Summary
Burada, merkezi sinir sisteminde etkili gen susturma sağlayan beyin hedeflemepeptipeptipeptik peptid-siRNA formülasyonunun intranazal uygulaması için farelerin uygun yerleştirilmesine olanak tanıyan bir fare konumlandırma cihazı kullanarak bir protokol salıyoruz.
Abstract
İntranazal (IN) beyne ilaç teslimi, ilaçların merkezi sinir sistemine (CNS) ulaştırılması için kan-beyin bariyerini (BBB) atlamak için umut verici bir yöntem olarak ortaya çıkmıştır. Son çalışmalar bir peptid kullanımını göstermektedir, RVG9R, Kuduz virüsü glikoprotein minimal reseptör bağlayıcı etki alanı içeren, beyinde nöronlar içine siRNA teslim ilike. Bu protokolde, peptid-siRNA formülasyonu baskın elde bir pipet ile intranasally teslim edilirken, anestezili fare akciğere drenajı önlemek için baskın olmayan el ile "baş aşağı ve ileri pozisyonunda" scruff tarafından ölçülür. ve teneffüs üzerine mide. Farelerin bu hassas kavrama öğrenilebilir ama kolay değildir ve etkili CNS alımı neden uygulama ve beceri gerektirir. Ayrıca, süreç, her teneffüs arasında 3-4 dk dinlenme süreleri ile, inhalasyon başına 1-2 μL damlacık hacimleri ~ 20-30 μL çözeltitoplam hacmi nin yönetimi için yaklaşık 45 dakika gerektiren, uzun çizilmiş. Bu çalışmanın amacı, peptid-siRNA formülasyonunun verimli in uygulanması için farelerin uygun yerleşimini sağlayan bir fare konumlandırma cihazını ifşa etmektir. Cihazın tasarımına, ayarlanabilir yüksekliğe sahip dört veya sekiz konumlandırma sandalyesi ve baş aşağı ve ileri pozisyonunda anestezili fareleri dizginlemek için eğim gibi birden fazla özellik dahil edilerek farelerin nares'inin kolay görüntülenmesi ve işlem sırasında farelerin vücut ısılarını korumak için dahili ısıtma yastığı. Daha da önemlisi, dört veya sekiz fareyi rvg9R-siRNA kompleksleriyle aynı anda bu şekilde tedavi edebilme yeteneği, in terapötik siRNA yaklaşımının test edilmesi için çok daha hızlı bir zaman ölçeği üzerinde çalışmalar yapılmasını sağlar. Sonuç olarak, bu cihaz RVG9R-siRNA ve nano tanecikleri veya antikorlar gibi diğer terapötik moleküllerin IN uygulaması için uygun ve kontrollü fare kafası konumlandırma sağlar, CNS teslim için.
Introduction
BBB, sistemsel olarak uygulanan >400-600 Da moleküllerinin beyne girmesini önler, cns ve beyin1etkileyen hastalıklar için terapötik biyomoleküllerin teslimi için önemli bir sorun teşkil. Beyne doğrudan ilaç teslimatı stereotaktik enjeksiyon ile elde edilebilir; ancak, bu cerrahi uzmanlık gerektirir ve son derece enjeksiyon bölgesine proksimal alanlara teslim sınırlıdır, rutin klinik kullanım için uygun hale2. Beyne in teslimat da BBB atlayarak doğrudan beyin teslimi neden olabilir, beyne çeşitli maddelerin doğrudan ve hızlı transferi için izin3,4. Bu transferin, burun geçişini beyne, beyin omurilik sıvısına ve lenfatik sistemlere bağlayan koku ve trigeminal sinirler aracılığıyla taşıma mekanizmaları ile meydana geldiği düşünülmektedir5. Doğrudan burun-to-beyit yolu periferik organ ve dokuları içermediğinden, sistemik yan etkileri önemli ölçüde azaltır ve potensiartırır. IN yönetimi terapötik ajanların beyin teslimi için hem lokal hem de sistemik yolları için umut verici bir noninvaziv alternatiftir ve Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı da dahil olmak üzere nörolojik bozukluklar, mücadele için güçlü bir yaklaşım temsil edebilir ve beyin kanseri, ve çeşitli klinik çalışmalarda araştırılmaktadır6,7,8.
Hacim ve aşılama yöntemi gibi çeşitli deneysel faktörler, yanı sıra formülasyon pH, kuvvetle burun-beyinyolu9 üzerinden CNS ilaç teslim etkiler 9 . Fareler ile yapılan çalışmalarda, IN ilaç dağıtımının başarısı, verimli beyin birikimi ve dış ortama veya hava yollarına ilaç drenajını önlemek için kritik öneme sahip uygun kafa konumlandırmasına bağlıdır. Özellikle, kemirgen çalışmalarının çoğunluğu koku epitel ilaç teslimi için 70 ° -90 ° eğim ile bir baş-geri pozisyonu (supine) istihdam, 0 ° baş konumlandırma trakea içine drenaj lehine olsa bile9. Uyanık farelerde ilaçların in teslim ilerler düşük beyin birikimi ile karşılaştırıldığında supine pozisyonda herhangi bir uygulama ile karşılaştırıldığında, çoğunlukla bilim adamlarının daha uzun süre ler için istenilen pozisyonda fareler tutmak için yetersizlik nedeniyle. Ayrıca, uyanık fareler için kullanılan deri kavrama yönteminin gerektirdiği baş aşağı pozisyon, 30 dakika içinde, ağırlıklı olarak trigeminal sinir ve koku ampulünde ve böbrekler ve akciğerler gibi çevresel organlarda ilaç birikimine yol açar. postinokülasyon10. Klinik çalışmalarda insan olmayan primatlar gibi büyük hayvanlarda koku veya trigeminal sinirler yoluyla terapötik teslim için en uygun vücut pozisyonu baş aşağı ve ileri pozisyonu (yani, sözde "Mekke'ye dua pozisyon")11. Ancak, bu pozisyon fare modelinde iyi incelenmemiştir ve supine pozisyonu kemirgen çalışmalarında daha yaygın olarak kullanılmaktadır.
Daha önce, RVG9R, Kuduz virüsüminimal reseptör bağlama etki alanına dayalı tasarlanmış bir peptit, nöronlar ve makrofajlar gibi nikotinik asetilkolin reseptör alt birimleri ifade hücrelere tropizm görüntüler ve aracılık göstermiştir reseptör agregasyonu yerinde reseptör nişan ve geçici plazma membran delokalizasyonu içeren bir mekanizma ile siRNA hücre içi teslim12,13. Daha da önemlisi, RVG9R-siRNA komplekslerinin sistemik intravenöz uygulaması siRNA'nınCNS 14'e transvasküler olarak iletilmesini sağlar. Ancak, sistemik rota CNS'e teslim edilen siRNA miktarını sulandırır ve son veriler RVG9R:siRNA komplekslerinin baş aşağı ve ileri pozisyonunda konumlandırılmış farelere in uygulamasının geniş çaplı hedef gen in beynin birden fazla bölgesi15. Daha da önemlisi, bu nakavt seviyesi, dört doz, 2 günlük rejim de enjeksiyon başına karşılaştırılabilir nakavt elde etmek için ~5 kat daha yüksek doz gerektirirken, 13,5 μg'lık siRNA ile elde edilmiştir. IN yaklaşımının tek eksikliği, çözümün uygulanması sırasında her iki elin de kullanılmasını gerektiren zahmetli bir işlem olması ve fareleri alternatif olarak baş aşağı ileri ve ileri doğru ve önemli bir uzun tedavi süresi için her teneffüs (fare başına ~ 20-30 μL hacmi etkili alımı için 30-45 dk prosedür). Burada sunulan fare konumlandırma cihazının kullanılması, hayvanlara ve protokolü gerçekleştiren personele fiziksel baskı sıyrık lı farelerin uygun şekilde yerleştirilmesinin yanı sıra, makul bir süre içinde birden fazla fare kohortu nun işlenmesini sağlar, hastalığın geç evrelerinde farelerde Batı Nil ensefaliti için bir tedavi olarak siRNA kullanımı derinlemesine bir çalışma sağlayan15.
Protocol
Tüm deneyler Hanyang Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan kurallara ve protokollere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu protokolde, 20-25 g ağırlığında 6 haftalık Balb/c fareler (grup başınan = 3) kullanılmıştır. Hayvanlar, su ve gıdaya ücretsiz erişim ile kontrollü sıcaklık ve nem düzeyinde 12 saat Açık/karanlık döngüleri ile patojen içermeyen bir tesiste barındırıldı.
1. Cihaz montajı
- Konumlandırma cihazının tek tek parçalarını Şekil 1A'dagösterildiği gibi birleştirin.
NOT: Cihaz kolayca monte edilebilen ve sökülebilen tek tek parçalar halinde sağlanır.
2. Malzeme kurulumu
NOT: Sıvılaştırılmış ilaçların IN uygulaması aşağıdaki ön tedavi adımlarını gerektirir.
- Konumlandırma cihazı, 10 μL mikropipet, 10 μL mikropipet uçları, bir tedavi çözümü (örneğin, RVG9R-siRNA kompleksi), bir zamanlayıcı saat ve %70 etanol (Şekil 2A'ya bakın) dahil olmak üzere gerekli malzemeleri hazırlayın.
- Deneyden en az 15-20 dakika önce cihaz ısıtma sistemini açmak için güç kodunu takın. Hayvan deneyleri için en uygun sıcaklık ~37 °C'de otomatik olarak korunur.
- Anestezi ketamin:xylazine:fosfat-tamponlu salin (PBS) 1:0.5:8.5 oranında hazırlayın ve 20 g fare başına 200 μL son hacminde tek bir intraperitoneal (yani) enjeksiyon ile her fare anestezi.
NOT: Anestezi durumunun 30-45 dk süreyle sağlanması için optimize edilmiş herhangi bir ilaç kullanılabilir.
3. Fare konumlandırma
- Cerrahi düzlemi korumak için pedal refleksi (firma ayak ucutu) ile anestezi düzeyini değerlendirin.
- Gerekli tüm reaktiflere kolay erişim sağlamak için konumlandırma cihazını uygun bir mesafe ve yüksekliğe yerleştirin.
- Fareler düzgün bir şekilde anestezi edildikten sonra, her fareyi başparmak ve işaret parmağıyla boynunun ensesinden hafifçe kaldırın ve belirlenen sandalyeye yerleştirin.
- Bu aşamada farenin sandalyeye doğru yerle bir olması çok önemlidir. Farenin sırtını sandalyenin arka desteğine paralel ve 90° sandalye koltuğuna yatırın. Fareden ellerinizi kaldırın ve hayvanın Şekil 2B'de gösterildiği gibi itmeden veya bastırmadan baş aşağı ve ileri pozisyonunda doğal olarak yatmasına izin verin. Farenin ön ayaklarının hayvan bu rahat pozisyondayken, fareye rahatsızlık vermeden doğal destek sağladığından emin olun.
- Fareler düzgün bir şekilde yerleştirildikten sonra, fareleri sandalye kemeriyle bağlayın ve derhal IN aşısını başlatın.
4. İntranazal doğum
NOT: Bu protokol, fare konumlandırma aygıtını kullanarak RVG9R:siRNA komplekslerinin in teslimini açıklar. Bu protokol kullanılarak, her fareye 2 μL damlada en fazla 20-30 μL çözelti kolayca uygulanabilir. Bu hacim farenin 0.032 cm3olan burun boşluğundan daha düşüktür, bu nedenle işlem ölümcül burun deliği tıkanıklığı veya boğulma ile sonuçlanmaz. Bu protokol, cihaz başına en az dört fare ve en fazla sekiz farenin aynı anda aşılanmasına olanak sağlar ve bu da zaman optimizasyonu ve değişkenliğin azalmasıile sonuçlanır.
- 10 μL mikropipeti alın ve 2 μL'ye ayarlayın.
- Mikropipeti 2 μL RVG9R:siRNA karmaşık çözeltisi (örneğin, teslimat deneyi için 104 μg RVG9R ile karmaşıklanmış 5,2 g siCy5 ve susturma deneyi için 270 μg RVG9R ile karmaşık 13,5 g siSOD1, 25 μL PBS içeren son hacimde %5 glikoz.
- Pipeti baskın elde tutarken, bankın üstüne dirsek koyarak pozisyonu ayarlayın. Yönetirken kontrolsüz hareketlerden kaçınmak için pipeti tutan eli diğer elinizle destekleyin.
- Farenin damlacığı doğrudan teneffüs edebilsin diye bir burun deliğine çok yakın bir ~2 μL damlayerleştirin (Şekil 2B'ye bakın). Küçük bir damla kolayca oluşturulmazsa, pipet ucunu yenisiyle değiştirin ve işlemi tekrarlayın. Aşılar arasındaki zaman aralığını doğrulamak için kronometreyi kullanın.
- Bu cihaz bir seferde en az dört farenin tedavisiiçin izin verir. Başka bir fare grubu 4.4 adımını tekrarlamak için gerekliyse, cihazda bir seferde sekiz fareyi yerleştirmek için ilk barın üstünde veya altında dört sandalyeli başka bir bar ayarlayın.
- İlk aşılamadan 3-4 dakika sonra diğer burun deliği ile adım 4.4 tekrarlayın. Bu zaman aralığı fare nin ilk dozun teneffüsini tamamlaması ve normal solunumu geri getirmesi için yeterlidir. Farenin narislerinden kazara homurdanma nedeniyle solunan çözeltinin bir damlası yerinden çıkarılırsa, 2 μL'lik ek bir çözeltiyi yeniden reinoculate edin.
- 20-30 μL doz bitene kadar alternatif burun delikleri ile tüm işlemi tekrarlayın. Tüm aşılama işlemini tamamlamak ~ 30-45 dakika sürer.
- Fareleri belirlenen kafeslere geri döndürmeden önce farelerin gözlerine ıslak merhem koyun.
NOT: Fareleri, göğüs seli recumbency korumak için yeterli bilinç kazanmış olana kadar gözetimsiz bırakmayın.
5. Veri analizi
- Flor etiketli RVG9R beyin birikimini doğrulamak için, fareler anestezi (adım 2.3 açıklandığı gibi) ve beyin izole, yanı sıra diğer periferik organlar, akciğer gibi, karaciğer, dalak, ve böbrek. Her organı ImageStation'a yerleştirin ve ImageStation'ı kullanarak floresan'ı görselleştirin.
- Cy5-label nedeniyle floresan görselleştirmek için, 20 μm kalınlığında kriyokesitler hazırlamak, Hoechst 33342 ile costained, ve bir konfokal mikroskop ile tam beyin tarama yapmak.
- Gen susturma değerlendirmek için, koku ampul, korteks, hipokampus, talamus, hipotalamus, beyincik ve beyin sapı gibi çeşitli beyin bölgelerinden RNA ayıklamak, bir RNA arıtma kiti ile, ters bir cDNA kullanarak cDNA transkripsiyonu sentez kiti ve daha önce açıklandığı gibi astar çiftleri ile qPCR gerçekleştirmek15.
Representative Results
IN uygulaması sırasında Baş pozisyonu beyne ilaç teslim verimliliği üzerinde önemli bir etkisidir. Burada, karışımın farenin CNS'sine teslimi için beyin hedeflemeli peptid-siRNA formülasyonunun IN uygulaması için bir fare konumlandırma cihazı kullanarak baş aşağı ve ileri pozisyonunu tanımladık. IN rota üzerinden teslim doğrulamak için, biz RVG9R peptid, daha önce verimli hem in vitro ve in vivo14,16nöronal hücrelere bağlamak için gösterilen kullanılır.
İlk olarak burada açıklanan fare konumlandırma cihazını kullanarak Alexa Fluor 488 (RVG9R-A488)etiketli RVG9R peptidin burun-to-beyit teslimini test ettik. 48 saat postinogülasyon, çeşitli organlar, beyin dahil olmak üzere, sinüs, akciğerler, karaciğer, dalak, ve böbrekler doku ilişkili A488 floresan ölçmek için çıkarıldı. Tek başına488 veya bir kontrol peptiti (RVM9R-A488)14 nAchR bağlamaz, negatif kontroller olarak kullanılmıştır. Beklendiği gibi, ne A488 ne de RVM9R-A488 48 h postinokülasyon (Şekil3A, solda) de organların herhangi birinde tespit edildi. Öte yandan, güçlü bir floresan A488 sinyali sadece RVG9R-inoculated grubunun beyinlerinde tespit edildi. Buna ek olarak, bu fare yerleştirme konumunu daha önce 17olarak kullanılan supine pozisyon yönteminin yanı sıra etkinlik için uyanıklık yöntemiyle karşılaştırdık. Sabit miktarda RVG9R-A488 (100 μg) aşıladık ve 48 saat postinolasyonda biyodağıtım ı savuruyoruz. Sonuçlar, farelerin baş aşağı ve ileri konumlandırma beyin dokusu boyunca RVG9R-A488 penetrans ve birikimi geliştirilmiş olduğunu göstermiştir (Şekil3A, sağ). Buna karşılık, bir supine pozisyonda aşılanmış hayvanlar beyne RVG9R-A488 teslim sonuçlandı ama konumlandırma cihazı yöntemi ile görüldüğü kadar güçlü değil. Beyne siRNA teslimatını doğrulamak için, Cy5 etiketli siRNA'nın 400 pmol (5.2 g) ile karmaşık rvg9R tek bir IN uygulamasından sonra tam beyin taraması yaptık. PBS veya RVM9R'nin aksine, RVG9R ile karmaşıklaşma, koku alma ampulü, korteks, hipokampus, talamus, hipotalamus, orta beyin ve beyincik dahil olmak üzere büyük beyin bölgelerinde güçlü bir siRNA birikimiile sonuçlandı (Şekil 3B ).
Son olarak, süperoksit dismutaz-1 (SOD1) genini hedefleyen fonksiyonel siRNA'nın hücre içi teslimatını doğrulamak için RT-qPCR analizini yaptık. Fareler rvg9R:siSOD1 (13.2 μg siRNA) ile art arda 3 kez intranase aşılandı ve sod1 mRNA ekspresyonu son aşılamadan sonra 24 saat analiz edildi. RVG9R:siSOD1 uygulaması koku ampulü (%63), korteks (%47), hipokampus (%61), talamus (%53), hipotalamus (%55), orta beyin (%39) ve serebellum (%30) içinde SOD1 ekspresyonunda önemli bir azalma ile sonuçlandı. (Şekil 4). Sonuç olarak, bir konumlandırma cihazının kullanımı farelerde RVG9R kompleksli siRNA kolay bir inoulation sağlar, beyin spesifik siRNA teslim hedef genin fonksiyonel susturma indükleyici sonuçlanan.
Şekil 1 : Cihaz montajının fotoğrafik sunumu. Konumlandırma sandalyeleri vidalarla uygun yükseklikte stand üzerinde monte edilir. Montajdan sonra cihaz aşılama sırasında fizyolojik sıcaklığa ısıtma için bir güç kaynağına bağlanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2 : Konumlandırma cihazı kullanılarak IN aşılama prosedürünün fotoğrafik sunumu. (A) IN aşısı için gerekli deneysel ekipman. (B) Cihazda (solda) ve IN aşısı için 2 μL'lik bir damlacık (sağda) üzerinde oturan baş aşağı ve ileri pozisyonundaki hayvanlar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3 : In uygulama dan sonra floresan etiketli peptid ve siRNA dağılımı. (A) Tek bir IN inoülasyonundan sonra 48 saat intranasie inolasyonlu RVG9R peptidin biyodağılımı. Beyin ve diğer periferik organlar, salin (PBS), A488, RVM-A488ve RVG-A488 (solda) ile aşılanmış farelerde floresan varlığı açısından değerlendirildi. Yukarıda belirtildiği gibi tedavi edilen farelerin uyanıkken, supine pozisyonunda ve fare konumlandırmasında baş aşağı ve ileri pozisyonunda (sağda) görüntülenmesi. (B) Beyindeki RVG9R:siRNA kompleksinin biyodağılımı (grup başınan = 3). Cy5 etiketli siRNA dağılımı, kontrol peptidi (RVM9R-siCy5) veya beyin hedefleyici peptid RVG9R (RVG9R-siCy5) ile komplekse sahip siRNA, salin (PBS) ile aşılanmış hayvanlarda konfokal lazer mikroskobu ile tam beyin kriyosiksiyonlarında görselleştirildi. Ölçek çubuğu 1 mm. Kısaltmaları temsil eder: o.b = koku ampul; ctx = korteks; su aygırı = hipokampus; hypo = hipotalamus; tha = talamus; m.b = orta beyin; cer = serebellum. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4 : RVG9R:siSOD1 uygulamasında beynin birden fazla bölgesinde hedef gen susturma neden olur. linen (PBS), RVG9R:siCD4 (siCD4), RVM9R:siSOD1 (RVM9R) ve RVG9R:siSOD1 (RVG9R) inolasyondan sonra belirtilen beyin bölgelerinde 24 saat murine SOD1 mRNA için qPCR analizi. Koku ampul göreceli SOD1 susturma, korteks, hipokampus (üst), talamus, hipotalamus, beyincik (orta) ve orta beyin (alt) gösterilir. Veriler, tuzlu farelerin karşılık gelen verileriyle normale döndükten sonra GAPDH'ye göre ± SD ortalamasını temsil eder (grup başınan = 3). IN aşısı gösterildikten sonra belirtilen beyin bölgesinde SOD1 mRNA yüzdesini gösteren karikatür (sağ alt). **P < 0.01, ***P < 0.001. Kısaltmalar: o.b = koku ampul; ctx = korteks; su aygırı = hipokampus; hypo = hipokampus; tha = talamus; m.b = orta beyin; cer = serebellum. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Fareleri tedavinin burundan beyne teslimi için en iyi şekilde konumlandırmak için bir fare konumlandırma cihazı geliştirdik. Cihaz farklı işlevleri ile donatılmıştır, hayvanların kolay eşzamanlı kullanımı sağlanması. Ayrıca deney sırasında hayvanların fizyolojik vücut sıcaklıklarının bakımı için ısıtma pedleri ile donatılmıştır. Anestezili fareler, hayvanlariçin en az rahatsızlık ile, özel olarak tasarlanmış sandalyeler ile baş aşağı ve ileri pozisyonda muhafaza edilebilir. Konumlandırma sandalyelerinin yüksekliği ilaç verirken hayvan burun deliklerini görselleştirmek için en iyi şekilde ayarlanabilir.
IN beyin teslimi burun deliklerinin küçük yüzey alanı da dahil olmak üzere çeşitli içsel sınırlamalar vardır (uygulama başına 20-30 μL maksimum hacimleri sağlayan), burun tahrişi, epitel hasarı, ve burun epitel ibretlik arasında sınırlı emilimi18. Supine pozisyonunda bulunan farelere ilaç verilmesi, mikrolitre şırıngalara bağlı pipet veya poliüretan tüp (24 G x 19 mm) ile hayvanların alternatif narelerine sıvı ilaç bırakılarak beyin doğumu için kullanılmıştır19, 20. Koku epitelyakın ilaç serbest bırakmak için tüp sistemlerinin kullanımı potansiyel olarak uygun bir yaklaşım olmasına rağmen, tekrarlayan uygulama üzerine tahriş veya burun iltihabı neden olur. Ayrıca, burun boşluğunun küçük boyutu bu yaklaşımı sınırlar, özellikle tekrarlama ile aşılabilir farelerde, yanı sıra burun mukozasında devam ilaç formülasyonları ile. Başka bir seçenek uyanık fareler için terapötik IN uygulamasıdır10. Ancak, bu yaklaşım IN aşılama sırasında hayvan işleme için yetenekli prosedürler gerektirir. Ayrıca, hayvan stresine neden olur ve bu nedenle, hastalık modelleri için ideal değildir, özellikle bulaşıcı hastalık modelleri. Ayrıca, tutarsız doz kolayca kusurlu hayvan kavrama nedeniyle akciğerler veya mide içine ilaç drenaj ı sayılabilir. Burada sunulan yaklaşım bilim adamları bu teknik engelleri aşmak için izin verir. Baş aşağı ve ileri pozisyonu solurken burundan akciğerlere ilaç sızıntısı olasılığını azaltır, beyne doğrudan ve seçici siRNA teslim lehine. Fare konumlandırma cihazı kullanılarak teslim in aşılama sırasında hayvanları işlemek veya kavramak için herhangi bir özel teknik gerektirmez. Bir seferde dört hayvan en az 30-45 dk bir süre için tedavi edilebilir. Prosedür, aynı deneysel oturumda en fazla sekiz farenin kolay yönetilmesine olanak tanıyan ek bir dört sandalyeli çubuk ekleyerek ölçeklendirilebilir. Bu nedenle, bu yöntemi izleyerek, tek bir operatör uzun süre boyunca hayvanların büyük grupların beyinlerine ilaç teslim neden olabilir.
Burun boşluğunun anatomik yapısı burun-beyin doğumunu güçlü bir şekilde etkiler (Merkus ve ark.11 ve Ruigrok ve de Lange21tarafından incelenmiştir). Farelerde burun boşluğunun göreli yüzey alanı insanlarınkinden 15 kat daha büyük, koku epitelinin göreli yüzey alanı ise 6 kat daha büyüktür. Kemirgenler için insanlarda burun boşluğu anatomisi önemli farklılıklar olmasına rağmen, çeşitli beyin bozuklukları (www.clinicaltrials.gov) tedavisinde IN yaklaşımı kullanılarak devam yaklaşık 45 klinik çalışmalar vardır. Burada sunulan çalışma terapötik in kullanırken, bilim adamları baş pozisyonu, uyku ve uygun doğum ajanları gibi çeşitli faktörler, dikkate gerektiğini gösterir.
Floresan etiketli siRNA'nın fare beynine verimli ve spesifik birikimini gösterdik. Ayrıca IN siRNA doğumdan sonra gözlenen SOD1 gen ekspresyonundaki önemli azalma fonksiyonel etkileri doğrulamıştır. Daha önce sürekli olarak Batı Nil virüsü (WNV) RNA hedefleyen RVG9R-siRNA komplekslerinin IN yönetimi WNV ensefaliti üzerinde güçlü bir terapötik etki uygular gösterdi15. Özellikle, burun-to-beyit siRNA teslim bir hücre hedefleme ligand (RVG) ve pozitif yüklü molekül (9R) karmaşık siRNA gerekli. Bu elementlerin yokluğunda moleküller sistemik devre ve lenfatik damarlar 48 h tedavi sonrası (Şekil3A)15ile temizlendi. Bu nedenle, burada açıklanan deneysel kurulumda, peptid/siRNA lokalizasyonu 48 saat inolasyondan sonra sadece beyinde özel olarak tutulan seviyelerir incelenmiştir. Bu yaklaşım kolayca diğer moleküllerin teslimi için uygulanabilir, proteinler gibi, peptidler, ve nano tanecikleri, veya diğer terapötikler, beyin ile ilgili bozuklukların bir dizi tedavisi için.
Disclosures
P.K. ve S.K.L. Signet Biotech'in kurucularıdır. P.K. kısmen RVG9R ile ilgili iddiaları içeren patent PCT/US07/12,152, coinventor olduğunu. I.U., K.C., P.K., ve S.K.L., fare konumlandırma aygıtıyla ilgili iddiaları içeren sunulan patentin (PCT/KR2016/014220) ortak mucitleri olarak listelenmiştir.
Acknowledgments
Bu çalışma Kore Sağlık ve Refah Bakanlığı (HI17C1046) tarafından S.K.L. tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Comercial assays | |||
| iScript cDNA synthesis kit | BioRad | Cat# 1708891 | |
| RNAiso plus | TaKaRa Bio | Cat# 9108 | |
| SYBR Premix ExTaq | TaKaRa Bio | Cat# RR420A | |
| Dyes | |||
| Alexa fluor 488 | ThermoFisher | Cat# A30052 | |
| Mouse strain | |||
| Balb/c | Orient Bio | N/A | 6-8 week old, 20-30g |
| Oligonucleotides and primers | |||
| Human CD4 | ST Pharm | N/A | Sense: 5’-GAUCAAGAGACUCCUCAGU-3’ |
| siSOD1 | ST Pharm | N/A | Sense: 5’-GGUGGAAAUGAAGAAAGUA-3’ |
| GAPDH primers | ST Pharm | N/A | F: 5’-AACTTTGGCATTGTGGAAGG-3’ R: 5’-GGAGACAACCTGGTCCTCAG-3’ |
| SOD1 primers | ST Pharm | N/A | F: 5’-CCAGTGCAGGACCTCATTTT-3’ R: 5’-CACCTTTGCCCAAGTCATCT-3’ |
| Peptides | |||
| RVG9R | Peptron | N/A | YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSR GKRASNGGGGRRRRRRRRR |
| RVM9R | Peptron | N/A | MNLLRKIVKNRRDEDTQKSS PASAPLDGGGGRRRRRRRRR |
| Software, algorithms and devices | |||
| FlowJo software 4.3 | FlowJO, LLC | N/A | http://docs.flowjo.com/vx/ |
| Mouse positioning device | Signet Biotech | N/A | |
| Prism software | Graphpad | N/A | https://www.graphpad.com/scientificsoftware/prism/ |
| Prism software | Graphpad | N/A | https://www.graphpad.com/scientificsoftware/prism/ |
References
- Pardridge, W. M. The blood-brain barrier: bottleneck in brain drug development. NeuroRx. 2, 3-14 (2005).
- Glascock, J. J., et al. Delivery of therapeutic agents through intracerebroventricular (ICV) and intravenous (IV) injection in mice. Journal of Visualized Experiments. (56), e2968 (2011).
- Khan, A. R., Liu, M., Khan, M. W., Zhai, G. Progress in brain targeting drug delivery system by nasal route. Journal of Controlled Release. 268, 364-389 (2017).
- Meredith, M. E., Salameh, T. S., Banks, W. A. Intranasal delivery of proteins and peptides in the treatment of neurodegenerative diseases. The AAPS Journal. 17, 780-787 (2015).
- Pardeshi, C. V., Belgamwar, V. S. Direct nose to brain drug delivery via integrated nerve pathways bypassing the blood-brain barrier: an excellent platform for brain targeting. Expert Opinion on Drug Delivery. 10, 957-972 (2013).
- Agrawal, M., et al. Nose-to-brain drug delivery: An update on clinical challenges and progress towards approval of anti-Alzheimer drugs. Journal of Controlled Release. 281, 139-177 (2018).
- Van Woensel, M., et al. Formulations for intranasal delivery of pharmacological agents to combat brain disease: a new opportunity to tackle GBM. Cancers. 5, 1020-1048 (2013).
- Kulkarni, A. D., et al. Nanotechnology-mediated nose to brain drug delivery for Parkinson's disease: a mini review. Journal of Drug Targeting. 23, 775-788 (2015).
- Dhuria, S. V., Hanson, L. R., Frey, W. H. Intranasal delivery to the central nervous system: mechanisms and experimental considerations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 99, 1654-1673 (2010).
- Hanson, L. R., Fine, J. M., Svitak, A. L., Faltesek, K. A. Intranasal administration of CNS therapeutics to awake mice. Journal of Visualized Experiments. (74), e4440 (2013).
- Merkus, P., Ebbens, F. A., Muller, B., Fokkens, W. J. Influence of anatomy and head position on intranasal drug deposition. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology and Head & Neck. 263, 827-832 (2006).
- Zeller, S., et al. Attachment of cell-binding ligands to arginine-rich cell-penetrating peptides enables cytosolic translocation of complexed siRNA. Chemistry & Biology. 22, 50-62 (2015).
- Kim, J., et al. Silencing CCR2 in macrophages alleviates adipose tissue inflammation and the associated metabolic syndrome in dietary obese mice. Molecular Therapy-Nucleic Acids. 5, (2016).
- Kumar, P., et al. Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system. Nature. 448, 39 (2007).
- Beloor, J., et al. Small interfering RNA-mediated control of virus replication in the CNS is therapeutic and enables natural immunity to West Nile virus. Cell Host & Microbe. 23, 549-556 (2018).
- Ullah, I., et al. Trileucine residues in a ligand-CPP-based siRNA delivery platform improve endosomal escape of siRNA. Journal of Drug Targeting. 25, 320-329 (2017).
- Yu, D., Li, G., Lesniak, M. S., Balyasnikova, I. V. Intranasal delivery of therapeutic stem cells to glioblastoma in a mouse model. Journal of Visualized Experiments. (124), e55845 (2017).
- Mittal, D., et al. Insights into direct nose to brain delivery: current status and future perspective. Drug Delivery. 21, 75-86 (2014).
- Renner, D. B., Frey, W. H., Hanson, L. R. Intranasal delivery of siRNA to the olfactory bulbs of mice via the olfactory nerve pathway. Neuroscience Letters. 513, 193-197 (2012).
- Serralheiro, A., Alves, G., Fortuna, A., Falcão, A. Intranasal administration of carbamazepine to mice: a direct delivery pathway for brain targeting. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 60, 32-39 (2014).
- Ruigrok, M. J., de Lange, E. C. Emerging insights for translational pharmacokinetic and pharmacokinetic-pharmacodynamic studies: towards prediction of nose-to-brain transport in humans. The AAPS Journal. 17, 493-505 (2015).
