Summary
Her beskriver vi en metode til at reducere størrelsen af zebrafiske embryoner uden at forstyrre normale udviklingsmæssige processer. Denne teknik gør det muligt at studere mønster skalering og udviklingsmæssig robusthed mod størrelsesændring.
Abstract
I den udviklingsmæssige proces, embryoner udviser en bemærkelsesværdig evne til at matche deres krop mønster til deres kropsstørrelse; deres legems andel opretholdes, selv i embryoner, der er større eller mindre, inden for visse grænser. Selv om dette fænomen med skalering har tiltrukket sig opmærksomhed i over et århundrede, forståelse af de underliggende mekanismer har været begrænset, skyldes til dels en mangel på kvantitativ beskrivelse af udviklingsmæssige dynamik i embryoner af forskellige størrelser. For at overvinde denne begrænsning, vi udviklet en ny teknik til kirurgisk at reducere størrelsen af: zebrafisk embryoner, som har store fordele for in vivo levende billeddannelse. Vi viser, at efter afbalanceret fjernelse af celler og æggeblomme på blastula scenen i separate trin, kan embryoner hurtigt komme sig under de rette betingelser og udvikle i mindre, men ellers normale embryoner. Da denne teknik ikke kræver særligt udstyr, er det let at tilpasse, og kan bruges til at studere en bred vifte af skalering problemer, herunder robustheden af morfogen medieret mønster.
Introduction
Forskerne har længe vidst, at embryoner har en bemærkelsesværdig evne til at danne konstante krops proportioner selv embryo størrelse kan variere meget både under naturlige og eksperimentelle betingelser1,2,3. Trods årtiers teoretiske og eksperimentelle undersøgelser er denne robusthed over for Størrelsesvariation, betegnet skalering og dens underliggende mekanismer stadig ukendt i mange væv og organer. For direkte at indfange dynamikken i udviklingssystemet etablerede vi en reproducerbar og enkel størrelses reduktions teknik i: zebrafisk4, som har den store fordel i in vivo Live imaging5.
Zebrafish har tjent som en model hvirveldyr til at studere flere discipliner af biologi, herunder udviklingsmæssige biologi. Især er zebrafisk ideel til in vivo levende billeddannelse6 fordi 1) udvikling kan fortsætte normalt uden for moderen og ægskallen, og 2) embryonerne er gennemsigtige. Desuden kan embryonerne modstå nogle temperatur-og miljømæssige udsving, som gør det muligt at undersøgt dem under laboratorieforhold. Også, ud over konventionelle genekspression forstyrrelse af morpholino og mRNA injektion7,8, seneste fremskridt i crispr/Cas9 teknologi har gjort reverse genetik i: zebrafisk meget effektiv9. Desuden kan mange klassiske teknikker i embryologi, såsom celletransplantation eller vævs kirurgi anvendes4,10,11.
Størrelses reduktionsteknikker blev oprindeligt udviklet i amfibie-og andre ikke-hvirveldyr12. For eksempel, i xenopus Elm, en anden populær hvirveldyr model, skæring langs dyret-Vegetal akse på blastula fase kan producere størrelse-reducerede embryoner12,13. Men i vores hænder denne One-Step tilgang resulterer i dorsalized eller ventraliserede embryoner i zebrafish, formentlig fordi rygterne determinanter fordeles ulige og man kan ikke kende deres lokalisering fra morfologien af embryoner. Her demonstrerer vi en alternativ to-trins hakke teknik til: zebrafisk, der producerer normalt udvikler, men mindre embryoner. Med denne teknik fjernes cellerne først fra dyre stangen, en region med naive celler, der mangler arrangør aktivitet. For at afbalancere mængden af æggeblomme og celler, som er vigtigt for epidriy og efterfølgende morfogenesis, er æggeblomme derefter fjernes. Her beskriver vi denne protokol og giver to eksempler på størrelse invarians i mønster dannelsen; somite og ventrale neurale rørmønster. Kombineret med kvantitativ billeddannelse udnyttede vi størrelses reduktions teknikken til at undersøge, hvordan størrelserne af somitter og neurale rør påvirkes i størrelse reducerede embryoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle fiske relaterede procedurer blev gennemført med godkendelse fra det institutionelle udvalg for dyrepasning og-brug (IACUC) på Harvard Medical School.
1. klargøring af værktøj og reagens
-
Lav en wire sløjfe til at hakke embryoner
- Tag 20 cm rustfrit ståltråd, der er stiv og ikke-ætsende med en diameter på 40 μm. Tråden over i glas kapillar (1,0 mm udvendig diameter, 0,5 mm indvendig diameter, ingen glødetråd), hvilket gør en lille løkke foroven (sløjfe længde er 1,0 mm)
- Sæt en lille dråbe af klar neglelak på spidsen af glasset kapillar mellem wire loop til at holde det på plads. Lad det tørre. Sørg for ikke at få nogen neglelak på loop del, da det kan beskadige embryonerne.
- Fastgør glas kapillar med løkken på en træhakke (9 "bambus engangs spisepinde brudt i halve) ved hjælp af Lab tape. Lad ca. 2,5 cm af glas kapillar, der strækker sig ud over spise staven, så den del af værktøjet, der holder, ikke dypper i vandet. Juster denne længde til præference.
-
Alternativt kan du lave en glas nål til at hakke embryoner
- Knib den ene ende af glasset Pasteur-pipette med pincet, mens du holder den anden side med en hånd. Opvarm den tynde del af pipetten over en spiritus lampe eller Bunsenbrænderen.
- Hånd træk glas pipetten. Den ideelle pipette som en diameter på ca. 30 μm og en blid kurve (krumningsradius = ca. 5 mm). Korrekt diameter og krumning er opnået med praksis og en vis chance.
-
Klargøring af methylcellulose
- Methylcellulose bruges til at holde embryonerne, mens hakke. Lav 2% methylcellulose opløsning i 1/3x Ringer's opløsning (116 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 1,8 mM CaCl2og 5 mm 4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethansulfonsyre (Hepes; pH 7,2)). Ryst methylcellulose pulver i 1/3x Ringers opløsning ved 4 °C natten over.
- Eventuelt tilsættes ~ 1,5 mL phenol rød (0,5% i DPBS stamopløsning) til 10 mL 2% methylcellulose opløsning, indtil rød, for at gøre opløsningen synlig. Ryst det, indtil farven bliver ensartet.
2. fremstilling af Zebrafiske embryoner til kirurgisk Størrelsesreduktion
-
Saml embryoner
- Placer en eller to mandlige og en eller to kvindelige zebrafisk i et parring kammer fyldt med en masse vand. Adskille hanner og hunner ved hjælp af en plastik skildeler. Brug AB-linjen til somite-billedbehandling (afsnit 4) og en transgene reporter-linje af neurale rørmønster (NKX 2.2: MEM-gfp, dbx1b: gfpeller Olig2: dsred) til billeddannelse i neurale rør. Efterlad dem i kammeret natten over.
Bemærk: Valget af voksne er vigtigt for at opnå æg, der overlever kirurgi godt. Typisk, unge raske kvinder producerer sunde æg. - På den næste morgen, overføre kammeret til lavt vand og placere kammeret med let Tilt. Fjern skillelinjen, så fiskene kan parre.
- Saml æggene ved at hælde i en te Strainer. Æggene overføres til en Petri skål med ægge vand (til 20x ægge vand, 6 g direkte havsalt, 1,5 g CaSO4 og 1 L H2O; brug ved 1x). For bedre iscenesættelse, indsamle æggene lige efter gydning. Embryonerne anbringes i en 28,5 °C-inkubator.
- Om nødvendigt indsprøjtes morpholino, mRNA osv., ved 1 – 4 celle stadier efter en fælles protokol7,8. Injicer mRNA for fluorescerende membran etiket (MEM-mCherry, MEM-mBFP1eller MEM-mcitrine) til billeddannelse af neurale rør (afsnit 5).
- Placer en eller to mandlige og en eller to kvindelige zebrafisk i et parring kammer fyldt med en masse vand. Adskille hanner og hunner ved hjælp af en plastik skildeler. Brug AB-linjen til somite-billedbehandling (afsnit 4) og en transgene reporter-linje af neurale rørmønster (NKX 2.2: MEM-gfp, dbx1b: gfpeller Olig2: dsred) til billeddannelse i neurale rør. Efterlad dem i kammeret natten over.
-
Dechorionat ved hjælp af enzympronasen
- Omkring 128-celle til 256-celle fase, overføre sunde embryoner til en 35 mm glas skål fyldt med ægge vand. Fjern så meget ægge vand som muligt fra skålen.
- Der tilsættes 1 mL 20 mg/mL pronase. Hvirvl forsigtigt embryonerne rundt ved at flytte pladen og pipette forsigtigt opløsningen op og ned for at hjælpe med at dechorionation med en glas pipette.
- Når chorionerne begynder at miste elasticitet (normalt 1-4 min. efter tilsætning af pronase, afhængigt af mængden af æg og vand), tilsættes så meget ægge vand som muligt for at fortynde pronase. Vurder elasticitets tabet ved forsigtigt at røre chorion med pincet; chorion skal holde bule uden straks hoppende tilbage. Overfør æggene til en anden skål med ægge vand ved hjælp af en glas pipette (på dette punkt er de fleste af chorionerne ikke brudt).
- Alternativt hæld forsigtigt embryonerne fra skålen i et stort 400 mL bægerglas fyldt med ægge vand uden at udsætte embryonerne for luft. Så lad embryonerne helt bosætte sig. Hæld bægerglasset til at lade embryoner falde til den ene side. Saml disse embryoner med en glas pipette, og overfør den til en ny 35 mm glas skål fyldt med 1/3x Ringers opløsning.
- Vent i flere minutter, indtil de fleste af chorionerne mister elasticiteten helt. Fjern de resterende chorioner fra embryoner ved forsigtigt at afpipette æggene. Fjern beskadigede embryoner, og Inkuber embryonerne i en 28,5 °C-inkubator.
3. kirurgisk størrelse reduktion og nyttiggørelse
- Forbered en ren 35 mm glas skål. Sprede ca 0,5 mL 2% methylcellulose (i 1/3x Ringer's løsning, med phenol rød til at hjælpe visualisere) nær midten af bunden af den større skål ved hjælp af en plastik spatel. Methylcellulose spredes tyndt og jævnt til en tykkelse på ca. 0,5 mm.
- Hæld ca. 30 mL 1/3x Ringers opløsning på siden af skålen og lad det sprede sig til resten af skålen, der dækker methylcellulose.
- Sted dechorionerede embryoner på 256-celle-1k-celle fase på 2% methylcellulose. Juster orienteringen af embryonerne på siden for at visualisere både cellerne og blomme. (Figur 1)
- Hak ca. 30%-40% af cellerne fra blastoderm nær dyre stangen ved at skære vinkelret på den animalske-Vegetal akse ved hjælp af trådsløjfen (eller glas nålen) (figur 1, øverste paneler). Når cellerne er fjernet, skal du forsigtigt tappe enderne sammen for at hjælpe de resterende celler med at holde sig tilbage. Inden for få minutter, bør de døde celler Slough ud, når embryonet begynder at helbrede.
- Lav et lille sår til æggeblommen nær den vegetelle pol i stedet for at "hakke" æggeblommen (figur 1 midterste paneler). Der sår æggeblommen ved at nakker ægmembranen med den monterede ledning. Yolk vil sive ud i få minutter efter såret, og derefter såret vil helbrede (figur 1 bund paneler).
- Når æggeblommen stopper oser ud, flytte embryonet ved hjælp af en pipet uden for methylcellulose i samme skål for at give dem mulighed for bedre at inddrive.
- Gentag trin 3.4-3.6 for alle embryoner. Lad skålen stabil i 30 minutter, mens embryonerne restituere sig.
-
Overfør embryonerne til en ny skål med frisk 1/3x Ringer's opløsning og læg dem i 28,5 °C-inkubator, så de kan komme sig helt.
- Valgfri Hvis den fase af interesse er den tidlige somite fase, kan embryoner inkuieres ved 20 °C efter at være inkueret ved 28,5 °C indtil skjoldet fase, at justere timing for eksperimenter og billeddannelse.
4. Live imaging af Zebrafish Somitogenesis
- Forbered 100 mL 1% agopstået opløsning ved at tilsætte 1 g agopstået til 100 mL ægge vand, opvarmning indtil agopstået er helt opløst. Lad afkøle i 5-10 min til en temperatur på 62-72 °C.
-
Forbered et beslag til billedbehandling.
Bemærk: denne vejledning er udviklet til brug med et inverteret bredt felt mikroskop.- Hæld ~ 15 mL 1% agopstået i en 100 mm x 15 mm Petri skål.
- Anbring forsigtigt en dorsal Mount v1-skimmel skabelon5 på bunden af Petri skålen. Hold formen på bunden ved hjælp af en vægt, såsom 15 mL rør med vand.
Bemærk: Dette er så embryonerne er så tæt på bunden af Petri skålen som muligt, når du bruger en inverteret mikroskop. Selv om embryonerne er monteret sidelæns for somite billeddannelse, her dorsal Mount v15 anvendes, da det holder embryonerne bedre på tidlige somite stadier. - Lad det køle af, indtil der er opstået en fuld solidificeret. Hæld i ~ 30 ml ægge vand med 0,01% tricaine, og fjern forsigtigt skimmelsvamp ved forsigtigt at nysgerrige af med pincet.
-
Mount embryoner til somite Imaging
- Forbered 1% lav smelte Agopstået i 1/3x Ringer's opløsning (eller ægge vand) og holde det ved 42 °C. Vent, indtil temperaturen kommer ned på 42 °C.
- Anbring et embryo pr. brønd under et dissektions mikroskop. Der afpipetteres ca. 1 μL lav smelte Agopstået i brønden for at finindstille brønd størrelsen til størrelsen af de enkelte embryoner, der varierer i størrelse, især mellem dem med og uden størrelsesreduktion.
- Hurtigt orientere embryonerne, før den lave smelte Agopstået er størsnet, så embryonerne står helt sideværts til skålen. Efter montering af embryoner skal dæksedlen forsigtigt anbringes i agopstået holderen for at holde embryonerne på plads. Orienteringen er særlig vigtig for den langsigtede somite billeddannelse, fordi embryonerne skal være præcist sideværts monteret for alle de somite grænser, der skal tydeligt afbildes på senere stadier.
- Nedsænkes væk fra monteringsområdet og manipulere et 25 mm x 25 mm dækglas, således at det er 45 grader forskudt fra orienteringen af den firkantede indrykning foretaget af formen. Skub dækglas over formen i denne retning, indtil hvert hjørne hviler på en anden side af formen.
Bemærk: Selv om denne protokol er for en inverteret mikroskop, placere et cover glas på toppen af formen er stadig vigtigt, således at embryonerne ikke bevæger sig, mens overførsel til mikroskop.
-
Imaging somite-dannelsesproces
- Mikroskop foropvarmes til 28 °c i en inkubator, der er bygget med materiale boards og en kabinetvarmer.
- Petri skålen anbringes med de monterede embryoner på mikroskop stadiet. Find embryonet monteret i øverste venstre brønd af agopstået mount med lavere forstørrelse linse, derefter skifte målet til 10x.
- Opsætning af billed anskaffelse.
Bemærk: Denne instruktion er for lyse felt. - Find betingelser for lys effekt, eksponeringstid og kondensator, så den somite grænse kan ses tydeligt. Ved hjælp af z-stack indstillinger indstilles den laveste og højeste ønskede billed plan. Angiv det samlede tids-og tidsinterval. Find og registrere XY positioner af alle de embryoner, der er monteret, så flere embryoner kan være timelapse indpakket på én gang.
- Mål længden af PSM og somitter ved hjælp af Fiji16.
5. billeddannelse af neurale Rørmønster
- Forbered 100 mL 1% agopstået opløsning ved at tilsætte 1 g agopstået til 100 mL ægge vand, opvarmning indtil agopstået er helt opløst. Lad afkøle i 5-10 min til 62-72 °C. Juster tricain til 0,01%.
-
Forbered et dorsale beslag til billeddannelse.
Bemærk: denne vejledning er udviklet til brug med et opretstående fluorescens mikroskop. For inverterede mikroskoper dækglas bund retter er nødvendige og monteringsretning i trin 3 er vendt.- Der hældes ~ 15 mL 1% agopstået i en 100 mm x 15 mm Petri skål. Flyde forsigtigt en dorsal Mount v1 skimmel på overfladen af agopstod for at undgå at indføre luftbobler. Lad det køle af, indtil der er opstået en fuld solidificeret.
- Fjern forsigtigt formen med pincet eller et barberblad. Fyld skålen med ægge vand med 0,01% tricain og dække indtil brug.
-
Mount embryoner til neurale rør Imaging.
- Tillad transgene eller injiceres fluorescerende størrelse-reduceret og kontrol embryoner til at udvikle indtil 20-25 somite fase (groft 18-22 h efter befrugtning). Embryoner, der udtrykker et fluorescerende membran mærke (MEM-mCherry, MEM-mBFP1, eller MEM-mcitrine) og en transgen reporter af neurale rørmønster (NKX 2.2: MEM-Gfp, dbx1b: gfpeller Olig2: dsred) anvendes til billedbehandling.
- Udskift ægge vand medium i tilberedt dorsale mount med 0,01% tricain arbejds løsning. Pipetter forsigtigt i embryoner for at blive indlagret i hullerne i rygbeslaget.
- Manipulér embryoner i den korrekte retning, så hovedet vender fremad i holderen, og halen peger mod bagsiden med rygdelen vendt mod vandoverfladen.
- Før fosteret, så halen ligger fladt og ikke peger nedad mod bunden af skålen. Det er nogle gange nyttigt at hvile den bageste del af halen på side afsatsen af monterings brønden for at forhindre halen i at synke og uforvarende billeddannelse af baghjernen. Gentag for hvert embryo. Gør visse med størrelse reducerede embryoner, at de ikke falder dybt ind i brøndene for at blive indpakket.
- Nedsænkes væk fra monteringsområdet og manipulere et 25 mm x 25 mm dækglas, således at det er 45 ° forskudt fra orienteringen af den firkantede indrykning foretaget af formen. Skub dækglas over formen i denne retning, indtil hvert hjørne hviler på en anden side af formen.
- Drej forsigtigt dækglasset, indtil det blidt falder på monteringsområdet. Check for at være sikker på embryoner er stadig monteret i de korrekte positioner og retninger. Hvis for meget bevægelse er forårsaget af faldende af dækglasset, fjerne forsigtigt og gentage montering fra trin C.
-
Billede i 3-D den udviklende rygmarv.
- Transport forsigtigt skålen indeholdende monterede embryoner til det konfokale mikroskop. For langtids levende billeddiagnostik skal du sørge for at bruge et inkueret mikroskop. Ellers er lave temperaturer tåleligt.
- Under lysfelt belysning, navigere til embryo til billede og centrere synsfeltet på den foretrukne forreste-posterior position. For at muliggøre en detaljeret sammenligning af embryonerne skal denne position på hvert embryo være konsistent.
- Indstil billedbehandlings parametrene til at vække og opfange signal fra de fluorescerende proteiner, der bliver indpakket. Parametre kan indstilles af øjet for at skabe et ønsket billede på den oprindelige prøve. Hvis du vil aktivere måle konsistens, skal du anvende disse indstillinger på alle embryoner i datasættet. Hvis mange z-stakke er nødvendige optimere indstillinger for hastighed.
- Brug z-stack indstillinger, indstille den laveste og højeste ønskede billed plan. For at opnå den optimale billedkvalitet i z-stakken skal du indstille z-opløsningen til den højeste, der er optimal for blænde indstillingen. Gode billeder kan genereres med 1 μm z-afstand.
- Analysér billeddata efter enhver foretrukken metode.
Bemærk: I dette tilfælde blev analysen udført med brugerdefinerede MATLAB scripts, der muliggør enkel segmentering af neurale dele af et billede og kvantificering af billeddiagnostik signal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Blomme volumen reduktion er vigtig for normal morfologi
Som for nylig beskrevet i Almuedo-Castillo et al.17, kan størrelsen reduktion af embryoner opnås uden at reducere æggeblomme volumen. At sammenligne med og uden blomme volumen reduktion, vi udførte både to-trins snitning (både blastula og æggeblomme) og blastula-kun hakke (figur 2 og supplerende Movie 1). To-trins hakkede embryoner viste tilsyneladende normal overordnet morfologi sammenlignet med kontrol (kun dechorionation) embryoner, bortset fra størrelsesforskel, i hele udviklingsstadier (Se top og midterste paneler i figur 2). På den anden side, blastula-kun hakkede embryoner viste en ejendommelig morfologi, især på tidligere stadier. Under epimagien havde embryonerne et nedbøjet og indrykket udseende (Se nederste panel for 70% epidrig i figur 2). På det følgende somite stadie blev det fundet, at midterlinjen var fladtrykt (dvs. at DV-længden er relativt kortere end ML-længden) på mange aksiale niveauer (Se bund paneler for 8 og 20 somite i figur 2). På de senere stadier viste kroppens strukturer, der støder op til æggeblommen, såsom midt-og baghjernen, og de første ~ 10 somitter, stadig en forholdsvis flad form, muligvis på grund af øget spænding fra den relativt større blomme.
Somite størrelse reduktion i størrelse reduceret embryoner
Somitter er segmenterende strukturer, der forekommer forbigående under embryogenese og giver anledning til ryghvirvler og skeletmuskulatur. Fra presomitisk mesoderm (PSM) dannes somitter en efter en fra den forreste til bageste retning på en periodisk måde (f. eks. 25 min for zebrafisk, 2 timer for mus) (figur 3a). Vi udførte timelapse billeddannelse af somite formation både til kontrol og hakkede embryoner og målte størrelsen af de fleste nydannede somitter (figur 3B). I både kontrol og hakkede embryoner blev de størrelser af somitter, der blev dannet i de senere stadier, anset for at være mindre sammenlignet med dem fra tidligere stadier. I løbet af de somite dannelses stadier havde hakkede embryoner også mindre somitter end dem i kontrol embryoner (figur 3C).
Neural rørs højder reduceres efter størrelsesreduktion
For at se effekten af embryo størrelse reduktion på neurale tube størrelse, vi udførte vores to-trins hakke teknik på MEM-mcherry injicerede embryoner og afbilde deres rygmarv ved 20 HPF ved hjælp af vores confokale Imaging System (figur 4A, B). I dette datasæt blev neurale rørhøjder reduceret efter størrelsesreduktion med 12,4% ± 3,2%, målt manuelt ved hjælp af brugerdefineret billedanalyse kode (figur 4C). Tilsammen viser disse data, at størrelsesreduktion reducerer neurale rørs højde. Denne teknik kan bruges til at måle virkningerne af størrelsen reduktion på neurale mønster.
Figur 1 : Størrelses reduktions teknik. Ca. 30%-40% af cellerne blev skåret fra dyre stangen (toppaneler). Membranen omkring æggeblommen blev omhyggeligt såret, så æggeblommen oozed ud (midterste paneler). For de følgende par minutter, blomme oozed ud og derefter sår på både blastoderm og æggeblomme helbredt op (bund paneler). Skaleringsbar = 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Sammenligning mellem to metoder til størrelsesreduktion. Kontrol embryoner (toppaneler, top embryoner til 24 HPF og 30 HPF), størrelse reducerede embryoner med to-trins snitning (blastula og æggeblomme, midterste paneler, midterste embryoner til 24 HPF og 30 HPF) og størrelse reduceret embryoner med blastula-kun hakke (bund paneler, bund embryoner for 24 HPF og 30 HPF) sammenlignes langs udviklingsstadier. Bemærk, at i blastula-kun hakkede embryoner, den blastoderm volumen er meget mindre i forhold til æggeblomme (ved 70% epipuly). Som et resultat, embryo har en uforholdsmæssig flad form på somite stadier (dvs., DV-aksen er relativt kortere sammenlignet med AP-aksen i blastula-kun hakkede embryoner, sammenlignet med kontrol eller en to-trins hakket en). Skala BA = 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Størrelsesreduktion reducerer længden af somitter. (A) skematisk illustration af somite formation. (B) lyse feltbilleder af kontrol og hakkede embryoner over tid. Gule pilespidser angiver den mest nydannede somite på hvert somite-stadie. C) målinger af somite længde (i forreste/bageste akse) over tid for både kontrol og hakkede embryoner. Fejllinjer repræsenterer standardafvigelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Størrelsesreduktion reducerer højden af neurale røret. (a-B) Eksempel billeder af normal størrelse (a) og størrelse reduceret (B) TG (ptch2: KAEDE) embryoner, som blev injiceret i enkelt celle stadiet med MEM-mcherry mRNA. Skala stang = 20 μm. (C) neurale rørs højder ekstraheret fra manuel segmentering af neurale rør i hver z-stak. Der observeres statistisk signifikante forskelle i den gennemsnitlige neurale højde, når værdierne sammenlignes ved hjælp af en ikke-parret t-test (p = 0,0397). Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende film 1: sammenligning mellem to-trins hakke versus blastula-kun hakke. Øverste række = kontrol embryoner, midterste række = størrelse reducerede embryoner med to trin snitning, nederste række = størrelse reducerede embryoner med blastula kun hakke. Film blev taget hver 3 min for 12 h. Scale bar = 1 mm. venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Historisk set, blandt hvirveldyr, størrelse reduktion har været hovedsagelig udført ved hjælp af padde fostre, ved at halvering embryoner langs animalsk-Vegetal akse på en blastula etape12. Men der er hovedsagelig to forskelle mellem frø og zebrafiske embryoner, når vi krydser embryoner. Først, på det tidspunkt, hvor: zebrafisk embryoner bliver tolerante over for halvering (blastula fase), arrangøren er beliggende i et begrænset område af blastula margin18,19,20,21. Fordi man ikke kan fortælle placeringen af arrangøren fra morfologien af embryoner, tilfældigt skære embryonet langs dyret-Vegetal akse producerer dorsalized eller ventralized embryoner. For det andet, i modsætning til frø embryoner,: zebrafisk embryoner gå gennem en proces kaldet epidrisk, hvor cellerne bevæger sig mod den vegetale pol omkring en separeret æggeblomme, indtil det er helt omgivet af celler. Hvis kun en del af blastoderm fjernes, er der færre celler tilbage til at opsluge en blomme af relativt større volumen, og som et resultat, morfologi synes påvirket efter epidril. Derfor anvender vi to-trins snitning, hvor vi hakke blastler i nærheden af dyret stang, for at undgå at afskære arrangøren, og sår blomme membranen, at gøre blomme størrelse proportional med blastula.
Ud over to-trins snitning, fandt vi det medium, hvor størrelsen reduktion kirurgi udføres er afgørende for inddrivelse af embryoner efter operationen. Blandt flere medier vi forsøgte (æg vand, æg vand + albumin, Danieau buffer, L15, L15 + FBS, 1/3x ringer, 1x ringer), kun 1/3x ringer og 1x ringer gav høje overlevelsesrater; i andre medier, kunne embryoner ikke komme sig efter sår.
En vigtig fejlfindings spids for lav overlevelsesrate er at bruge sunde embryoner fra sunde og unge FORÆLDREFISK. Vi bemærkede, at selv når kontrol ikke-size reducerede embryoner viser næsten 100% overlevelse sats, når størrelsen reduceret, embryoner fra ældre fisk tendens til at vise lavere overlevelse sats. Bemærk også, at overlevelsesraten tendens til at falde, når størrelsen reduktion er kombineret med yderligere forstyrrelser, såsom morpholino injektion.
Enkelheden i størrelses reduktions teknikken beskrevet her giver forskerne mulighed for at anvende denne teknik uden specialudstyr eller intensiv træning. Yderligere, da størrelsen reduceret embryoner forbliver mindre indtil senere stadier af udviklingen (når de begynder at spise, deres størrelse synes at indhente kontrol fisk), denne teknik kan anvendes til at studere skalering af mange væv og organer. Derfor gør denne teknik det muligt at kombinere størrelsesreduktion og kvantitativ in vivo Live imaging til at studere skalering og størrelses kontrol af forskellige systemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende eller økonomiske interesser.
Acknowledgments
Arbejdet blev støttet af PRESTO-programmet fra Japans videnskabs-og teknologi agentur (JPMJPR11AA) og et national Institut for sundhedstilskud (R01GM107733).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 mm PYREX Petri dish | CORNING | 3160-60 | |
| Agarose | affymetrix | 75817 | For making a mount for live imaging |
| Agarose, low gelling temperature Type VII-A | SIGMA-ALDRICH | A0701-25G | |
| CaCl2 | EMD | CX0130-1 | For 1/3 Ringer's solution |
| CaSO4 | For egg water | ||
| Cover slip (25 mm x 25 mm, Thickness 1) | CORNING | 2845-25 | |
| Disposable Spatula | VWR | 80081-188 | |
| Foam board | ELMER'S | 951300 | For microscope incubator |
| Forcept (No 55) | FST | 11255-20 | |
| Glass pipette | VWR | 14673-043 | |
| HEPES | SIGMA Life Science | H4034 | For 1/3 Ringer's solution |
| INCUKIT XL for Cabinet Incubators | INCUBATOR Warehouse.com | For microscope incubator | |
| Instant sea salt | Instant Ocean | 138510 | For egg water |
| KCl | SIGMA-ALDRICH | P4504 | For 1/3 Ringer's solution |
| Methyl cellulose | SIGMA-ALDRICH | M0387-100G | |
| NaCl | SIGMA-ALDRICH | S7653 | For 1/3 Ringer's solution |
| Petri dish | Falcon | 351029 | For making a mount for live imaging |
| Phenol red | SIGMA Life Science | P0290 | |
| Pipette pump | BEL-ART PRODUCTS | F37898 | |
| Pronase | EMD Millipore Corp | 53702-250KU | |
| Tricaine-S (MS222) | WESTERN CHEMICAL INC | NC0135573 | |
| Ultra thin bright annealed 316L dia. 0.035 mm Stainless Steel Weaving Wires | Sandra | The wire we used was obtained ~20 years ago and we could not find exactly the same one. This product has the same material and diameter as the one we use. |
References
- Cooke, J. Scale of body pattern adjusts to available cell number in amphibian embryos. Nature. 290, 775-778 (1981).
- Driesch, H. Entwicklungsmechanische Studien: I. Der Werthe der beiden ersten Furchungszellen in der Echinogdermenentwicklung. Experimentelle Erzeugung von Theil- und Doppelbildungen. Zeitschrift fur wissenschaftliche Zoologie. , (1892).
- Morgan, T. H. Half embryos and whole embryos from one of the first two blastomeres. Anatomischer Anzeiger. 10, 623-638 (1895).
- Ishimatsu, K., et al. Size-reduced embryos reveal a gradient scaling-based mechanism for zebrafish somite formation. Development. 145, (2018).
- Megason, S. G. In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy. Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).
- Graeden, E., Sive, H. Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy. Journal of Visualized Experiments. (26), e1217 (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments. (27), e1113 (2009).
- Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (138), e56969 (2018).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. Journal of Visualized Experiments. (29), e1394 (2009).
- Mizuno, T., Shinya, M., Takeda, H. Cell and tissue transplantation in zebrafish embryos. Methods in Molecular Biology. 127, 15-28 (1999).
- Cooke, J. Control of somite number during morphogenesis of a vertebrate, Xenopus laevis. Nature. 254, 196-199 (1975).
- Inomata, H., Shibata, T., Haraguchi, T., Sasai, Y. Scaling of dorsal-ventral patterning by embryo size-dependent degradation of Spemann's organizer signals. Cell. 153, 1296-1311 (2013).
- Gomez, C., et al. Control of segment number in vertebrate embryos. Nature. 454, 335-339 (2008).
- Lauschke, V. M., Tsiairis, C. D., Francois, P., Aulehla, A. Scaling of embryonic patterning based on phase-gradient encoding. Nature. 493, 101-105 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Almuedo-Castillo, M., et al. Scale-invariant patterning by size-dependent inhibition of Nodal signalling. Nature Cell Biology. 20, 1032-1042 (2018).
- Koos, D. S., Ho, R. K. The nieuwkoid gene characterizes and mediates a Nieuwkoop-center-like activity in the zebrafish. Current Biology. 8, 1199-1206 (1998).
- Yamanaka, Y., et al. A novel homeobox gene, dharma, can induce the organizer in a non-cell-autonomous manner. Genes and Development. 12, 2345-2353 (1998).
- Jesuthasan, S., Stahle, U. Dynamic microtubules and specification of the zebrafish embryonic axis. Current Biology. 7, 31-42 (1997).
- Schier, A. F., Talbot, W. S. The zebrafish organizer. Current Opinion in Genetics and Development. 8, 464-471 (1998).
