Proteinbindende Mikroarray -Experimente (PBM) in Kombination mit biochemischen Assays verknüpfen die Bindungs- und katalytischen Eigenschaften von DNA-Primase, einem Enzym, das RNA-Primer auf Vorlagen-DNA synthetisiert. Diese Methode, die als High-Throughput Primase Profiling (HTPP) bezeichnet wird, kann verwendet werden, um DNA-bindende Muster einer Vielzahl von Enzymen zu offenbaren.
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Methodenartikel
DNA-Sequenzerkennung durch DNA-Primase mit High-Throughput Primase Profiling
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
DNA-Primase synthetisiert kurze RNA-Primer, die die DNA-Synthese von Okazaki-Fragmenten auf dem laggierenden Strang durch DNA-Polymerase während der DNA-Replikation initiieren. Die Bindung von prokaryotischen DnaG-ähnlichen Primasen an die DNA erfolgt in einer bestimmten Trinukleotid-Erkennungssequenz. Es ist ein entscheidender Schritt bei der Bildung von Okazaki-Fragmenten. Herkömmliche biochemische Werkzeuge, die zur Bestimmung der DNA-Erkennungssequenz von DNA-Primase verwendet werden, liefern nur begrenzte Informationen. Anhand eines mikroarraybasierten Bindungstests mit hohem Durchsatz und aufeinander folgenden biochemischen Analysen wurde gezeigt, dass 1) der spezifische Bindungskontext (flankierende Sequenzen der Erkennungsstelle) die Bindungsfestigkeit der DNA-Primase an ihre Schablone beeinflusst. DNA und 2) eine stärkere Bindung von Primase an die DNA ergibt längere RNA-Primer, was auf eine höhere Prozessivität des Enzyms hindeutet. Diese Methode kombiniert PBM und Primase Aktivität Assay und wird als High-Throughput Primase Profiling (HTPP) bezeichnet, und es ermöglicht die Charakterisierung der spezifischen Sequenzerkennung durch DNA-Primase in beispielloser Zeit und Skalierbarkeit.
Einleitung
HTPP nutzt die DNA-bindende Mikroarray-Technologie in Kombination mit biochemischer Analyse (Abbildung 1), um spezifische Merkmale von DNA-Vorlagen, die die enzymatische Aktivität von DNA-Primase beeinflussen, statistisch zu identifizieren. Daher bietet HTPP eine technologische Plattform, die einen Wissenssprung auf diesem Gebiet erleichtert. Die klassischen Werkzeuge, die verwendet werden, um Primase-Erkennungs-Sites zu bestimmen, haben nicht die Fähigkeit, eine riesige Datenmenge zu liefern, während HTPP dies tut.
PBM ist eine Technik, die routinemäßig verwendet wird, um die Bindungspräferenzen von Transkript....
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Protokoll
1. Design von Mikroarray
HINWEIS: DNA-Sonden stellen benutzerdefinierte 36-Nukleotid-Sequenzen dar, die aus der Erkennungsstelle für T7 DNA primase (GTC) bestehen, die sich zwischen zwei variablen Flankenbereichen befindet, gefolgt von einer konstanten 24-Nukleotid-Sequenz, die an einen Glasschlitten gebunden ist3. Wir verwendeten ein 4 x 180.000 Mikroarray-Format, das es ermöglichte, jede DNA-Sequenz in sechs Replikationen zu erkennen, die zufällig auf der Folie verteilt wurden.
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Entwurf einer DNA-Bibliothek für Primasen mit bekannten Erkennungssequenzen
- Stellen Sie sicher, dass ....
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Ergebnisse
Dieser technologische Fortschritt für die Kartierung der Primase-Bindungsstellen ermöglicht die Erlangung von DNA-Bindungseigenschaften, die mit klassischen Werkzeugen schwer, wenn nicht gar unmöglich zu beobachten sind. Noch wichtiger ist, dass HTPP die Überprüfung des traditionellen Verständnisses von Primase-Bindungsstellen ermöglicht. Insbesondere zeigt HTPP neben bekannten 5'-GTC-3'-Erkennungssequenzen verbindliche Spezifitäten auf, was zu Veränderungen der funktionellen Aktivitäten .......
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Diskussion
Die PBM-Methode wurde weit verbreitet, um bindungseigenschaften von Transkriptionsfaktoren zu untersuchen und kann auch auf DNA-Verarbeitungsenzyme wie DNA-Primase angewendet werden, die an DNA mit geringer Affinität binden. Es sind jedoch bestimmte Änderungen der Versuchsverfahren erforderlich. Das Mikroarray-Experiment umfasst mehrere Schritte: Entwurf der DNA-Bibliothek, Vorbereitung des Chips, Bindung des Proteinziels, fluoreszierende Kennzeichnung und Scannen. Milde Waschschritte sind entscheidend, da die langen Was.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.
Danksagungen
Diese Forschung wurde von der ISRAEL SCIENCE FOUNDATION (Zuschuss Nr. 1023/18) unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 40 % Acrylamid-Bisacrylamid (19:1) Lösung | Merck | 1006401000 | |
| 95 % Formamid | Sigma-Aldrich | F9037-100ML | |
| Alexa 488-konjugierter Anti-His-Antikörper | Qiagen | 35310 | |
| Ammonuiumpersulfat (APS) | Sigma-Aldrich | A3678-100G | |
| ATP, [α-32P] – 3000 Ci/mmol | Perkin Elmer | ||
| Borsäure, granuliert | Glentham Life Sciences | GE4425 | |
| Rinderserumalbumin (BSA) | Roche | 10735094001 | |
| Bromphenolblau | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| Coplin Glas | |||
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D0632-25G | |
| DNA Microarray | Agilent | 4x180K (AMADID #78366) https://www.agilent.com | |
| Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) | Acros Organics | AC118430010 | |
| Fujifilm FLA-5100 Phosphorimager | FUJIFILM Life Science | ||
| Glas-Diergestell | ThermoScientific | 12869995 | Bei Verwendung mehrerer Objektträger |
| Laborrotator | Thermo Scientific | 88880025 | |
| Magnesiumchlorid | Sigma-Aldrich | 63064-500G | |
| Microarray-Hybridisierungskammer | Agilent | G2534A | https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2534-90004_HybridizationChamber_User.pdf |
| Microarray-Scanner (GenePix 4400A) | Molecular Devices | ||
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| Kaliumglutamat | Alfa Aesar | A172232 | |
| Ribonukleotid-Lösungsmischung (rNTPs) | New England BioLabs | N0466S | |
| Lachshoden DNA | Sigma-Aldrich | D1626-1G | |
| Magermilchpulver | Sigma-Aldrich | 70166-500G | |
| Färbeschale | Thermo Scientific | ||
| Tetramethylethylendiamin (TEMED) | Bio-Rad | 1610800 | |
| Trisbase (2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propandiol) | Sigma-Aldrich | 93362-500G | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | |
| Harnstoff | Sigma-Aldrich | U6504-1KG | |
| Xylolcyanol | Alfa Aesar | B21530 |
Referenzen
- Berger, M. F., Bulyk, M. L. Protein binding microarrays (PBMs) for rapid, high-throughput characterization of the sequence specificities of DNA binding proteins. Methods in Molecular Biology. 338, 245-260 (2006).
- Berger, M. F., Bulyk, M. L.
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Nachdrucke und Genehmigungen
