La hibridación in situ del ARN cromogénico del virus del papiloma humano (VPH) se considera una de las normas de oro para la detección activa de la infección por el virus del papiloma humano dentro de los tumores. Permite la visualización de la expresión de ARNm del VPH E6-E7 con localización y evaluación semicuantitativa de su señal.
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Artículo de método
Cromogénico In Situ Hybridization ss una herramienta para el diagnóstico de cáncer de cabeza y cuello relacionado con el VPH
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Resumen
Resumen
La infección por el virus del papiloma humano (VPH) es un factor de riesgo importante para un subtipo de carcinoma de células escamosas orofaríngeas (OPSCC), que tiende a estar asociado con un mejor resultado que el OPSCC relacionado con el alcohol y el tabaco. La hibridación in situ (CISH) cromogénica del ARN viral del VPH podría permitir la evaluación semicuantitativa de las transcripciones virales de las proteínas oncogénicas E6 y E7 y una visualización in situ con una buena resolución espacial. Esta técnica permite el diagnóstico de una infección activa con la visualización de la transcripción del VPH en las células infectadas por el VPH tumoral. Una ventaja de esta técnica es la evitación de la contaminación de las células no neoplásicas infectadas por el VPH adyacentes al tumor. En general, sus buenos rendimientos de diagnóstico han considerado que es el estándar de oro para la identificación activa de la infección por VPH. Dado que la interacción de proteínas virales E6 y E7 con las proteínas celulares pRb y p53 es obligatoria para la transformación celular, el ARN CISH del VPH es funcionalmente relevante y refleja agudamente la infección activa por VPH oncogénico. Esta técnica también es clínicamente relevante, ya que los niveles de transcripción "bajos" o "altos" del VPH ayudaron a identificar dos grupos de pronóstico entre los pacientes con cáncer de cabeza y cuello p16 relacionados con el VPH. Aquí presentamos el protocolo para el ARN HPV cISH manual realizado en diapositivas de parafina incorporada sin forcina fija (FFPE) con un kit obtenido del fabricante. En lugar de la revelación cromogénica, la hibridación in situ del ARN también se puede realizar con revelación fluorescente (RNA FISH). También se puede combinar con inmunomanchas convencionales.
Introducción
El ARN CISH del VPH es una poderosa herramienta para la detección de la infección activa por VPH, que puede resultar crucial en lesiones benignas o malignas en diversos lugares, como la orofaringe o el cuello uterino. La detección de una infección activa por VPH puede apoyar el diagnóstico de una lesión inducida por el VPH y, por lo tanto, influir en su tratamiento y pronóstico.
El VPH es la infección de transmisión sexual más frecuente, y se han descrito más de 100 genotipos virales1. Esquemáticamente, genotipos de bajo riesgo como los genotipos 6 y 11 son conocidos por inducir verrugas genitales, papilomatosis resp....
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Protocolo
El protocolo sigue las directrices éticas y fue aprobado por el Comité ético (Comité-de-Protection-des-Personnes Ile-de-France-II, #2015-09-04).
1. Preparación de los materiales
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Preparación de 1x tampón de lavado
- Preparar 3 L de 1x tampón de lavado añadiendo 2.94 L de agua destilada y una botella (60 ml) de tampón de lavado (50x) (ver la Tabla de Materiales)a un carboy grande. Mezcla bien.
NOTA: El tampón de lavado 1x puede prepararse con antelación y almacenarse a temperatura ambiente durante un máximo de 1 mes.
- Preparar 3 L de 1x tampón de lavado añadiendo 2.94 L de agua destilada y una botella (60 ml) de tampón de lavado (50x) (ver la Tabla de Materiales)a un carboy grande. Mezcla bien.
- Preparación de reactivos de contramanch....
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Resultados
Como se describe aquí, en el cáncer de células escamosas de cabeza y cuello, un caso puede considerarse positivo en presencia de tinción punctiforme marrón en el citoplasma o en los núcleos de las células tumorales. En la mayoría de los estudios, la señal se considera como "positiva" o "no detectada"14. Se han notificado métodos de semicuantificación de la señal, pero carecen de estandarización entre los equipos. Por ejemplo, en algunos estudios, las señales se puntuaron como 1+ con 1-3 puntos por.......
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Discusión
El ARN CISH del VPH realizado con un kit adquirido es una poderosa herramienta para la detección de transcripciones virales e indica una infección activa por VPH. Realizado manualmente, los pasos del protocolo son en general fáciles de seguir, y el kit comprado es conveniente. Esta técnica permite la tinción de 19 muestras histológicas más una diapositiva de control a la vez, y el ensayo dura alrededor de 8 h. Es fundamental no dejar que las muestras se sequen entre pasos a menos que se mencione lo contrario. La condició.......
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Divulgaciones
CB: juntas, seminarios: MSD, BMS, Astrazeneca, Roche
Agradecimientos
Los autores agradecen el departamento de Patología de Hopital Européen Georges Pompidou y Necker (Laurianne Chambolle, Elodie Michel y Giséle Legall); la plataforma histológica de PARCC, Hopital Européen Georges Pompidou (Corinne Lesaffre); Virginia Clark para la edición de idiomas; Alexandra Elbakyan por su contribución.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Solución de hematoxilina, branquia n.º 1 | Merck | GHS132 | |
| HybEZ Oven (110v) | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 321710 | |
| Bastidor deslizante HybEZ | Cell Diagnostics Inc. | ||
| Pluma de barrera hidrofóbica ImmEdge | Advanced Cell Diagnostics Inc. | ||
| Reactivos de detección RNAscope 2.5 HD-BROWN | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 322310 | Este kit incluye los reactivos de amplificación AMP1, AMP2, AMP3, AMP4, AMP5 y AMP6, y los reactivos de detección DAB-A y DAB-B |
| RNAscope 3-Plex Negative Control Probe | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 320871 | Sonda de control positivo DAPB |
| RNAscope 3-Plex Advanced | Cell Diagnostics Inc. | 320861 | PPIB |
| RNAscope H202 & Reactivo de proteasa más | Diagnóstico celular avanzado Inc. | 322330 | Peróxido de hidrógeno x2 y proteasa Plus x 1 |
| Sonda de ARN- HPV16/18 | Advanced Cell Diagnostics Inc. | ||
| Reactivos de recuperación de dianas de ARNscope | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 322000 | |
| Reactivos tampón de lavado RNAscope | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 310091 | Tampón de lavado 50X x4 |
Referencias
- Lowy, D. R., Schiller, J. T. Reducing HPV-associated cancer globally. Cancer Prevention Research.(Philadelphia, PA). 5 (1), 18-23 (2012).
- Laban, S., Hoffmann, T. K. Human Papillomavirus Immunity in Oropharyngeal Cancer: Time to Change the Game?....
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Reimpresiones y permisos
