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Messung der potenzialimilatorischen Nitratreduktion zu Ammonium basierend auf 14NH4+/15NH4+ Analysen mittels Sequenzielle Umwandlung in N 2O

Published: October 7, 2020 doi: 10.3791/59562
Automatic Translation
1, 2,3, 2, 4, 4, 5, 1
1Department of Applied Chemistry, Graduate School of Engineering, Tokyo University of Agriculture and Technology, 1Department of Biological Sciences, Faculty of Science and Engineering, Chuo University, 2Faculty & Graduate School of Urban Environmental Sciences, Tokyo Metropolitan University, 3Center for Ecological Research, Kyoto University, 4Department of Chemistry, Faculty of Science, Toho University, 5Graduate School of Integrated Arts and Sciences, Hiroshima University

Summary

Eine Reihe von Methoden zur Bestimmung der potentiellen DNRA-Rate auf Basis von 14NH4+/15NH4+ Analysen wird detailliert bereitgestellt. NH4+ wird über mehrere Schritte in N2O umgewandelt und mittels Quadrupol-Gaschromatographie–Massenspektrometrie analysiert.

Abstract

Die Bedeutung des Verständnisses des Schicksals von Nitrat (NO3),dem dominanten N-Arten, das von terrestrischen auf aquatische Ökosysteme übertragen wird, hat zugenommen, weil die globalen Stickstoffbelastungen nach der Industrialisierung dramatisch zugenommen haben. Die dissimilatorische Nitratreduktion auf Ammonium (DNRA) und Denitrifikation sind beide mikrobiellen Prozesse, die NO3- zur Atmung verwenden. Im Vergleich zur Denitrifikation wurden quantitative Untersuchungen der DNRA-Aktivität nur in begrenztem Umfang durchgeführt. Dies hat zu einem unzureichenden Verständnis der Bedeutung von DNRA in NO3--Transformationen und den regulierenden Faktoren dieses Prozesses geführt. Ziel dieses Papiers ist es, ein detailliertes Verfahren zur Messung des potenziellen DNRA-Wertes in Umweltproben bereitzustellen. Kurz gesagt, kann die potentielle DNRA-Rate aus der 15N-markierten Ammonium (15NH4+) Akkumulationsrate in 15NO3berechnet werden. Die Bestimmung der in diesem Papier beschriebenen Konzentrationen 14NH4+ und 15NH4+ besteht aus den folgenden Schritten. Zunächst wird das NH4+ in der Probe extrahiert und auf einem gesäuerten Glasfilter als Ammoniumsalz eingeschlossen. Zweitens wird das eingeschlossene Ammonium eluiert und über Persulfatoxidation zu NO3- oxidiert. Drittens wird das NO3- über einen N 2 O-Reduktase-Mangel denitrifier in N2O umgewandelt.2 Schließlich wird das umgebaute N2O mit einem zuvor entwickelten Quadrupol-Gaschromatographie-Massenspektrometriesystem analysiert. Wir wandten diese Methode auf Salzsumpfsedimente an und berechneten deren potenzielle DNRA-Raten, was zeigt, dass die vorgeschlagenen Verfahren eine einfache und schnellere Bestimmung im Vergleich zu zuvor beschriebenen Methoden ermöglichen.

Introduction

Die künstliche Synthese von Stickstoffdünger und seine weit verbreitete Anwendung haben den globalen Stickstoffkreislauf stark gestört. Es wird geschätzt, dass sich der Transfer von reaktivem Stickstoff von terrestrischen zu Küstensystemen seit den vorindustriellen Zeiten1verdoppelt hat. Ein erheblicher Teil der Düngemittel, die auf ein bestimmtes Feld aufgebracht werden, wird vom Boden zu Flüssen oder Grundwasser abgewaschen, in erster Linie als NO3x 2. Dies kann zu Umweltproblemen wie Trinkwasserverschmutzung, Eutrophierung und Hypoxiebildung führen. NO3- in Wasserumgebungen wird durch biologische Assimilation und verschiedene mikrobielle dissimilatorische Prozesse aus dem Ökosystem entfernt oder zurückgehalten. Denitrifikation und Anammox sind bekannt, dass wichtige mikrobielle Entfernungsprozesse für NO3. Die Denitrifikation ist die mikrobielle Reduktion von NO3auf gasförmige N-Produkte (NO,N2O undN2) in Verbindung mit der Oxidation eines Elektronenspenders, wie organischesubstanzen, wodurch das Risiko der oben genannten Probleme verringert wird. Anammox produziert auch N2 aus NO2und NH4+; daher entfernt es anorganisches N aus einem Ökosystem. Umgekehrt arbeitet die DNRA daran, N in einem Ökosystem zu erhalten; es ist allgemein anerkannt, dass DNRA hauptsächlich durch fermentative Bakterien oder chemolithoautotrophe Bakterien durchgeführt wird und dass sie dissimilatorische NO3- auf bioverfügbar und weniger mobile NH4+reduzieren und reduzieren.

Studien über DNRA wurden hauptsächlich in marinen oder mündungsischen Ökosystemen wie ozeanischen oder mündungsigen Sedimenten und Wasser, Salz- oder Brackwiesenböden und Mangrovenböden durchgeführt. Küsten- oder Meeresökosysteme sind wichtig als Reservoirs für die Entfernung von NO3aus terrestrischen Ökosystemen, und in früheren Studien hat sich gezeigt, dass DNRA über einen sehr breiten Bereich von NO3beitragen -Entfernung (0–99%)3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. Darüber hinaus wurde die Existenz von DNRA in einer Vielzahl von Umgebungen nachgewiesen, einschließlich Süßwasserumgebungen19,ReisrohreBöden 20und Waldböden21. Während diese Studien gezeigt haben, dass DNRA potenziell mit der Denitrifikation für NO3--Entfernung vergleichbar ist, sind Studien zur Messung der DNRA-Aktivität im Vergleich zu denen, die die Denitrifikation messen, immer noch sehr begrenzt.

Die DNRA-Rate wurde mit 15N-Labeling-Techniken in Verbindung mit der Datenanalyse mittels analytischer oder numerischer Modelle ausgewertet. Eine analytische Lösung zur Berechnung der DNRA-Rate basiert auf der Erhöhung der 15N-Anreicherung des NH4+ Pools nach dem Hinzufügen von 15NO3- als Tracer. 15 N-labeled NO3- wird einer Probe hinzugefügt und inkubiert, und die DNRA-Rate kann dann aus den Konzentrations- und Isotopenverhältnisänderungen in NH4+ vor und nach einem bestimmten Zeitraum berechnet werden. In diesem Papier wird eine Methode zur Quantifizierung der NH4+ Konzentration und des Isotopenverhältnisses, die zur Berechnung der DNRA-Rate erforderlich sind, ausführlich beschrieben. Grundsätzlich ist die hier beschriebene Methode eine Kombination aus mehreren zuvor gemeldeten Techniken22,23,24,25,26 mit Änderungen, die einigen Prozeduren hinzugefügt wurden. Das Verfahren besteht aus einer Reihe von fünf Komponentenverfahren: (1) Inkubation einer Umweltprobe mit der Änderung eines stabilen Isotopentracers, 15NO3,(2) Extraktion und Rückgewinnung von NH4+ unter Verwendung eines "Diffusionsverfahrens" mit Modifikationen, (3) Persulfatoxidation von NH4+ in der Probe, bestehend aus einheimischen NH4+ und 15NH4+ abgeleitet von 15NO3- über DNRA-Aktivität, in NO3und 15NO3,(4) nachfolgende mikrobielle Transformation von NO3und 15NO3- zuN2O Isotopomern über die modifizierte Denitrifiermethode und (5) Quantifizierung der N2O Isotopomere mittels Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC/MS). Im folgenden Abschnitt wird zunächst die Vorbereitung der Verfahren (2) und (4) beschrieben und anschließend alle fünf Komponentenverfahren ausführlich beschrieben.

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Protocol

1. Erstellung eines PTFE-Umschlags zur quantitativen Erfassung gasförmiger NH3

  1. Legen Sie ein 60-mm-Stück Polytetrafluorethylen (PTFE) (25 mm Breite) auf eine kleine Folie aus Aluminiumfolie (ca. 300 mm x 450 mm groß, mit Ethanol abgewischt).
  2. Asche ein Glasfaserfilter (10 mm Durchmesser mit einer Porengröße von 2,7 m) bei 450 °C für 4 h in einem Muffelofen. Legen Sie den Glasfaserfilter etwas über dem Mittelpunkt der längeren Achse des Bandes (Abbildung 1a).
  3. Spot 20 'L von 0.9-mol/L H2SO4 auf der Mitte eines GF/D-Filters, und falten Sie sofort das PTFE-Band mit zwei Pinzetten: flach-ended Stempel Pinzette und gerade-Ended Pinzette. Die folgenden Schritte, die Schritte 1.4–1.7, sind in Abbildung 1 dargestellt und sollten schnell ausgeführt werden.
  4. Drehen Sie das PTFE-Band über den GF/D-Filter an der gepunkteten Linie in Abbildung 1a, um die in Abbildung 1bdargestellte Form zu bilden.
  5. Beide Seiten durch Falten versiegeln und dann mit der Pinzette fest an der Kante drücken (Abbildung 1c). Drücken Sie nicht zu hart, und kratzen Sie nicht das PTFE-Band.
  6. Falten Sie das offene Ende mit der Pinzette, und drücken Sie dann die Kante mit der Pinzette (Abbildung 1d).
  7. Versiegeln Sie das offene Ende, indem Sie die Kante mit der Pinzette fest drücken (Abbildung 1e). Der GF/D-Filter sollte während dieses Vorgangs nicht gedrückt werden.

2. Vorbereitung der Biomasse eines Lachgas-Reduktase-Mangels, Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens ATCC13985, für die Denitrifier-Methode

  1. Streichen Sie einen 20% Glycerin-Bestand von Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens ATCC13985 auf 1/4 Stärke Tryptone Sojabrühe (TSB) Agarplatten. Inkubieren Sie die Platten bei 25 °C für 2-3 Tage.
  2. Eine Einzelkolonie von P. chlororaphis in ein kleines Reagenzglas mit 5 ml autoklaviertem TSB-Medium und Kultur aerob (ohne Schütteln) für einen Tag bei 25 °C bei Dunkelheit übertragen, bis maximales Wachstum erreicht wird; dies wird als Vorkultur verwendet werden.
  3. 3 ml der Präkultur in eine 1-L-Flasche mit einem Siliziumkautschukstopfen mit 1 L frisch zubereiteten autoklavierten modifizierten TSB, ergänzt mit 10 mmol/L KNO323. Inkubieren Sie die Flasche beim Rühren mit einem Rührwerk unter dunklen Bedingungen bei 25 °C. Nach dem Kultivieren für 8 h, ersetzen Sie den Silizium-Gummistopfen mit einem Schraubverschluss und dicht schließen. Setzen Sie den Anbau in Anoxia über Nacht fort.
  4. Zentrifugieren Sie die Kultur bei 18.800 x g für 15 min bei 4 °C, um Biomassepellets zu erhalten.
  5. Waschen Sie die verpackte Biomasse dreimal mit 30 ml Phosphat-gepufferter Saline (D-PBS(-), pH 7.5), um das NO3vollständig zueliminieren. Die Bedingungen der Zentrifugation sind die gleichen wie in Schritt 2.3.
  6. Nach dem Waschen die verpackte Biomasse mit 30 ml D-PBS(-) wieder aufhängen. Verwenden Sie 1 ml der Suspension, um die Zelldichte durch Messung von OD600zu bestimmen. Pipette 1 ml Aliquots der verbleibenden Suspension in sterile Kryovitale mit 0,8 ml 45% Glycerin. Bewahren Sie die zubereiteten Glyzerinbestände bis zur Verwendung bei 80 °C auf (siehe Abschnitt 6).

3. Eliminierung von Sauerstoff, Nitrit und Nitrat aus dem Probensediment

  1. 3,0 g Sediment in eine 20 ml Glasdurchstechflasche wiegen und 9,0 ml Oberflächenwasser hinzufügen, um es aufzuhängen (25% w/w Gülle).
  2. Versiegeln Sie die Durchstechflasche mit einem schwarzen Butylkautschukstopfen (mit Ionen ausgetauschtem Wasser gewaschen und über Autoklavieren sterilisiert) und einer Aluminiumkappe.
  3. Bereinigen Sie die Aufhängung und ersetzen Sie die Kopfraumluft durch Ar (>99.99%) bei 0,6 L/min für 20 min mit einem Verteiler.
  4. Ersetzen Sie das Ar-Kopfraumgas durch ultra-reines (>99.99995%) Er durch Staubsaugen für 90 s und Aufladen Er für 30 s. Wiederholen Sie diesen Vorgang viermal. Stellen Sie den Kopfraum-Gasdruck auf 1,5 atm ein.
  5. Inkubieren Sie die Durchstechflaschen bei 20 °C über Nacht mit Schütteln bei 150 U/min unter dunklen Bedingungen, indem Sie einen konstanten Temperaturstreuer verwenden, um den verbleibenden Sauerstoff, Nitrat und Nitrit in der Sedimentsuspension und dem Kopfraumgas zu eliminieren.

4. Zeitkursexperiment zur Bestimmung der DNRA-Rate

  1. Ersetzen Sie das Headspace-Gas mit frischem ultra-reinen Er mit dem gleichen Verfahren wie in Schritt 3.5, aber ohne die vier Wiederholungen.
  2. Jede Durchstechflasche gemäß Tabelle 1 durch den Butylkautschukstopfen mit einer gasdichten Spritze mit beschrifteten und nicht beschrifteten Substraten hinzufügen. Reinigen Sie die zuvor vorbereiteten Substratlösungen in ausreichend großen Glasfläschchen mit ultra-reinem He mit dem Druck des Kopfraums auf 1,5 atm, um Luftverschmutzung zu vermeiden. Vermeiden Sie die unbeabsichtigte Injektion von Luftmenge während der Injektionsverfahren.
  3. Inkubieren Sie Fläschchen bei 20 °C mit Schütteln bei 150 Rpm. Fügen Sie die Substrate zu jeder Durchstechflasche nach Tabelle 1 hinzu und brüten sie für 1 h, 3 h und 5 h. Nachdem die Inkubation angehalten wurde, unterziehen Sie die Sedimentsuspension in den Durchstechflaschen den folgenden Verfahren: Schritte 4.4–4.9.
  4. Entfernen Sie die Aluminiumkappe und den Butylkautschukstopfen aus jeder Durchstechflasche. Fügen Sie dann KCl (bei 450 °C für 4 h) in die Sedimentsuspension bis zu einer Endkonzentration von ca. 2 mol/L ein, um die Rückgewinnung von NH4+ aus dem Sediment zu gewährleisten. Schließen Sie die Fläschchen mit einem Butylgummistopfen und einem Aluminiumverschluss.
  5. Schütteln Sie das Sediment bei 150 U/min für 1 h bei 4 °C unter dunklen Bedingungen, um das NH4+zu extrahieren.
  6. Die gesamte Sedimentsuspension in der Durchstechflasche in ein 50 ml Kunststoffzentrifugenrohr und Zentrifuge bei 10.000 x g für 10 min bei 4 °C übertragen.
  7. Spülen Sie die Innenwand einer frisch geöffneten 10-ml-Einwegspritze aus und befestigen Sie sie an einem frisch geöffneten Einweg-Celluloseacetatmembranfilter (Porengröße 0,22 mm, 25 mm Durchmesser). Dann spülen Sie den Membranfilter mit 1 ml Überstand ab. Legen Sie die spülte Spritze-Filtereinheit auf eine 20-ml-Breitmaul-Polypropylenflasche (PP).
  8. Filtern Sie den restlichen Überstand durch einen Acetatmembranfilter in die 20-ml PP-Flasche. Bewahren Sie die Extrakte bis zur weiteren Analyse bei 20 °C auf.

− 5. Erfassung diffuser NH4+ in 2M H2SO4 absorbiert in den GF/D-Filter in der PTFE-Hüllkurve und die Persulfatoxidation von NH4+ bis NO3

  1. Bereiten Sie Standardlösungen von 14NH4Cl mit Konzentrationsgradienten von 0 mol/L, 10 mol/L, 40 mol/L, 100 mol/L, 200 mol/L, 400 mol/L und 500 mol/L vor. Für die 15N-Verhältnis-Analyse fixieren Sie die Gesamtkonzentration von NH4+ bis 200 mol/L und bereiten Isotopverhältnisse von 100:0, 99,5:0,5, 99:1, 93:7, 90:10, 50:50 und 10:90 mit reinen 14NH4Cl und 15NH4Cl Standardlösungen vor.
  2. 30 mg MgO (bei 450 °C für 4 h) in eine 20-ml-Glasdurchstechflasche geben und die PTFE-Umhüllung in die Durchstechflasche legen.
  3. 5 ml einer Probe oder eines Standards in die Durchstechflasche mit dem MgO und dem PTFE-Umschlag geben und sofort mit einem grauen Butylkautschukstopfen schließen. Dichtung mit Einer Aluminiumkappe. Wenn die Konzentration von NH4+ voraussichtlich 500 mol/L überschreitet, verdünnen Sie die Probe auf unter 500 mol/L.
  4. Die Durchstechflaschen bei 150 U/min bei 3 h bei 4 °C unter dunklen Bedingungen schütteln.
  5. Entfernen Sie die Aluminiumkappe und den Butylgummistopfen. Nehmen Sie den PTFE-Umschlag mit einer punktgebundenen Pinzette aus der Durchstechflasche, spülen Sie den Umschlag und die Pinzette mit Ionen umwobenem Wasser gründlich ab, wischen Sie sie mit einem Wischpapier ab und legen Sie den Umschlag dann auf ein frisches Wischpapier.
  6. Öffnen Sie den PTFE-Umschlag mit ein paar Pinzetten (die Verwendung sowohl der flachen als auch der punktgebundenen Pinzette wird empfohlen) in der exakten umgekehrten Reihenfolge der Faltung in den Schritten 1.4–1.7.
  7. Halten Sie den Randbereich des GF/D-Filters, bei dem derH2SO4 ohne Absorbiert sein soll, mit der flachen Pinzette und übertragen Sie ihn in ein 11-ml-Schraubverschluss-Prüfrohr mit einer PTFE-gefütterten Kappe. Spülen Sie die Pinzette mit Ionen-ausgetauschtem Wasser und wischen Sie sie mit Wischpapier ab.
  8. Wiederholen Sie die Schritte 5.5–5.7 für die verbleibenden Umschläge.
  9. Fügen Sie 1 ml Ionen-getauschtes Wasser in jedes der Reagenzgläser, schließen Sie den Schraubverschluss und halten Sie ihn ohne Schütteln für mindestens 30 min bei Raumtemperatur, um das NH4+ vollständig aus dem GF/D-Filter zu entfernen. Führen Sie in diesem Schritt den folgenden Schritt (Schritt 5.10) parallel aus.
  10. Bereiten Sie das Persulfat-Oxidierende Lösung (POR) Reagenz25,26vor.
    1. Da es nicht gelagert werden kann, bereiten Sie die genaue Menge an POR vor, die für die Behandlung eines einzigen Probentages benötigt wird.
    2. Zur Vorbereitung von POR zur Behandlung von 50 Proben 100 ml Ionen-getauschtes Wasser in eine 200-ml-Schraubverschlussflasche gießen und 1,52 g NaOH (Stickstoff-Compound-Analysegrad), 3 g Borsäure und 5 g K2S2O8 (Stickstoff- und Phosphoranalysegrad) in dieser Reihenfolge hinzufügen. Unmittelbar nach zugabe jedes Reagenz die Lösung schütteln, bis sie vollständig gelöst ist.
    3. Falls erforderlich, tränken Sie die Flasche in warmem Wasser, um die Auflösung der Chemikalien zu helfen; jedoch sollte im Hinblick auf die Kontamination von NO3darauf geachtet werden, da Leitungswasser normalerweise NO3enthält.
  11. Nach Schritt 5.8 die Schraubkappe öffnen, 2 ml des POR-Reagenzes in das Reagenz geben und das Rohr mit einem Schraubverschluss fest schließen, um Verluste oder Verunreinigungen in den folgenden Schritten zu vermeiden.
  12. Die Reagenzgläser auf einem Rack aufstellen, in doppellagige Aluminiumfolie wickeln und 1 h bei 121 °C autoklavieren. Halten Sie die Rohre während dieses Schritts in aufrechter Position und vermeiden Sie schnelle Temperaturänderungen nach Abschluss des Autoklavierens.

6. Bestimmung des NO3- konvertiert von NH4+ durch die Denitrifier-Methode mit Quadrupol GC/MS

  1. Mischen Sie 100 ml sterilen 40-mmol/L Phosphatpuffer (pH 7,2) und 100 ml sterile 30-mlmol/L-Glukose aseptisch (20-mmol/L Phosphat und 15-mmol/L Glukose; endend).
  2. Fügen Sie ein 1/7,2 Volumen des Glycerinbestands von P. Chlororaphis zu 200 ml der phosphatgepufferten Glukoselösung in einen 300-ml-Erlenmeyerkolben und spülen Sie mit einem ultrareinen He (>99.995%) Stream für 1 h.
  3. 2,0 ml der Denitrifiersuspension in jede 5-ml-Durchstechflasche geben. Kappen Sie die Fläschchen mit einem grauen Butylgummistopfen und einem Aluminiumverschluss.
  4. Ersetzen Sie die Kopfraumluft durch ultra-reine Er, indem Sie für 3 min saugen und das He für 1 min aufladen. Stellen Sie den Kopfraumgas-Positivdruck auf 1,3 atm ein, um eine unbeabsichtigte Luftverschmutzung zu vermeiden.
  5. Injizieren Sie 1 ml einer Probe oder eines Standards durch den Butylkautschukstopfen mit einer 1-ml Einwegspritze. Beachten Sie die genaue Menge der tatsächlich injizierten Probe.
  6. Die Durchstechflaschen über Nacht bei 25 °C unter dunklen Bedingungen inkubieren.
  7. Injizieren Sie 0,3 ml 6-mol/LL NaOH, um die Denitrifikation zu stoppen und den KopfraumCO2zu absorbieren, der ansonsten dieN2O-Analyse von GC/MS ernsthaft stören wird, daCO2 undN2O das gleiche Molekulargewicht haben.
  8. Bestimmen Sie die Mengen von 44N2O, 45N2O und 46N2O im Headspace-Gas mit Quadrupol GC/MS mit einem modifizierten Injektionsanschluss25. Die für die GC/MS-Analyse verwendeten Betriebsbedingungen sind in Tabelle 2dargestellt.

7. Datenanalyse

  1. Ableiten Sie die Kalibrierkurve für die NH4+ Konzentration aus der linearen Beziehung zwischen der bekannten Konzentration von 14NH4+ und den gemessenen Signalintensitäten der insgesamt erzeugten 44N2O + 45N2O + 46N2O. Ableiten Sie die Kalibrierkurve für den 15N-Gehalt aus der linearen Beziehung zwischen dem bekannten Atom%(d.h.. 15N/14N+15N) und dem berechneten Atom% unter Verwendung einer zuvor bereitgestellten Gleichung27. Berechnen Sie die Konzentration von 15NH4+ durch Multiplikation der Gesamt-NH4+ mit dem 15N Verhältnis von NH4+.
  2. Berechnen Sie die potenzielle DNRA-Rate mit Gleichungen, die an anderer Stelle bereitgestellt werden28,29,30.

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Representative Results

Die repräsentativen Ergebnisse, die in diesem Papier vorgestellt werden, stammen aus 15N-Tracing-Experimenten von Salzsumpfsedimenten. Der salzbeprobte Salzmarsch wurde nach dem Großen Erdbeben in Ostjapan 2011 im Moune-Gebiet der Stadt Kesen-numa in der Präfektur Miyagi in Japan neu geschaffen. Im September 2017 wurden an zwei Stellen in den Untergezeiten- und Gezeitenzonen Oberflächensedimente (0–3 cm) gesammelt. Zuerst wurde das Sediment unmittelbar nach der Sammlung durch ein 4-mm-Netz gesiebt, um Pflanzenwurzeln, Schalenschutt und Schutt zu entfernen, und dann homogenisiert. Die Proben wurden bei 4 °C gelagert, bis die DNRA-Analyse durchgeführt wurde.

Die Inkubationsverfahren für die 15NO3- und die gleichzeitige Bestimmung der Konzentrationen 14NH4+ und 15NH4+ wurden wie im Protokollabschnitt beschrieben durchgeführt. Für alle Sedimente wurde ein Anstieg der Konzentration um 15NH4+ während der gesamten Inkubationszeit beobachtet (Abbildung 2). Wir berechneten die DNRA-Raten, indem wir die Akkumulationsrate von 15NH4+ durch das Isotopenverhältnis des NO3- Pool29dividierten. Die berechneten Raten lagen im Bereich von 24,8–177 nmol-N gn1 trockenen Boden h-1 ( Tabelle3) und waren mit den werten in früheren Studien vergleichbar. Dieser Bereich der erhaltenen Raten ist höher als die gemeldeten Werte aus ähnlichen Umgebungen abgeleitet, einschließlich der aus Gezeitensedimente17, Salzwiesen5,16, und andere Mündungsumgebungen18,33,34, sowie aus eutrophen Umgebungen wie eine flache Flussmündung in North Carolina31 und die Shanghai städtischen Flussnetze32. Umgekehrt berichteten Fernandes et al.13 über höhere DNRA-Potenzialraten in organisch reichen Mangrovenböden in Indien. Im Allgemeinen wird angenommen, dass DNRA durch ein hohes Verhältnis von verfügbaren C zu Elektronenakzeptoren35,36,37begünstigt wird. Die Proben, die die repräsentativen Ergebnisse belegen, stammen aus einem Salzsumpf, der durch ein Erdbeben neu geschaffen wurde und ursprünglich als Anbaugebiet genutzt worden war. Dieses besondere Merkmal der Proben kann zur beobachteten hohen DNRA-Rate beitragen. In Übereinstimmung mit dieser Spekulation war die DNRA-Rate in der Gezeitenzone, die reich an organischen Verbindungen ist (Daten nicht dargestellt), im Vergleich zur Untergezeitenzone höher als in der Untergezeitenzone (Abbildung 2, Tabelle 3).

Figure 1
Abbildung 1: Erstellung eines PTFE-Umschlags zur Erfassung gasförmiger NH3. Der im Diffusionsverfahren verwendete PTFE-Umschlag wird durch Falten von PTFE-Band nach den Anweisungen in den Paneelen (A)–(E)hergestellt. Der säuernde Filter in der Hülle erfasst das gasförmige NH3. Diese Schritte sollten schnell durchgeführt werden. Ausführliche Informationen finden Sie in den Schritten 1.2–1.7 im Protokollabschnitt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Veränderung der Konzentration von 15NH4+ durch anaerobe Inkubation von Sedimenten. Die 15N Tracer-Inkubationen der Sedimentproben wurden in doppelter Ausführung durchgeführt. Die Konzentration von 15N-NH4+ wird in Nmol pro Trockengewicht des Sediments angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Ein Beispiel für die Kalibrierkurve mit niedriger Konzentration N2O. Die Spitzenfläche von N2O wurde durch die Summe der Spitzenfläche von m/z 44, m/z 45 und m/z 46 ermittelt. Konfigurationen für die GC/MS-Analyse sind in Tabelle 2 dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

15 N-markierte und nicht beschriftete Substrate, die jeder Durchstechflasche zugesetzt werden
100mM 100mM
NH4Cl K15NO3
Volumen (L) von 100 mM Lagerlösung, die jeder Durchstechflasche hinzugefügt wird 24 60
Endkonzentration (Mol/L)* >230§ 570
*angezeigte Werte werden berechnet, indem angenommen wird, dass der Wassergehalt des Sediments 50% beträgt
• je nach Hintergrund-Ammoniumkonzentration

Tabelle 1: Kombinationen von Substraten, die auf Durchstechflaschen geändert wurden, die etwa 11 ml der Sedimentsuspension zurückhalten. Die Proben wurden in zwei Urnen erstellt und nach 1 h, 3 h und 5 h Inkubation weiteren Analysen unterzogen.

Ausrüstung
Quadrupol GCMS Shimadzu GCMS-QP2010 Ultra
Spalte CP-PoraBONDQ 25m; φ 0,32 mm; Foliendicke, 5 m
Analytische Bedingungen
Spaltentemperatur 40 °C
Injektionsanschluss Temp 100 °C
Trägergasstrom Gesamtdurchfluss, 47,1 ml•min-1
Durchfluss in Derk. 2,10 mL•min-1
sprit-Verhältnis 20
Erkennungsspannung 1,5 kv
Empfindlichkeit von N2O
Untergrenze der Erkennung (LOD)* 1.42 pmol
Untergrenze der Quantifizierung (LOQ)* 4,58 pmol
*LOD und LOQ wurden durch eine lineare Beziehung zwischen einer seriellen Verdünnung von N2O (0,97, 1,94, 2,91, 4,75, 9,50, 14,3 ppm) in He, entsprechenden Antworten im Spitzenbereich und Dem/N-Verhältnis bestimmt. LOD und LOQ wurden als Konzentrationen berechnet, die S/N=3 bzw. S/N=10 entsprachen.

Tabelle 2: Bedingungen für die GC/MS-Analyse.

Sediment DNRA-Rate Anreicherung von NO3- *
nmol-N g-1 Std. -1 atom%
Intertidal 1 177 99.9
Intertidal 2 129 99.0
Untergezeiten 1 39.3 99.9
Untergezeiten 2 24.8 99.0
*gleiches wie Atom% des hinzugefügten KNO3; vollständige Eliminierung und keine Nitrifikation unter verwendeten Inkubationsbedingungen wurde zuvor getestet.

Tabelle 3: Potenzielle DNRA-Raten der getesteten Gezeiten- und Untergezeitensedimente.

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Discussion

Die Konzentration und das Isotopenverhältnis von NH4+ für die DNRA-Analyse wurden mit mehreren Methoden quantifiziert. Die Konzentrationen und Isotopenverhältnisse von NH4+ werden in der Regel getrennt gemessen. Die NH4+ Konzentration wird in der Regel mit kolorimetrischen Methoden einschließlich eines Autoanalyzers4,10,15,16,17gemessen. Die Isotopenverhältnismessung weist je nach NH4+ Umwandlungsmethode, Trapping und Instrumentierung für die Analyse große Schwankungen auf. Typische Methoden sind:

(1) Das NH4+ in der Probe wird über die Zugabe von MgO oder NaOH in NH3 umgewandelt. Nach dem Übergang von der flüssigen in die Gasphase wird das NH3 auf einem säuernden Glasfilter oder in einer Säurelösung eingeschlossen. Nach dem Trocknen wird der Filter mit einem Elementaranalysator/Isotopenverhältnis-Massenspektrometer (EA-IRMS)11,18,22,38als N2 verbrannt und analysiert. Alternativ wird das erfasste NH4+ in einer Säurelösung auf einem Adsorbentien (z.B. Zeolith) gesammelt und über EA-IRMS10,12verbrannt und analysiert.

(2) NH4+ wird durch Hypobromitoxidation zu N2 oxidiert. Die Isotopenzusammensetzung des entwickelten N2 wird mittels IRMS4,14,39 oder Membran-Einführungsmassenspektrometrie (MIMS)16,17gemessen.

(3) Die NH4+ Konzentration wird mittels hochleistungsliquider Chromatographie ohne Umwandlung bestimmt. Da das Gleichgewicht von NH4+ und NH3 für 15NH4+ und 14NH4+ in der Nähe des pH-Werts von pKaleicht unterschiedlich ist, können die Konzentrationen 14NH4+ und 15NH4+ auf basis einer kleinen Verschiebung der Retentionszeit6,,19,40bestimmt werden.

Die in diesem Papier beschriebene Methode ist im Wesentlichen die gleiche wie der oben aufgeführte Ansatz (1), d. h. der Schritt, der NH4+ als NH3 auf einem Glasfilter unter alkalischen Bedingungen zurückgewinnt; Es unterscheidet sich jedoch in Bezug auf die folgenden sequenziellen NH4+ Konvertierungsschritte. Diese Konvertierungsschritte basieren auf früheren Studien mit zusätzlichen Modifikationen, um die erforderliche Zeit für eine Reihe von Experimenten zu verkürzen. Zuerst haben wir einige Änderungen an der ursprünglichen Denitrifier-Methode vorgenommen. Nachdem die Biomasse von P. chlororaphis wie zuvorbeschrieben 23,24hergestellt wurde, züchten wir Bakterien und bewahren die konzentrierte Zellsuspension als Glycerinbestand. Diese dichte Zellsuspension kann direkt für die Isotopenanalyse verwendet werden, indem sie mit einer Pufferlösung vermischt wird, da die Denitrifyingsaktivität bereits ausreichend induziert wurde. Auch wenn weitere Untersuchungen erforderlich sind, kann diese Änderung die Reproduzierbarkeit der Analyse verbessern, da die vorgestellte Methode die Massenkultivierung von Denitrifierzellen ermöglicht, die direkt für Analysen zur Verfügung stehen. Wir haben auch die Zusammensetzung der Lösung zur Suspendierung der Bakterienzellen von einem Aufdergang auf TSB-Basis zu einer phosphatgepufferten Glukoselösung modifiziert, um die unnötigen Bestandteile wie Pepton im ursprünglichen Medium auszuschließen. Diese Änderung kann die Kontamination durch Leerling N verringern, da die phosphatgepufferte Glukoselösung im Gegensatz zu dem in früheren Studien verwendeten Ursprünglichen Medium kein N enthält; dies sollte durch weitere Analysen getestet werden. Im Schritt, der NH4+ über die Diffusionsmethode sammelt, haben wir die Inkubationszeit verkürzt und die Temperatur gesenkt, um den Abbau von organischem N und jede ungünstige Umwandlung oder verlustbringende NH4+zu minimieren. Die Gültigkeit dieser Änderung wurde anhand der Linearität der Kalibrierkurve überprüft. Wir haben auch überprüft, ob die geänderte Temperatur und Inkubationszeit die Wiederherstellung von NH4+ nicht beeinflusst hat (Daten werden nicht angezeigt).

Ein weiterer Vorteil dieser Methode ist, dass NH4+ letztlich in N2O umgewandelt wird, das einen niedrigen atmosphärischen Hintergrund hat und mit Quadrupol GC/MS gemessen werden kann, was kostengünstiger und einfacher zu verwalten ist als IRMS. Unter den in Tabelle 2 dargestellten Bedingungen sind CO2 (m/z 44) undN2O (m/z 44) vollständig durch GC getrennt; die Retentionszeit dieser Gase beträgt 1,15 bzw. 1,07 min. Da die atmosphärische Konzentration vonN2O in der Größenordnung von ppb liegt, kannN2O auch bei geringen Konzentrationen mit vernachlässigbaren Luftstörungen gemessen werden. Die Kalibrierkurve vonN2O verläuft fast durch den Ursprung und zeigt den Einfluss auf die Konzentration vonN2O aufgrund von Luftverschmutzung sehr begrenzt (Abbildung 3). Diese Methode hat auch den Vorteil, dass sie die Konzentrationen 14NH4+ und 15NH4+ zusammen quantifizieren kann; kanonische Methoden, mit Ausnahme des oben aufgeführten Ansatzes (3), erfordern individuelle Analysen der Konzentration und des Isotopenverhältnisses.

Insgesamt lagen die Nachweis- und Quantifizierungsgrenzen für NH4+ mit dieser Methode bei etwa 0,03 mol bzw. 0,09 mol, und diese Werte entsprechen 6 mol/L und 18 mol/L, wenn 5 ml der Probenlösung (d. h. der Sedimentextrakt in diesem Fall) für das in diesem Papier beschriebene Diffusionsverfahren verwendet werden. Obwohl die Verwendung der kolorimetrischen Methode zur Bestimmung der NH4+ Konzentration von Proben mit geringer NH4+empfohlen wird, bestimmt die vorgeschlagene Methode effektiv das NH4+ Isotopenverhältnis und die Konzentration in Proben mit relativ hohen Ammoniumkonzentrationen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Wir danken Naoto Tanaka für die Unterstützung bei der Datenerfassung und der Entwicklung des Protokolls. Die Sammlung von Samples wurde von JSPS KAKENHI Grant Number 17K15286 unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15N-KNO3 SHOKO SCIENCE N15-0197
15N-NH4Cl SHOKO SCIENCE N15-0034
20 mL PP bottle SANPLATEC 61-3210-18 Wide-mouth
Aluminum cap Maruemu 1307-13 No. 20, with hole
Boric acid Wako 021-02195
Centrifuge HITACHI Himac CR21G II
Deoxygenized Gas Pressure & Replace Injector SANSIN INDUSTRIAL IP-12
Disposable cellulose acetate membrane filter ADVANTEC 25CS020AS Pore size 0.22 µm, 25 mm in diameter
Disposable syringe Termo SS-10SZ 10 mL
Disposable syringe Termo SS-01T 1 mL
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (-) NISSUI PHARMACEUTICAL 5913
Gastight syringe VICI Valco Instruments 4075-15010 Series A-2, 100 µL
GC/MS shimadzu GCMS-QP2010ultra
GF/D Whatman 1823-010 10 mm in diameter
Glass vial Maruemu 0501-06 20 mL
Gray butyl rubber stopper Maruemu 1306-03 No.20-S
H2SO4 Wako 192-04696 Guaranteed Reagent
K2S2O8 Wako 169-11891 Nitrogen and Phosphorus analysis grade
KCl Wako 163-03545 Guaranteed Reagent
KNO3 Wako 160-04035 Guaranteed Reagent
NaOH Wako 191-08625 Nitrogen compounds analysis grade
NH4Cl Wako 017-02995 Guaranteed Reagent
Plastic centrifuge tube ASONE 1-3500-22 50 mL, VIO-50BN
Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens American Type Culture Collection (ATCC) ATCC 13985 Freeze-dried, the type strain of Pseudomonas aureofaciens
PTFE sealing tape Sigma-Aldrich Z221880 25 mm in width
Reciprocating shaker TAITEC 0000207-000 NR-10
Screw-cap test tube IWAKI 84-0252 11 mL
PTFE-lined cap for test tube IWAKI 84-0262
Tryptic Soy Broth Difco Laboratories 211825

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References

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Umweltwissenschaften Ausgabe 164 Stickstoffkreislauf dissimilatorische Nitratreduktion auf Ammonium (DNRA) 15N Tracer Diffusionsmethode Persulfatoxidation Quadrupole GC/MS Salzmarsch
Messung der potenzialimilatorischen Nitratreduktion zu Ammonium basierend auf <sup>14</sup>NH<sub>4</sub><sup>+</sup>/<sup>15</sup>NH<sub>4</sub><sup>+</sup> Analysen mittels Sequenzielle Umwandlung in N 2<sub>O</sub>
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Kuroiwa, M., Fukushima, K.,… More

Kuroiwa, M., Fukushima, K., Hashimoto, K., Senga, Y., Sato, T., Katsuyama, C., Suwa, Y. Measurement of the Potential Rates of Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium Based on 14NH4+/15NH4+ Analyses via Sequential Conversion to N2O. J. Vis. Exp. (164), e59562, doi:10.3791/59562 (2020).

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