib tedavi edilmiş hücrelerin üç biyolojik çoğaltıcısında saptanan diGly peptidler, koşular arasındaki çakışma miktarını gösterir. Bu rakam Van Der Wal ve ark.23'tendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Düşük (4 mg), orta (10 mg) ve yüksek (40 mg) toplam protein giriş miktarları ile yapılan analizlerden tanımlanan diGly peptidlerin örtüşmesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: SILAC etiketli hücrelerde diGly peptidlerin saptanması. (A) SILAC'ın ileri ve geri koşullarında tespit edilen peptid sayısı 1 ve 2 çokluk ayarları için HeLa hücrelerini etiketletir. (B) Bortezomib (Btz) diGly peptid SILAC oranlarının Dağılım plot HeLa hücreleri tedavi. Sadece ileri ve geri deneylerde tanımlanan ve ölçülen peptidler gösterilmiştir. Bu rakam Van Der Wal ve ark.23'tendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Durum | Giriş malzemesi miktarı (mg) | Tanımlanmış diGly peptidlerin beklenen sayısı |
| Tedavi edilmeyen HeLa hücreleri | 10 | 7,500 |
| Proteozom inhibitörü tedavi HeLa hücreleri | 1 | 2,500 |
| 2 | 5,000 | |
| 10 | 15,000 | |
| 20 | 20,000 | |
| 40 | >25.000 | |
| Doku (fare beyni) | 30 | >10.000 |
Tablo 1: Farklı durumlar için diGly peptid tanımlamalarının beklenen sayısı. Bu sayılar yalnızca tahminlerdir ve kullanılan deneysel ayarlara bağlıdır.
Ek Tablo 1. Bu tabloyu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklayın).
Ek Tablo 2. Bu tabloyu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklayın).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan protokol, kültür hücreleri ve in vivo doku gibi çeşitli biyolojik kaynaklardan alınan örneklere uygulanmıştır. Her durumda, toplam protein giriş miktarının en az 1 mg olması koşuluyla binlerce diGly peptid tespit ettik. Spesifik antikorlar kullanılarak zenginleştirme, ubikitinated proteinler veya diGly peptidler için hiçbir zenginleştirme prosedürleri uygulanmış ise sadece en fazla 100-150 çok düşük bol diGly peptidler tüm hücre lysates tespit edildiği göz önüne alındığında, son derece etkilidir. Açıkçası, hassas kütle spektrometresi diGly kimlikleri yüksek sayıda elde etmek için bir ön koşuldur. Birkaç farklı kütle spektrometresini başarıyla kullanmamıza rağmen, Orbitrap Tribrid Lumos'u en yüksek verimi veren en hassas olan olarak bulduk.
IP'ler gerçekleştirilmeden önce yüksek pH elüsasyonuna sahip çevrimdışı RP kromatografisi test edilmelidir. Peptit tanımlamaları açısından fraksiyonlar arasındaki örtüşme, optimal bir deney için mümkün olduğunca düşük olmalıdır. IP'den sonra kesirlerden biri ubiquitin'in kendi K48 modifiye edilmiş triptik diGtik diGly peptid LIFAGK(GG)QLEDGR (m/z 730.39) içermelidir. Bu kadar immünopsipitated fraksiyonu en bol peptid ve 120 dk gradyan 50-55 dakika arasında LC kromatogramda yoğun ve geniş tepe ile karakterizedir(Şekil 1B). Bu kıyaslama zirvesi kromatogramda yoksa, IP büyük olasılıkla başarısız oldu.
IP prosedüründen hemen sonra immünopsipitated diGly triptik peptidlerin analiz edilmesi önemlidir, bu nedenle IP ile analiz arasındaki süre minimumda tutulmalıdır. Bu süre zarfında, peptidler tercihen plastik tüpler yerine cam bir şişe de saklanmalıdır. Rt'de veya -20 °C'de çok uzun süre plastik tüplerde peptidler bırakmak, peptidlerin çökelmesine ve/veya plastik tüp duvarına yapışmasına neden olabilir. Bu sonuçta analizin hassasiyetini etkileyecektir.
Literatürde iodoacetamide adducts'ın aynı 114.04 Da kütle değişimleri24nedeniyle ubikitinasyon siteleri olarak yanlış yorumlanması na dair raporlar olmasına rağmen, immünoppresipitated triptik peptidlerin preparatları ile bunun herhangi bir belirtisi ni bulamadık. İlk olarak, iodoacetamide kullanmanın yan etkileri (IAM) yukarıda açıklanan alkilyasyon azaltma protokolü kullanılarak elimizde minimaldir. İkincisi, antikor bir diglycine kalıntısı ile peptidler için özeldir. Lizin kalıntılarına kovalent olarak eklenen iki iyodoacetamide moieties ile peptidler bu protokolde zenginleştirilmemelidir. Üçüncü olarak, immünopsipitated fraksiyonundaki peptidlerin çoğu proteozom inhibisyonu üzerine düzenlenir, yukarıda açıklanan SILAC deneyinde örneklendirilir(Şekil 5). Her yerde bulunan proteinlerin popülasyonu bu tedavinin bir sonucu olarak etkilendiği için, bu etkilenen peptidlerin her yerde bulunan proteinlerden kaynaklanan diGly peptidler olması son derece olasıdır.
Son olarak, bu protokol TMT19kullanarak son zamanlarda yayınlanan çok katlı nicel strateji ile birlikte kullanılabilir. Açıkçası, yayınlanan diGly peptid numaraları biraz mevcut protokol kullanılarak elde edilen daha düşük olmasına rağmen, nispeten aynı anda 16 örnek kadar ölçmek için yeteneği büyük bir avantajdır. Bu yöntemlerin birleştirilmesi araştırmacılar ın büyük ölçekli kantitatif ubiquitinome çalışmaları büyük derinlemesine gerçekleştirmek için izin verecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan etmezler.
Acknowledgments
Bu çalışma, Hollanda Bilimsel Araştırma Örgütü (NWO) tarafından Ulusal Yol Haritası Büyük Ölçekli Araştırma Tesisleri (proje numarası 184.032.201) kapsamında finanse edilen Hollanda Proteomik Merkezi'nin bir programı olan "Proteins at Work" projesinin bir parçasıdır. ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-Dithioerythritol | Sigma-Aldrich | D8255 | |
| 3M Empore C18 Octadecyl disks | Supelco | 66883-U | product discontinued at Supelco; CDS Analytical is the new manufacturer (https://www.cdsanalytical.com/empore) |
| Ammonium formate | Sigma-Aldrich | 70221 | |
| Bortezomib | UBPbio | ||
| CSH130 resin, 3.5 μm, 130 Å | Waters | ||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 34869 | |
| DMEM | ThermoFisher | ||
| EASY-nanoLC 1200 | ThermoFisher | ||
| FBS | Gibco | ||
| GF/F filter plug | Whatman | 1825-021 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | |
| Lysine, Arginine | Sigma-Aldrich | ||
| Lysine-8 (13C6;15N2), Arginine-10 (13C6;15N4) | Cambridge Isotope Laboratories | ||
| Lysyl Endopeptidase(LysC) | Wako Pure Chemicals | 129-02541 | |
| NanoLC oven | MPI design, MS Wil GmbH | ||
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L-5125 | |
| Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer | ThermoFisher | ||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher / Pierce | 23225 | |
| PLRP-S (300 Å, 50 µm) polymeric reversed phase particles | Agilent Technologies | PL1412-2K01 | |
| PTMScan Ubiquitin Remnant Motif (K-ε-GG) Kit | Cell Signaling Technologies | 5562 | |
| Sep-Pak tC18 6 cc Vac Cartridge | Waters | WAT036790 | Remove the tC18 material from the cartridge before filling the cartridge with PLRP-S |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| Tris-base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Trypsin, TPCK Treated | ThermoFisher | 20233 |
References
- Clague, M. J., Urbé, S. Ubiquitin: Same molecule, different degradation pathways. Cell. 143, 682-685 (2010).
- Ciechanover, A. The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway. Cell. 79 (1), 13-21 (1995).
- Ohtake, F., Tsuchiya, H. JB special review - Recent topics in ubiquitin-proteasome system and autophagy: The emerging complexity of ubiquitin architecture. Journal of Biochemistry. 161 (2), 125-133 (2017).
- Bergink, S., Jentsch, S. Principles of ubiquitin and SUMO modifications in DNA repair. Nature. 458 (7237), 461-467 (2009).
- Komander, D., Rape, M. The Ubiquitin Code. Annual Review of Biochemistry. 81 (1), 203-229 (2012).
- Michel, M. A., Swatek, K. N., Hospenthal, M. K., Komander, D. Ubiquitin Linkage-Specific Affimers Reveal Insights into K6-Linked Ubiquitin Signaling. Molecular Cell. 68 (1), 233-246 (2017).
- Swatek, K. N., et al. Insights into ubiquitin chain architecture using Ub-clipping. Nature. 572, 533-537 (2019).
- Peng, J., et al. A proteomics approach to understanding protein ubiquitination. Nature Biotechnology. 21 (8), 921-926 (2003).
- Wagner, S. A., et al. Proteomic Analyses Reveal Divergent Ubiquitylation Site Patterns in Murine Tissues. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (12), 1578-1585 (2012).
- Iesmantavicius, V., Weinert, B. T., Choudhary, C. Convergence of Ubiquitylation and Phosphorylation Signaling in Rapamycin-treated Yeast Cells. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 1979-1992 (2014).
- Elia, A. E. H., et al. Quantitative Proteomic Atlas of Ubiquitination and Acetylation in the DNA Damage Response. Molecular Cell. 59 (5), 867-881 (2015).
- Wagner, S. A., et al. A Proteome-wide, Quantitative Survey of In Vivo Ubiquitylation Sites Reveals Widespread Regulatory Roles. Molecular & Cellular Proteomics. 10 (10), M111.013284 (2011).
- Udeshi, N. D., et al. Methods for Quantification of in vivo Changes in Protein Ubiquitination following Proteasome and Deubiquitinase Inhibition. Molecular & Cellular Proteomics. 11, 148-159 (2012).
- Sap, K. A., Bezstarosti, K., Dekkers, D. H., Voets, O., Demmers, J. A. Quantitative proteomics reveals extensive remodeling of the ubiquitinome after perturbation of the proteasome by dsRNA mediated subunit knockdown. Journal of Proteome Research. 16 (8), 2848-2862 (2017).
- Xu, G., Paige, J. S., Jaffrey, S. R. Global analysis of lysine ubiquitination by ubiquitin remnant immunoaffinity profiling. Nature Biotechnology. 28 (8), 868-873 (2010).
- Kim, W., et al. Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome. Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).
- Wakabayashi, M., et al. Phosphoproteome analysis of formalin-fixed and paraffin-embedded tissue sections mounted on microscope slides. Journal of Proteome Research. 13 (2), 915-924 (2014).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (June), 731-740 (2016).
- Rose, C. M., et al. Highly Multiplexed Quantitative Mass Spectrometry Analysis of Ubiquitylomes. Cell Systems. 3 (4), 395-403 (2016).
- Kaiser, S. E., et al. Protein standard absolute quantification (PSAQ) method for the measurement of cellular ubiquitin pools. Nature Methods. 8 (8), 691-696 (2011).
- Van Der Wal, L., et al. Improvement of ubiquitylation site detection by Orbitrap mass spectrometry. Journal of Proteomics. (July), (2017).
- Nielsen, M. L., et al. Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry. Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).
