Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Vervaardiging van amyloid-β-afscheidende alginaat Microbeads voor gebruik bij de modellering van de ziekte van Alzheimer

Published: July 6, 2019 doi: 10.3791/59597
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Division of Pharmacy and Optometry, School of Health Studies, Faculty of Biology, Medicine and Health, University of Manchester, 2Division of Neuroscience and Experimental Psychology, School of Biological Sciences, Faculty of Biology, Medicine and Health, University of Manchester

Summary

Dit protocol illustreert een cel inkapseling methode door snelle fysieke gelatie van alginaat om cellen te immobiliseren. Verkregen microbeads laten gecontroleerde en aanhoudende secretie van amyloid-β toe na verloop van tijd en kunnen worden gebruikt om de effecten van uitgescheiden amyloid-β in in vitro en in vivo modellen te bestuderen.

Abstract

Volgens de amyloïde Cascade hypothese, de vroegste trigger in de ontwikkeling van de ziekte van Alzheimer (AD) is de accumulatie van toxische amyloïde-β (Aβ) fragmenten, uiteindelijk leiden tot de klassieke kenmerken van de ziekte: amyloïde plaques, neurofibrillaire tangles en synaptische en neuronale verlies. Het ontbreken van relevante niet-transgene preklinische modellen die de ziekteprogressie reflecterend is een van de belangrijkste factoren die de ontdekking van effectieve medicamenteuze behandelingen belemmeren. Daartoe hebben we een protocol ontwikkeld voor de fabricage van alginaatmicrobeads met amyloïde-afscheidende cellen die nuttig zijn voor de studie van de effecten van chronische Aβ-productie.

De ovariumcellen van de Chinese Hamster werden eerder met een humaan APP-gen omsinfecteerd, waarbij Aβ (d.w.z. 7PA2-cellen) werd uitgescheiden. Een driedimensionaal (3D) in vitro model voor de aanhoudende afgifte van Aβ werd vervaardigd door inkaping van 7PA2 cellen in alginaat. Het proces werd geoptimaliseerd om een kraal diameter van 500-600 μm te targeten voor verdere in vivo studies. Optimalisatie van 7pa2 cel inkapseling in alginaat werd uitgevoerd wijziging fabricage parameters, bijvoorbeeld, alginaat concentratie, gel stroomsnelheid, elektrostatisch potentieel, hoofd trillingsfrequentie, geleer oplossing. De niveaus van uitgescheiden Aβ werden na verloop van tijd geanalyseerd en vergeleken tussen alginaatkralen en standaard celkweek methoden (tot 96 uur).

Een concentratie van 1,5 x 106 7pa2 cellen/ml en een alginaat concentratie van 2% (w/v) gebufferd met Hepes en daaropvolgende gelatie in 0,5 M calciumchloride gedurende 5 minuten bleken de meest stabiele microbeads te fabriceren. Vervaardigde microbeads waren 1) van uniforme grootte, 2) met een gemiddelde diameter van 550 μm, 3) met ongeveer 100-150 cellen per microbead en 4) in staat om Aβ te scheiden.

Kortom, onze geoptimaliseerde methode voor de productie van stabiele alginaatmicrobeads die amyloid-producerende 7PA2-cellen bevatten, kan het modelleren van belangrijke aspecten van AD zowel in vitro als in vivo mogelijk maken.

Introduction

Modellering van neurodegeneratieve ziekte is uitdagend als gevolg van de complexe en ingewikkelde aard van de hersenen. Bij de ziekte van Alzheimer (AD), het progressieve verlies van synaptische functie en de dood van neuronen wordt verondersteld te zijn een stroomafwaarts effect van aanhoudende overproductie en accumulatie van amyloïde Beta (Aβ) peptiden na abnormale verwerking van de amyloïde precursor eiwit (app) volgens de amyloïde Cascade hypothese1.

Om de mechanismen van deze amyloid-geïnduceerde pathologie te begrijpen en om te helpen bij het identificeren van nieuwe behandelings doelen, hebben wetenschappers verschillende in vivo preklinische modellen ontwikkeld. Eén categorie modellen maakt gebruik van een bolusinjectie van een synthetische Aβ-peptide in de rat-hersenen2,3,4. De belangrijkste beperking van dergelijke modellen is dat ze vertrouwen op een single-point of herhaalde behandelingen met Aβ peptiden in hoge concentraties gedeponeerd alles in één gaan. Dit is niet consistent met de chronische, aanhoudende aard van het vrijkomen van Aβ bij ziekte5. Een andere categorie van in vivo-modellen zijn transgene diermodellen die één of meer genetische mutaties in verband met de familiale variaties van de ziekte uitdrukken6,7,8,9, 10. Aangezien familiaire advertentie slechts goed is voor minder dan 5% van alle gevallen van Alzheimer11, is de relevantie van deze modellen bij de vertaling naar sporadische AD bij mensen twijfelachtig12. Een ander nadeel van de transgene benadering is de versnelde Aβ-formatie vanaf de geboorte, die zich vertaalt in tekorten in cognitieve functie en pathologische veranderingen te snel en agressief om de ziekteprogressie in sporadische AD bij patiënten te vertonen12 . Bijvoorbeeld, de 5x FAD model produceert plaques in zo weinig als 1,5 maanden13.

Interessant is dat beide categorieën resulteren in veranderingen in de cognitieve functie van relevantie voor AD-onderzoek2,3,4,5,6, en soms gaan ze gepaard met de verschijning van pathologische kenmerken van de ziekte zoals amyloïde plaques6,8, tau-fosforylering6,7 en/of synaptische en neuronale verlies7,9, 14. Maar hoewel dit soort modellen ons een inzicht kunnen geven in de effecten van hoge niveaus van amyloïde in de hersenen, die vaak worden geassocieerd met latere stadia van AD, zijn ze niet in overeenstemming met de eerdere veranderingen die werden tentoongesteld in reactie op de chronische en aanhoudende blootstelling aan de Aβ Peptide12, zoals veranderde expressie van synaptische markers15 en componenten in de extracellulaire matrix16. Daarom is er nog steeds behoefte aan het creëren van een chronisch model dat de effecten van aanhoudende Aβ-secretie op in vivo cognitie nauwkeuriger illustreert en veranderingen in pathologie illustreert.

Daartoe hebben we een systeem ontwikkeld dat de constante, aanhoudende secretie van Aβ op een gecontroleerde manier mogelijk maakt door de amyloid-afscheidende cellen binnen hydrogel microbeads te immobiliseren, die vervolgens kunnen worden geïmplanteerd binnen de volwassen rat hersenen om aspecten te modelleren van sporadische AD.

Alginaat was het geselecteerde biomateriaal omdat het biocompatibel is en geen nadelige reacties induceert wanneer het in vivo17wordt geïmplanteerd. Celencapsulation in alginaat hydrogels is in de afgelopen vier decennia goed vastgesteld. Het eerste voorbeeld van de vertaling naar de kliniek werd gerapporteerd voor de behandeling van diabetes mellitus type 117. Het vroegste rapport van succesvolle inkaping van eilandjes van Langerhans dateert van 1980. Transplantatie van microbeads bevattende insuline-afscheidende cellen revolutionaliseerde behandelingsopties voor diabetische patiënten als het herstelde pancreasfunctie, elimineren de noodzaak voor insuline injectie therapie18. Deze werken rapporteren over hoe celinkaping hen kan beschermen tegen externe spanningen, hetzij mechanisch of chemisch. In feite, alginaat kralen fungeren als een barrière en isoleren cellen uit de omgeving behouden van hun fenotype, terwijl het toestaan van voldoende toegang tot de omringende media voor voedingsstoffen en de klaring van cellulaire bijproducten19. Bovendien maakt het gebruik van alginaat het mogelijk om de mechanische eigenschappen van zacht weefsel20te vergelijken. Alginaat hydrogels kunnen worden afgesteld op een stijfheid van 1-30 kPa, door simpelweg wisselende alginaatconcentratie en dwarsbinding20,21. Dit is een essentieel aspect, niet alleen om de fenotypische expressie van ingekapselde cellen in vitro te behouden, maar ook om ontstekings effecten te voorkomen na engraftment in vivo22.

In dit protocol, 7pa2 cellen-een Chinese Hamster ovarium cellijn die stabiel is getransfundeerd met een menselijke app V717F gemuteerde Gene23 -worden gebruikt. Deze cellen produceren continu katalytische producten van de app, waaronder Aβ1-4224,25, en zijn gebruikt om Aβ te genereren als alternatief voor synthetische productie in preklinische, acute in vivo studies26. We beschrijven een fabricagemethode voor het immobiliseren van 7PA2-cellen binnen ' zachte ' alginaatmicrobeads, ontworpen om de aanhoudende secretie van biomoleules mogelijk te maken. Als een proof of concept, rapporteren we over de vrijlating van de Aβ1-42 peptide na verloop van tijd. Het alginaat dat wordt gebruikt, is een laagviscositeits alginaat met een molecuulgewicht van 120000-190000 g/mol en een mannuronische tot guluronische verhouding van 1,56 (M/G).

In verdere studies, deze microbeads kunnen veilig worden getransplanteerd in gebieden van de rat hersenen van relevantie voor AD (bijvoorbeeld de hippocampus) om te bestuderen van de effecten van chronische Aβ secretie op gedrag in vivo en pathologie ex vivo. Daarnaast kan dit systeem worden gebruikt om de effecten van chronische Aβ-vrijgave in in vitro-en ex vivo-toepassingen te bestuderen. Bijvoorbeeld, 7PA2-bevattende alginaat microbeads kunnen in vitro worden medegekweekt met neuronale of astrocytische culturen om de effecten van chronische Aβ blootstelling op cellulaire mechanismen geassocieerd met AD te beoordelen. Bovendien kan deze methode worden gebruikt om de relatie tussen chronische Aβ-productie en lange termijn potentiëring in ex vivo elektrofysiologie te onderzoeken.

Het hoogtepunt van dit protocol is de modulariteit en flexibiliteit van de fabricagemethode, die de vervaardiging van alginaatkralen met een doeldimensie mogelijk maakt door fijnafstelling fabricage parameters. Afhankelijk van de toepassing kan het protocol worden aangepast om op maat gemaakte doelen te verkrijgen met betrekking tot microbead grootte, dichtheid van de ingekapselde cellen en microbead stijfheid. Dit protocol kan worden gebruikt voor de inkaping van een verscheidenheid van celtypen, het ontwikkelen van meer relevante driedimensionale (3D) in vitro modellen om verschillende pathologieën te bestuderen. We hebben onlangs gerapporteerd over hoe alginaat-ingekapselde cellen kunnen worden gebruikt om vroege stadia van kanker progressie20te modelleren.

Het concept van het inkapings proces is gebaseerd op de extrusie van een laminaire straal cellen opgehangen in alginaat oplossing door middel van een nozzle. Een trillende kop verstoort de straal met een gecontroleerde frequentie resulterend in even grote alginaat gebaseerde druppeltjes. Een extern elektrisch veld maakt scheiding mogelijk van de gevormde druppeltjes op basis van alginaat, die bij aanraking met een oplossing verrijkt met divalente ionen, zoals calciumionen, snel kunnen kruisen, met behoud van hun bolvormige vorm. Incubatie in de gelatie oplossing maakt de vorming van sferische microbeads met cellen in een homogene fysische hydrogel27mogelijk. Doelgrootte van microbeads en alginaat hydrogels maakt het mogelijk nutriëntens en zuurstof uitwisseling met celkweek media voor langere tijd (weken). Figuur 1 A Toon een schematische weergave van de gebruikte inkapings apparatuur (Figuur 1B).

Figure 1
Figuur 1 : Het inkapings systeem. A) Schematische weergave van het inkapings systeem. Een alginaatcelsuspensie wordt in een spuit (2) geladen en via een reservoir gevoed met een extrusiesnelheid die is ingesteld bij de pomp van de spuit (1). In het reservoir trilt een trillingshoed (3) met een frequentie die is ingesteld door een golfvormgenerator (4) om de stroom met gelijke intervallen te verstoren, die even grote druppeltjes vormen. Omdat de oplossing wordt gevoed door een nozzle (5) en druppels worden gevormd, wordt een elektrostatisch potentiaal aangebracht over een elektrode (7) ingesteld door een spannings Generator (6), die het oppervlak van de druppeltjes enigszins oplaadt, waardoor de stroom zich kan verspreiden als gevolg van het afstoten elektrostatische krachten. Als druppels zich bezighouden met het gelering bad (8), CA2 +-gedreven cross-linking van alginaat resulteert in de vorming van sferische microbeads. B) foto van de encapsulator vóór de fabricage van alginaatmicrobeads. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Micro kraal grootte kan worden gewijzigd, afhankelijk van het beoogde gebruik. Om de grootte van de microbead te beheersen, worden de verschillende parameters die in Figuur 1A en in het protocol worden beschreven, dienovereenkomstig aangepast. De inwendige diameter van de gebruikte nozzle heeft een aanzienlijke invloed op de grootte van de druppels; verdere aanpassing van de inkapings parameters, namelijk de extrusiesnelheid, de trillingsfrequentie en de spanning, is essentieel om een consistente grootteverdeling te bereiken. Tafel 1 schetst hoe de verschillende parameters de grootte van de met dit systeem bereikte microbeads kunnen veranderen.

Parameter Grootte van de nozzle Trillingsfrequentie Debiet Elektrode spanning
Image 1 Image 1 Image 1 Image 1
Kraal grootte Image 1Image 1 Image 2 Image 1 –

Tabel 1: Fabricage parameters en hun invloed op de grootte van micro kraal. De tabel illustreert hoe elke parameter de resulterende grootte van gefabriceerde microbeads kan beïnvloeden, ongeacht de nozzle en de viscositeit van de gebruikte oplossing.

Protocol

1. preparaten

  1. Bereid 100 mL van ~ 4% (w/v) alginaat stamoplossing.
    1. Weeg 4,4 g alginaat natriumzout af en voeg het droge poeder toe aan 100 mL HEPES-gebufferde zoutoplossing (HBS, 20 mM HEPES (0,477 g) met 150 mM NaCl (0,877 g) in gedeïoniseerd water waardoor hydratatie mogelijk is.
    2. Gebruik een magnetische roerder bij ~ 500 omwentelingen per minuut (rpm) en verwarm tot 50 °C om volledige alginaat hydratatie mogelijk te maken.
      Opmerking: de alginaat kan een of twee uur nodig hebben om volledig gehydrateerd te zijn. Om op tijd te besparen, kan alginaat oplossing een dag vóór het inkapseling protocol worden gemaakt en opgeslagen bij 4 °c tot de volgende dag. Wanneer alginaat is gekoeld, verwarm dan zachtjes tot 37 °C met behulp van een waterbad of een hete plaat en roer met een magneetroerder onmiddellijk voor gebruik.
    3. Steriele filter de alginaatoplossing met een 0,22 μm porie polyethersulfon (PES) filter voor gebruik. Filtering wordt aanbevolen bij 37 °C om een gemakkelijke stroom van alginaat mogelijk te maken. De viscositeit zal toenemen als de temperatuur mag dalen.
  2. Bereid 1.000 mL 0,5 M CaCl2voor.
    1. Weeg 55,49 g watervrij CaCl2 af en los op in 1.000 ml HBS (20 mm hepes en 150 mm NaCl in 1.000 ml gedeïoniseerd water).
    2. Steriel filter met een porie-filter van 0,22 μm.
  3. Bereid 100 mL oplos mengsel voor.
    1. Bereid een 100 mM HEPES (23,83 g) en 500 mM Trinatriumcitraat dihydraat (147,05 g) oplossing in fosfaatgebufferde fysiologische Saline.
    2. Breng aan op pH 7,4 met NaOH of HCl.

2. het inkapings systeem instellen

  1. Reinig de laminaire stroom afzuigkap.
    1. Steriliseer de laminaire stroom afzuigkap met de encapsulator met UV-belichting gevolgd door spuiten met 70% v/v ethanol oplossing.
    2. Spoel het encapsulator-systeem met 10 mL 70% v/v ethanol oplossing, gevolgd door 10 mL steriel gedeïoniseerd water.
    3. Bevestig de nozzle van 300 μm en herhaal stap 2.1.2.
    4. Spray de fles met de gefilterde alginaatoplossing, de fles met gefilterde calciumchloride oplossing en alle gereedschappen, uitrusting en lege kweek platen die zullen worden gebruikt met 70% v/v ethanol oplossing en plaats deze in de laminaire stroom afzuigkap. Voorafgaand aan het gebruik, schakel een UV-licht opnieuw in voor 30 minuten om grondig te steriliseren.
    5. Maak een bekerglas dat gevuld is met een biologisch hoogwaardige desinfecterende oplossing en leg het bekerglas in de motorkap.
    6. Vul een bekerglas met 100 mL steriele CaCl2 (waterige) oplossing en voeg een magneetroerder toe. Stel de roersnelheid in op 100 rpm. Plaats het bekerglas op een magnetisch perron op een hoogte van 18 cm vanaf de punt van het mondstuk. Dit bekerglas wordt gebruikt om alginaat kralen te verzamelen en hun gelatie toe te staan.
  2. Maak cellen gereed voor inkaping.
    1. Verwijder cellen uit de incubator en maak deze los van de near-confluente kolf met behulp van 0,25% trypsine-EDTA-oplossing en Incubeer bij 37 °c gedurende 5-10 min.
    2. Isoleer een monster voor een schatting van de celdichtheid en centrifugeer vervolgens de resterende cellen bij 1.000 rpm gedurende 5 minuten om een celpellet te verkrijgen.
    3. Respendeer de pellet in HBS (20 mM HEPES en 150 mM NaCl) om de uiteindelijke gewenste celconcentratie te verdubbelen (bijv. voor een uiteindelijke concentratie van 1,5 x 106 cellen/ml, hervat de cellen in HBS om een concentratie van 3 x 106 cellen/ml te bereiken).
    4. Meng in een centrifugebuis van 50 mL de celsuspensie in een 1:1-verhouding met ~ 4% (w/v) alginaat oplossing om een definitieve suspensie te verkrijgen met de gewenste celconcentratie (bijv. 1,5 x 106 cellen/ml) in een ~ 2% (w/v) alginaat oplossing.
  3. Stel de inkapings parameters in.
    1. Stel de snelheid van de encapsulator machine in op de maximale extrusiesnelheid (8,9 mL/min), de spanning tot 1,0 kV en de frequentie tot 5.500 Hz.
      Opmerking: deze parameters zijn eerder geoptimaliseerd voor het verkrijgen van microbeads van 550 μm in diameter.

3. fabricage

  1. Fabriceren van de microbeads.
    1. In een 20 mL spuit, laden 5 mL van de cel-alginaat suspensie en bevestig een spuit aan de encapsulator.
    2. Start de encapsulator door het activeren van de stroom die zal duwen de cel-alginate schorsing door de feeder. Een stroom van druppeltjes wordt geëxtrudeerd door het mondstuk.
    3. Verzamel de eerste 1 mL in het bekerglas om de oorspronkelijke niet-uniforme stroom te vernietigen.
    4. Ga verder met het uitvoeren van de resterende 4 ml waardoor de druppeltjes in het CACL2 gelering bad kunnen vallen. Elke milliliter kan afzonderlijk worden uitgevoerd (maar achtereenvolgens) en verzameld in vier verschillende gelatie Baden indien nodig.
      Opmerking: bij contact met het gelering bad zal de alginaat in de druppels direct kruislings linken met de calciumionen in het gelering bad en bolvormige microbeads vormen.
    5. Na een minuut, verwijder het gelering bekerglas van het magnetische platform en laat de microbeads te zitten voor nog eens 4 min zonder roeren (tijd nodig om volledige gelatie over de microbeads bij kamertemperatuur).
  2. Haal microbeads op.
    1. Verwijder alle grote alginaat puin of artefacten met een paar steriele pincet en gebruik vervolgens een steriele plastic pipet om over te brengen naar een 74 μm mesh filter om de microbeads uit het gelering bad te halen.
    2. Breng de microbeads over in een centrifugebuis met behulp van het juiste kweekmedium en laat 5 minuten in het celkweekmedium equilibraten.
    3. Transfer naar een kolf, plaat of Petri schaaltje voor incubatie en verdere experimenten.
      Opmerking: het Gelation Bad mag niet worden hergebruikt.

4. testen en gebruik van microbeads

  1. Test microbead kwaliteit.
    1. Om de levensvatbaarheid van de cel (of andere biologische uitlezingen) na inkapseling en cultuur te beoordelen, verstoort u de microbeads voorzichtig om de ingekapselde cellen met behulp van de ontbinding mix vrij te geven.
      Opmerking: het vereiste volume van de oplos mix is afhankelijk van het aantal gebruikte microbeads per test. Een voorgesteld rantsoen is 4 mL oplos mix tot elke 1 mL ingekapselde cellen. Deze stap moet alleen worden uitgevoerd op een enkel monster van elke populatie microbead.
    2. Incuberen de cellen in een celkweek incubator, aangevuld met 5% CO2 bij 37 °c gedurende 10 minuten.
    3. Ramings cel levensvatbaarheid voor cellen nu in oplossing zoals gebruikelijk door kleurings cellen met trypan blauw en met behulp van een hemocytometer kamer.
      Opmerking: als het gebruik van geautomatiseerde celtellers voor schattingen van de levensvatbaarheid van de cel, moet worden gezorgd om te voorkomen dat alginaat artefacten interfereren met de graven. In die gevallen wordt het tellen van naual cellen geadviseerd.
    4. Om de stabiliteit van micro kraal te beoordelen, meet u de gemiddelde diameter voor een monster van elke microbead populatie gedurende een tijdsverloop met behulp van een microscoop en imaging software. Dramatische daaropvolgende variaties in diameter kunnen indicatief zijn voor alginaat afbraak.
  2. Gebruik microbeads voor de detectie van uitgescheiden Aβ.
    1. Proef celkweek media van 7PA2-cellen gekweekt in standaardomstandigheden (2D) met intervallen van 24 uur en bewaar bij-20 °C voor verdere analyse.
    2. Monster celkweek media van Encapsulated 7PA2 cellen gekweekt in standaardomstandigheden (3D) met intervallen van 24 uur en bewaren bij-20 °C voor verdere analyse.
    3. Detecteer de secretie van Aβ van 7PA2-cellen in verzamelde geconditioneerde media door enzym-linked immunosorbent assay (ELISA) (Figuur 4).
  3. Gebruik de microbeads voor verdere studie in relevante toepassingen.
    Opmerking: Encapsulated 7PA2-cellen kunnen worden gebruikt om de effecten van aanhoudende Aβ-secretie in elk of model te beoordelen.
    1. Voor microbead engraftment binnen de rat hippocampus in de hersenen, genereren 1 mm dikke coronale secties van de hersenen van de rat en gebruik chirurgische hulpmiddelen om microbeads in het gewenste gebied in te voegen (Figuur 5).
    2. Encapsulate verschillende celtypen in alginaat microbeads volgens de beschreven protocollen om de aanhoudende afgifte van de biomoleules van belang te beoordelen. Relevante in vitro en in vivo systemen kunnen verder worden gemodelleerd.
    3. Detecteer de uitdrukking van membraan afhankelijke markers van ingekapselde cellen met behulp van Flowcytometrie en/of immunofluorescentie.
      Opmerking: een voorbeeld van het gebruik van een soortgelijke methode voor de vervaardiging van microbeads modellering vroege stadia van tumor massa groei en biomarker expressie wordt beschreven door Rios 20.

Representative Results

7pa2 cellen zijn met succes ingekapseld in alginaat microbeads
Na bereiding worden uniforme en sferische alginaat microbeads met succes gegenereerd met behulp van dit protocol. De afbeeldingen in Figuur 2A hieronder tonen een voorbeeld van hoe het veranderen van een van de parameters (d.w.z. voltage) de stroming en dispersie van de alginaatdrup pels stroom verandert. Figuur 2 B toont een voorbeeld van verkregen alginaat kralen onmiddellijk na het gelatie proces.

Figure 2
Figuur 2 : Optimalisatie van de fabricagemethode. A) Foto's met wijzigingen in de spreiding van de stroom. B) helder-veld beeld dat alginaat sferische microbeads onmiddellijk na fabricage weergeeft. (C) voorbeeld van optimalisatie stap: afstemmen van geselecteerde fabricage parameters om de beoogde microbead grootte te bereiken. Geselecteerde grafieken ter illustratie van de relatie tussen elke parameter en de grootte van de resulterende microbeads (grootteverdeling van ten minste n = 100 microbeads). Merk op dat de inwendige diameter van de nozzle, de viscositeit van de uitgeworpen oplossing en de geleer-omstandigheden ook de grootte van gefabriceerde kralen kunnen beïnvloeden. Foutbalken representeren S.D. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Het beschreven protocol is flexibel en maakt de vervaardiging van verschillende groottes van alginaat gebaseerde microbeads mogelijk, variërend in samenstelling volgens de toepassing. In Figuur 2Crapporteren we de invloed van alginaat debiet, spanning en frequentie op microbead grootte met behulp van een 2% (w/v) alginaat oplossing in HEPES (pH 7,2) geëxtrudeerd door een nozzle van 300 μm.

Aangezien de reikwijdte van deze studie was om microbeads te produceren die kunnen worden ingebed in de hersenen van de rat, hebben we de fabricage parameters aangepast om een gemiddelde microbead diameter in het bereik van 500-600 μm te verkrijgen. Voor kwaliteitscontroledoeleinden werd de methode geoptimaliseerd om minimale variabiliteit te hebben over de populatie van gefabriceerde kralen (d.w.z. smalle verdeling van de grootte). Houd er rekening mee dat (1) geproduceerde kralen kunnen worden geïnjecteerd in de hersenen van de rat met behulp van een Hamilton spuit uitgerust met een 20G naald; en (2) een hersenhelft van de rat hersenen kan maximaal twee of drie kralen van deze grootte hosten.

Na optimalisatie, Encapsulating Security 7pa2 cellen in een concentratie van 1,5 x 106 cellen/ml opgehangen in een 2% (w/v) alginaat oplossing gebufferd met Hepes en gedaald in een 0,5 M calciumchloride gelering Bad leverde de gewenste microbeads. Figuur 3 Een hieronder toont Encapsulated 7PA2 cellen gelijkmatig verdeeld in microbeads na één dag in standaard celkweek omstandigheden. 7PA2 celproliferatie is getest met een MTS-assay volgens het Protocol van de fabrikant. Er was geen significant verschil tussen het gedrag van 7PA2 cellen gegroeid met of zonder alginaat over een periode van zeven dagen (Figuur 3B). Bij het inbrokkelen van ingekapselde cellen in standaard kweekomstandigheden wordt verwacht dat cellen zich blijven vermenigvuldigen gedurende de duur van het experiment, en dat kleine graden van celontsnap ping kunnen worden verwacht als resultaat, zoals gerapporteerd in andere werken28. De effecten hiervan kunnen worden verzacht door inkaping bij een kleinere celdichtheid of vermindering van de serumconcentratie waarin microbeads worden geïnfiltreerd.

Figure 3
Figuur 3 : Encapsulated 7PA2 cellen. A) helderveld beeld van ingekapselde 7PA2 cellen die zelfs de celverdeling in de alginaat microbead vertonen. Fabricage parameters werden ingesteld om ~ 150 7PA2 cellen per kraal te verkrijgen. Er werd geen significante variatie in alginaatkralen waargenomen over 7 dagen cultuur. B) er was geen waargenomen verschil tussen de totale proliferatie van 7PA2-cellen, geïnineerd met alginaat versus cellen die zonder alginaat werden geïnineerd. 7PA2 cellen groeien en migreren over het volume van de alginaat kralen; verlaging van de serumconcentratie kan worden overwogen om celgroei te vertragen. Foutbalken representeren S.D. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Alginate microbeads Encapsulating Security 7PA2 cellen zijn stabiel in de tijd
Om de grootte en vorm van verkregen alginaat microbeads te onderzoeken, werd Microscoop analyse uitgevoerd na fabricage en gelatie. De gemiddelde diameter van de met het geselecteerde protocol verkregen microbeads is 550 ± 2 μm.

Theoretisch kan het aantal cellen dat in een micro kraal van 550 μm-diameter wordt verwacht, als volgt worden berekend:

Equation 1

waarbij V = volume en r = straal. Het volume van een enkele micro kraal is V = 8,8 x 10-5 ml; Daarom is het aantal cellen per microbead op het moment van inkaping = (1,5 × 106) x (8,8 x 10-5) ≈ 130 cellen.

Experimenteel, we geteld het aantal ingekapselde cellen onmiddellijk na fabricage. Alginaat kralen werden zachtjes verstoord met behulp van de ontbinding mix en cellen werden bevlekt met trypan blauwe oplossing. Schatting van de levensvatbaarheid en telling van cellen werd uitgevoerd met behulp van een hemocytometer; verkregen resultaten toonden gemiddeld 116 ± 17 levende cellen per microbead (n = 5, gegevens niet gerapporteerd). Zoals verwacht werd een klein verschil tussen theoretische en experimentele celtelling onmiddellijk na inkaping waargenomen. Voor sommige toepassingen, en in het bijzonder om te bepalen van de hoeveelheid vrijgegeven Aβ na verloop van tijd, is het belangrijk om te voorspellen van het aantal cellen ingekapseld in elke alginaat kraal.

Interessant is dat het inkapings proces heeft geen significante invloed op de levensvatbaarheid van de cel. Resultaten worden gerapporteerd in een eerder werk, waarbij colorectale kankercellen (d.w.z. HCT-116) werden ingekapseld met een soortgelijke methode, zonder verschillen in de levensvatbaarheid van de cellen in alginaat-microbeads in vergelijking met 2D-besturingselementen20.

Voor het meten van de stabiliteit van de alginaat gebruikt in het inkapings proces, we gemeten microbead diameters over een periode van 14 dagen (n = 100). Er waren geen waargenomen veranderingen in gemiddelde diameter 14 dagen na inkaping in vergelijking met onmiddellijk na inkaping (gegevens niet gerapporteerd).

Encapsulated 7PA2 cellen vrijgeven Aβ na verloop van tijd
Geconditioneerde media geanalyseerd uit 2D-en 3D-culturen van 7PA2-cellen onthullen een constante toename van Aβ1-42 -niveaus. Cel cultuur media werd bemonsterd elke 24 h, en maximaal vier dagen, en geanalyseerd met behulp van ELISA. Uit onze gegevens blijkt dat de mate van vrijgave van Aβ1-42 van Microbeads (3D) vergelijkbaar is met die van de 2D-cultuur (Figuur 4).

Figure 4
Figuur 4 : Snelheid van Aβ1-42 secretie van 7pa2 cellen. (A) Aβ-vrijgave (% genormaliseerd na 4 dagen) van 2D-en 3D-in-vitro-modellen heeft een soortgelijk profiel. Beide modellen vertonen een constante toename van de Aβ-niveaus gedurende de periode van vier dagen en, zoals verwacht, wordt er geen gestage concentratie bereikt. B) concentratie van aβ1-42 genormaliseerd naar eerste celnummer, met vergelijkbare secretie van Aβ1-42 na verloop van tijd, ongeacht de kweekmethoden. Noch de aanwezigheid van alginaat noch het proces van inkaping (3D in vitro model) veranderen de secretie van Aβ1-42. Foutbalken representeren S.D. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Mogelijke toepassing van Encapsulated 7PA2 cellen
We rapporteren dat 7PA2 cellen die zijn ingekapseld in alginaat microbeads effectief kunnen worden gebruikt voor de aanhoudende afgifte van Aβ1-42, en daarom gebruikt om het effect van chronische Aβ-secretie in elk preklinisch model te testen. In Figuur 5 hieronder tonen we de voordelen van het gebruik van alginaat microbeads die gemakkelijk kunnen worden geïnjecteerd en zich in de hersenen van een rat bevinden. Ex vivo secties worden hier gebruikt voor illustratiedoeleinden, het vergelijken van een millimeter alginaat kraal versus gefabriceerde alginaat microbeads.

Figure 5
Figuur 5 : Microbeads gebruiken voor relevante preklinische toepassingen. Microbeads voor engraftment in de hersenen van de rat moeten klein genoeg zijn om te worden ingebed zonder het creëren van een laesie te groot om schade aan de hersen parenchym te voorkomen en nadelige invloed op de normale hersenfunctie. Afbeelding (a) toont een grootte vergelijking tussen een millimeter-geschaalde kraal en een met micrometer geschaalde kraal naast elkaar. (B) het implanteren van een millimeter geschaalde kraal in de hersenen voor in vivo doeleinden zou niet werken. Afbeelding (C) toont een micro kraal gefabriceerd met behulp van dit protocol. De maat is geschikt voor het inbrengen binnen de hippocampus van de rat zonder een nadelig effect op de normale fysiologie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

De bovenstaande afbeeldingen benadrukken het belang van het beheersen van de grootte van de microbead voor dergelijke studies. Hier tonen we het voordeel van het gebruik van microbeads van diameters onder 600 μm. Dit maakt het gebruik van minimaal invasieve injectie (bijv. Hamilton spuit) mogelijk om de locatie van geïnjecteerde kralen in de hersenen beter te regelen.

Samengevat, inkapselende 7PA2 cellen geeft controle over de grootte van microbeads, aantal ingekapselde cellen en de voorspelling van Aβ uitgescheiden uit de microbeads (bv., concentratie, release profiel). Het beheersen van de grootte van de microbeads is essentieel om twee redenen: 1) om fijnafgestelde controle over de concentratie van vrijgekomen Aβ, en 2) toe te staan om implantatie in een gecontroleerd gebied van de rat hersenen. De resultaten die hier worden verkregen beschrijven de faciele afstemming van alginaat microbeads en markeren mogelijke toepassingen voor verdere studies.

Discussion

De methode die in dit artikel wordt beschreven, is handig voor het inkapen van cellen die een smalle grootteverdeling van alginaat microbeads27bereiken. Het biedt ook het voordeel van groeicellen in een immuno-geïsoleerde omgeving17,19, die hen beschermt tegen externe stress. Bovendien, inkaping van cellen in alginaat meer nabootst fysiologische omstandigheden, met name met betrekking tot cel-naar-cel interacties en matrix stijfheid20. Deze factoren zijn allemaal van cruciaal belang voor het daaropvolgende gebruik in relevante toepassingen, zoals in vivo engraftment, waarbij potentiële immuunreacties in het omringende weefsel17worden voorkomen. Bovendien is een groot voordeel van dit protocol de gemakkelijke tuneability volgens de toepassing van de belangstelling: het is mogelijk om het protocol te wijzigen en de parameters voor de fabricage van grotere of kleinere, en zachtere of stijvere kralen te optimaliseren. De beschreven methode wordt gebruikt om kralen te fabriceren die klein genoeg zijn om te worden geïnjecteerd met minimaal invasieve methoden, en voldoende groot genoeg om een aantal cellen te hosten en een voldoende afgifte van Aβ te leveren om te resulteren in waarneembare gedrags-en pathologische effecten bij injectie in diermodellen.

Het succes van dit protocol is afhankelijk van een aantal kritieke stappen. Zorgvuldige celverwerking en optimale celculturing technieken zijn belangrijk om de levensvatbaarheid van de cellen en de functie20,28te behouden. Met behulp van standaardcultuur voorwaarden zorgt voor het behoud van de normale functie van 7PA2 cellen, zoals waargenomen. Dit maakt een soortgelijk release profiel voor Aβ1-42 van ingekapselde cellen mogelijk in vergelijking met 2D-culturen. Bovendien garandeert het protocol om optimaal te werken een lage viscositeit alginaat oplossing die betere resultaten oplevert vergeleken met een hoge viscositeit alginaat oplossing. Dit zorgt ervoor dat een homogene laminaire straal wordt geëxtrudeerd door de nozzle en een gelijkmatige verdeling van cellen binnen de matrix van de gefabriceerde kralen27. Materialen die worden gebruikt om cellen in te kapen, moeten een zeer snel gelatie mechanisme hebben, waardoor de vorm kan worden vastgehouden.

Een andere belangrijke stap in dit protocol is het hanteren van gefabriceerde microbeads na gelatie. Hier tonen we het ophalen van microbeads door gebruik te maken van een grote diafragma plastic pipet om de kralen over te brengen. Als alternatief kan het gieten van de calciumchloride-oplossing met de microbeads in een mesh-filter worden gebruikt voor het ophalen van kraal. Een grote serologische Pipet (5, 10 of 25 mL) kan worden gebruikt om de microbeads op te maken en vervolgens door het gaas filter te spoelen in plaats van te gieten. Het voordeel hiervan is een hoger vertrouwen in de steriliteit van de procedure in vergelijking met gieten. Echter, van de beperkingen is dat sommige kralen kunnen worden vervormd als ze worden gecomprimeerd door de pipet, naast het riskeren van een lagere opbrengst als een groot deel van de microbeads niet worden gered.

Deze aanpak is gebruikt om verschillende cellijnen in te kapen om verschillende ziekten te modelleren en te bestuderen (bijv. het vrijkomen van insuline uit ingekapselde alvleesklier eilandje). De nieuwigheid van onze aanpak is de engraftment van de microbeads gegenereerd met behulp van dit protocol als een nuttige methode bij het modelleren van belangrijke aspecten van de ziekte van Alzheimer in vivo. Wanneer het release Profiel van Aβ uit ingekapselde cellen (Figuur 4) wordt vergeleken met de niveaus van Aβ die worden gegenereerd door een bolusinjectie (zoals gerapporteerd in andere onderzoeken3,26), kan een meer chronische en aanhoudende afgifte van Aβ worden Verwacht. Figuur 6 illustreert de voorspelde tendens die kan worden bereikt. Het gebruik van dit systeem voor in vivo modellering is relevanter voor de manier waarop de ziekte vordert en kan nuttiger zijn bij het opsporen en ontwikkelen van geneesmiddelen.

Figure 6
Figuur 6 : Voorspelde afgifteprofiel van Aβ1-42 uit Encapsulated 7pa2 cellen in vergelijking met een bolusinjectie. Het profiel van de Aβ-release van geënt 7pa2-bevattende microbeads maakt het testen mogelijk van de effecten van chronische en aanhoudende Aβ in een diermodel dat relevant is voor AD. Omgekeerd zou een bolusinjectie een piek in Aβ-spiegels in een korte periode creëren, gevolgd door een snelle klaring van Aβ uit de hersenen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs willen de heer kajen suresparan, Dr. Jonathan wubetu, de heer Dominik Grudzinski, Miss Chen Zhao en Dr. Thierry pilot bedanken voor hun hulp bij het optimaliseren van alginaat microbead fabricage, celkweek en Aβ-detectie, en nuttige wetenschappelijke Discussies.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
µManager software Vale Lab, UCSF, USA v.1.46
0.22 um PES filter Merck, UK SLGP033RS
15mm Netwell insert 74 um mesh filter Constar, usa #3477
Alginic acid sodium salt from brown algae Sigma-Aldrich,uk A0682
Calcium chloride Sigma-Aldrich,uk C1016
CellTiter96  AQueous One Solution cell proliferation assay Promega, USA G3580
Encapsulator Inotech IE-50 serial no. 05.002.01-2005
HEPES Sigma-Aldrich,uk H4024
Hu Aβ 1-42 ELISA ThermoFisher, UK KHB3441
ImageJ software ImageJ v1.49p
Inverted light microscope Olympus CKX41
Leica microscope Leica microsystems, UK DMI6000B
Neo sCMOS Camera Ander, UK 5.5
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich,uk D1408
Sodium chloride Sigma-Aldrich,uk 433209
Trispdium citrate dihydrate Sigma-Aldrich,uk W302600-K
Trypsin-EDTA solution Sigma-Aldrich,uk T4049

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hardy, J. A., Higgins, G. A. Alzheimer's disease: the amyloid cascade hypothesis. Science. 256, 184-185 (1992).
  2. Karthick, C., et al. Time-dependent effect of oligomeric amyloid-β (1-42)-induced hippocampal neurodegeneration in rat model of Alzheimer's disease. Neurological Research. 41 (2), 139-150 (2018).
  3. Watremez, W., et al. Stabilized Low-n Amyloid-β Oligomers Induce Robust Novel Object Recognition Deficits Associated with Inflammatory, Synaptic, and GABAergic Dysfunction in the Rat. Journal of Alzheimer's Disease. 62 (1), 213-226 (2018).
  4. Brouillette, J., et al. Neurotoxicity and memory deficits induced by soluble low-molecular-weight amyloid-β1-42 oligomers are revealed in vivo by using a novel animal model. Journal of Neurosciences. 32 (23), 7852-7861 (2012).
  5. Solana, C., Tarazona, R., Solana, R. Immunosenescence of Natural Killer Cells, Inflammation, and Alzheimer's Disease. International Journal of Alzheimer's Disease. , 3128758 (2018).
  6. Sturchler-Pierrat, C., et al. Two amyloid precursor protein transgenic mouse models with Alzheimer disease-like pathology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (24), 13287-13292 (1997).
  7. Tomiyama, T., et al. A mouse model of amyloid beta oligomers: their contribution to synaptic alteration, abnormal tau phosphorylation, glial activation, and neuronal loss in vivo. Journal of Neurosciences. 30 (14), 4845-4856 (2010).
  8. Saito, T., et al. Single App knock-in mouse models of Alzheimer's disease. Nature Neurosciences. 17 (5), 661-663 (2014).
  9. Oddo, S., et al. Triple-Transgenic Model of Alzheimer's Disease with Plaques and Tangles: Intracellular A and Synaptic Dysfunction. Neuron. 39 (3), 409-421 (2003).
  10. Leon, W. C., et al. A Novel Transgenic Rat Model with a Full Alzheimer's-Like Amyloid Pathology Displays Pre-Plaque Intracellular Amyloid-β-Associated Cognitive Impairment. Journal of Alzheimer's Disease. 20 (1), 113-126 (2010).
  11. Prince, M., et al. Dementia UK: Second Edition - Overview. Alzheimer's Society. , 61 (2007).
  12. Cavanaugh, S. E., Pippin, J. J., Barnard, N. D. Animal models of Alzheimer disease: historical pitfalls and a path forward. Alternatives to animal experimentation. 31 (3), 279-302 (2014).
  13. Oakley, H., et al. Intraneuronal β-Amyloid Aggregates, Neurodegeneration, and Neuron Loss in Transgenic Mice with Five Familial Alzheimer's Disease Mutations: Potential Factors in Amyloid Plaque Formation. The Journal of Neuroscience. 26 (40), 10129-10140 (2006).
  14. Forny-Germano, L., et al. Alzheimer's Disease-Like Pathology Induced by Amyloid-β Oligomers in Nonhuman Primates. Journal of Neuroscience. 34 (41), 13629-13643 (2014).
  15. Masliah, E., et al. Altered expression of synaptic proteins occurs early during progression of Alzheimer's disease. Neurology. 56 (1), 127-129 (2001).
  16. Lepelletier, F. X., Mann, D. M. A., Robinson, A. C., Pinteaux, E., Boutin, H. Early changes in extracellular matrix in Alzheimer's disease. Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (2), 167-182 (2017).
  17. Calafiore, R., Basta, G. Clinical application of microencapsulated islets: Actual prospectives on progress and challenges. Advanced Drug Delivery Reviews. 67-68, 84-92 (2014).
  18. Lim, F., Sun, A. M. Microencapsulated islets as bioartificial endocrine pancreas. Science. 210 (4472), 908-910 (1980).
  19. Tran, N. M., et al. Alginate hydrogel protects encapsulated hepatic HuH-7 cells against hepatitis C virus and other viral infections. PLoS One. 9 (10), 109969 (2014).
  20. Rios de la Rosa, J. M., Wubetu, J., Tirelli, N., Tirella, A. Colorectal tumor 3D in vitro models: advantages of biofabrication for the recapitulation of early stages of tumour development. Biomedical Physics & Engineering Express. 4 (4), 045010 (2018).
  21. Tirella, A., Orsini, A., Vozzi, G., Ahluwalia, A. A phase diagram for microfabrication of geometrically controlled hydrogel scaffolds. Biofabrication. 1 (4), 045002 (2009).
  22. Smalley, K. S. M., Lioni, M., Herlyn, M. Life ins't flat: Taking cancer biology to the next dimension. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 42 (8-9), 242-247 (2006).
  23. Podlisny, M. B., et al. Aggregation of secreted amyloid beta-protein into sodium dodecyl sulfate-stable oligomers in cell culture. Journal of Biological Chemistry. 270 (16), 9564-9570 (1995).
  24. Portelius, E., et al. Mass spectrometric characterization of amyloid-β species in the 7PA2 cell model of Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 33 (1), 85-93 (2013).
  25. Welzel, A. T., et al. Secreted amyloid β-proteins in a cell culture model include N-terminally extended peptides that impair synaptic plasticity. Biochemistry. 53 (24), 3908-3921 (2014).
  26. O'Hare, E., et al. Orally bioavailable small molecule drug protects memory in Alzheimer's disease models. Neurobiology of Aging. 34 (4), 1116-1125 (2013).
  27. Nedović, V., Willaert, R. Fundamentals of Cell Immobilisation Biotechnology. Methods and Technologies for Cell Immobilisation/Encapsulation. , Focus on Biotechnology book series, Springer Link (FOBI, volume 8A) 185-204 (2004).
  28. Omer, A., et al. Long-term Normoglycemia in Rats Receiving Transplants with Encapsulated Islets. Transplantation. 79 (1), 52-58 (2005).

Tags

Biologie probleem 149 de ziekte van Alzheimer amyloid Aβ hydrogels alginaat inkaping 3D in vitro modellen gecontroleerde afgifte
Vervaardiging van amyloid-β-afscheidende alginaat Microbeads voor gebruik bij de modellering van de ziekte van Alzheimer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Almari, B., Brough, D., Harte, M.,… More

Almari, B., Brough, D., Harte, M., Tirella, A. Fabrication of Amyloid-β-Secreting Alginate Microbeads for Use in Modelling Alzheimer's Disease. J. Vis. Exp. (149), e59597, doi:10.3791/59597 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter