Nitropeptid Profilierung und Identifikation illustriert von Angiotensin II

Shan Feng; Xiaofei Wen; Xin Lu

doi:10.3791/59391

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Methodenartikel

Nitropeptid Profilierung und Identifikation illustriert von Angiotensin II

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DOI:

10.3791/59391

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16. Juni 2019

Shan Feng¹^,² , Xiaofei Wen³ , Xin Lu²^,⁴^,⁵^,⁶

¹Mass Spectrometry Core Facility, School of Life Sciences, Westlake University, ²Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, ³Department of Urology, Shanghai East Hospital, Tongji University School of Medicine, ⁴Boler-Parseghian Center for Rare and Neglected Diseases, University of Notre Dame, ⁵Harper Cancer Research Institute, University of Notre Dame, ⁶Tumor Microenvironment and Metastasis Program, Indiana University Melvin and Bren Simon Cancer Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die proteomische Profilierung von Tyrosin-Nitrat-Proteinen war aufgrund der geringen Häufigkeit der 3-Nitrotytyrosin-Modifikation eine anspruchsvolle Technik. Hier beschreiben wir einen neuartigen Ansatz für die Nitropeptidanreicherung und Profilierung unter Verwendung von Angiotensin II als Modell. Diese Methode kann für andere In-vitro- oder In-vivo-Systeme erweitert werden.

Zusammenfassung

Proteinnitration ist eine der wichtigsten post-translationalen Modifikationen (PTM) an Tyrosinrückständen und kann durch chemische Aktionen von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und reaktiven Stickstoffarten (RNS) in eukaryotischen Zellen induziert werden. Die genaue Identifizierung von Nitrationsstellen auf Proteinen ist entscheidend für das Verständnis der physiologischen und pathologischen Prozesse im Zusammenhang mit Proteinnitration, wie Entzündungen, Alterung und Krebs. Da die nitratierten Proteine auch unter induzierten Bedingungen in Zellen von geringer Fülle sind, wurden keine universellen und effizienten Methoden zur Profilierung und Identifizierung von Proteinnitrationsstellen entwickelt. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Nitropeptidanreicherung mit einer chemischen Reduktionsreaktion und Biotin-Etikettierung, gefolgt von hochauflösender Massenspektrometrie. In unserer Methode können Nitropeptidderivate mit hoher Genauigkeit identifiziert werden. Unsere Methode weist zwei Vorteile gegenüber den zuvor gemeldeten Methoden auf. Erstens wird die Dimethylkennzeichnung verwendet, um das primäre Amin auf Nitropeptiden zu blockieren, die verwendet werden können, um quantitative Ergebnisse zu generieren. Zweitens wird zur Anreicherung eine Disulfidbindung verwendet, die NHS-Biotin-Reagenz enthält, die weiter reduziert und alkyliert werden kann, um das Detektionssignal auf einem Massenspektrometer zu verbessern. Dieses Protokoll wurde im aktuellen Papier erfolgreich auf das Modellpeptid Angiotensin II angewendet.

Einleitung

Die Nitration von Tyrosinrückständen in Proteinen zu 3-Nitrotyrosin reguliert viele biologische Prozesse. Aufgrund der unterschiedlichen chemischen Eigenschaften zwischen Tyrosin und 3-Nitrotyrosin kann ein nitratiertes Protein die Signalwirkung¹^,²gestört haben. Daher ist es wichtig, Methoden zu entwickeln, die Nitrationsstellen auf Proteinen effizient anreichern und identifizieren können. Da 3-Nitrotyrosin eine geringe Häufigkeitsmodifikation auf Proteine im Vergleich zu anderen Formen von PTM, wie Phosphorylierung und Acetylierung, ist es schwierig, endogene Nitrationsstellen direkt aus Zelllinien oder Geweb....