Summary
CRISPR-Cas9 teknik ger en effektiv metod för att exakt redigera däggdjur arvsmassan i någon celltyp och representerar ett nytt sätt att utföra genomomfattande genetiska skärmar. Ett detaljerat protokoll som diskuterar de steg som krävs för lyckad prestanda av poolade genomhela CRISPR-Cas9 skärmar finns här.
Abstract
Genom redigering med hjälp av CRISPR-CAS-systemet har mycket avancerat förmågan att exakt redigera arvsmassan hos olika organismer. I samband med däggdjursceller utgör denna teknik ett nytt sätt att utföra genetiska skärmar av genomomfattande form för funktionella genomik-studier. Bibliotek av guide RNAs (sgRNA) som riktar sig till alla öppna läsramar tillåter den facile generationen av tusentals genetiska störningar i en enda pool av celler som kan screenas för specifika fenotyper att implikera genfunktion och cellulära processer i en opartisk och systematisk sätt. CRISPR-CAS skärmar ger forskarna en enkel, effektiv och billig metod för att avslöja den genetiska ritningar för cellulära fenotyper. Dessutom kan differentiell analys av skärmar som utförs i olika cellinjer och från olika cancertyper identifiera gener som är kontextuellt viktiga i tumörceller, avslöjar potentiella mål för specifika cancerbehandlingar. Att utföra genomomfattande skärmar i mänskliga celler kan vara skrämmande, eftersom detta innebär hantering av tiotals miljoner celler och kräver analys av stora mängder data. Detaljerna för dessa skärmar, till exempel cellinskarakterisering, CRISPR-biblioteksöverväganden och förståelse av CRISPR-teknikens begränsningar och möjligheter under analys, förbises ofta. Här finns ett detaljerat protokoll för lyckad prestanda av poolade genomhela CRISPR-Cas9 baserade skärmar.
Introduction
CRISPR-CAS, kort för grupperade regelbundet interfördelade korta palindrom repetitioner och CRISPR-associerade Nuclease, består av ett enda nukleasprotein (t. ex., Cas9) i komplex med en syntetisk guide RNA (sgrna). Detta ribonukleoprotein Complex riktar sig till Cas9 enzym för att inducera dubbelsträngade DNA-brott vid en specifik genomisk Locus1. Dubbel-strandsatta raster kan repareras via homologi riktad reparation (HDR) eller, mer allmänt, genom icke-homolog sammanfogning (nhej), en felbenägna reparationsmekanism som resulterar i införande och/eller borttagningar (indels) som ofta stör genfunktion 1. den effektivitet och enkelhet CRISPR möjliggör en tidigare ouppnåelig nivå av genomisk inriktning som vida överträffar tidigare genom redigering teknik [i.e., zink finger nukleaser (ZNF) eller transkription Activator-liknande effektor nukleaser ( TALENS), som båda lider av ökad design komplexitet, lägre transfektion effektivitet, och begränsningar i multiplex genredigering2].
Den grundläggande forskningen tillämpning av CRISPR Single-guide RNA-baserad genom redigering har gjort det möjligt för forskare att effektivt och billigt förhöra funktionerna i enskilda gener och topologi av genetiska interaktioner nätverk. Förmågan att utföra funktionella genom-wide skärmar har förbättrats avsevärt genom användning av CRISPR-CAS-systemet, särskilt jämfört med tidigare genetiska störningar teknik såsom RNA-interferens (RNAi) och Gene trap mutagenes. I synnerhet lider RNAi av höga off-Target effekter och ofullständig knockdown, vilket resulterar i lägre känslighet och specificitet jämfört med CRISPR3,4,5, medan gen fällor metoder är endast möjligt i haploida celler för förlust av funktion skärmar, begränsa omfattningen av cellmodeller som kan förhörs6. CRISPR förmåga att generera fullständig Gene Knock-Out ger ett mer biologiskt robust system för att förhöra muterade fenotyper, med låg ljudnivå, minimal off-mål effekter och konsekvent aktivitet över reagenser5. CRISPR-Cas9 sgrna-bibliotek som riktar sig till hela människans arvsmassa är nu allmänt tillgängliga, vilket möjliggör samtidig generering av tusentals genknock-outs i ett enda experiment3,7,8,9 .
Vi har utvecklat unika CRISPR-Cas9 genom-omfattande sgRNA lentivirala bibliotek som kallas Toronto knock-out (TKO) bibliotek (tillgängliga via Addgene) som är kompakta och sekvens-optimerade för att underlätta högupplöst funktionell Genomics skärmar. Det senaste biblioteket, TKOv3, mål ~ 18 000 Human protein-kodning gener med 71 090 guider optimerad för redigering effektivitet med hjälp av empiriska data10. Dessutom är TKOv3 tillgänglig som en en-komponent bibliotek (LCV2:: TKOv3, Addgene ID #90294) uttrycker Cas9 och sgRNAs på en enda vektor, att lindra behovet av att generera stabila Cas9-uttrycker celler, vilket möjliggör genombrett knock-out över ett brett spektrum av däggdjurscell typer. TKOv3 finns även i en vektor utan Cas9 (pLCKO2:: TKOv3, Addgene ID # 125517) och kan utnyttjas i celler som uttrycker Cas911.
En genombred, CRISPR-Cas9-redigerad cellpopulation kan exponeras för olika tillväxtförhållanden, med överflödet av sgRNAs över tid som kvantifierats genom nästa generations sekvensering, vilket ger en avläsning för att bedöma avhopp eller berikning av celler med spårbar genetisk Störningar. CRISPR knock-out bibliotek kan utnyttjas för att identifiera gener som vid störning, orsaka cellulära Fitness defekter, måttlig läkemedels känslighet (t. ex. känsliga eller resistenta gener), reglera proteinuttryck (t. ex., reporter), eller krävs för en viss Pathway funktion och cellulära tillstånd12,13,14. Till exempel, differentiell Fitness skärmar i en cancer cell linje kan identifiera både utarmning eller minskning av onkogener och berikning eller en ökning av tumör dämpning gener3,14,15. På samma sätt, med hjälp av mellanliggande doser av terapeutiska läkemedel kan avslöja både läkemedelsresistens och sensibilisering gener16,17.
Tillhandahålls här är ett detaljerat screening protokoll för genomskala CRISPR-Cas9 förlust-av-funktion screening med Toronto knock-out bibliotek (TKOv1 eller v3) i däggdjursceller från bibliotek generation, screening prestanda till dataanalys. Även om detta protokoll har optimerats för screening med Toronto knock-out bibliotek, det kan tillämpas och bli skalbar till alla CRISPR sgRNA poolade bibliotek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De experiment som beskrivs nedan bör följa institutets miljöskyddsbyråns riktlinjer.
1. poolade CRISPR sgRNA lentiviral bibliotek plasmid amplifiering
- Späd det färdigtillverkade CRISPR sgRNA plasmid DNA-biblioteket till 50 ng/μL i TE (t. ex. TKOv3).
- Electroporate biblioteket med hjälp av elektrokompetenta celler. Ställ in totalt fyra elektroportionsreaktioner enligt beskrivningen nedan.
- Tillsätt 2 μL 50 ng/μL TKO-bibliotek till 25 μL upptinade elektrokompetenta celler till förkylda cuvetter (1,0 mm) på isen.
- Elektroporate med optimala inställningar som föreslås av tillverkarens protokoll. Inom 10 s av pulsen, tillsätt 975 μL återvinnings medium (eller SOC-medium) till Cuvette.
- Överför elektroporterade celler till ett odlings rör och tillsätt 1 mL återvinnings medium. Inkubera rören i en skakande inkubator vid 250 rpm i 1 h vid 37 ° c.
- Ställ in en utspädnings platta för att titer biblioteket och beräkna omvandlings effektivitet.
- Pool alla 8 mL av återvunna celler och blanda väl. Överför 10 μL av de poolade cellerna till 990 μL återvinnings medium för en 800-faldig utspädning och blanda väl.
- Platta 20 μL av spädningen till en förvärmda 10 cm LB + carbenicillin (100 μg/L) agarplatta. Detta resulterar i en 40 000-faldig utspädning av transformanter som kommer att användas för att beräkna omvandlingen effektivitet.
- Platta 400 μL av återvunna celler på varje platta över totalt 20 förvärmda 15 cm LB + carbenicillin agar plattor. Inkubera plattorna i 14 – 16 h vid 30 ° c.
Anmärkning: tillväxt vid denna lägre temperatur minimerar rekombinationen mellan långa-terminala upprepningar (LTR)18. - Räkna antalet kolonier på 40 000-faldig utspädnings platta (steg 1.3.2) för att beräkna omvandlings effektiviteten. Multiplicera antalet kolonier räknat med 40 000 för att få det totala antalet kolonier på alla tallrikar. Fortsätt om det totala antalet kolonier representerar en biblioteks täckning motsvarande minst 200 x kolonier per sgRNA (mest optimala är 500-1000X).
- Till exempel är minimal Colony Number för TKOv3 library (71 090 sgRNA) 1,4 x 107, vilket motsvarar 200x kolonier per sgrna. Om kolonin framställningen är otillräcklig, öka antalet elektroporations i steg 1,2 baserat på antalet kolonier på utspädnings plattan för att uppnå minsta biblioteks täckning.
- Skörda kolonierna enligt beskrivningen nedan
- Till varje 15 cm platta, tillsätt 7 mL LB + carbenicillin (100 μg/L) medium, sedan skrapa kolonierna med en cell spridare. Med en 10 mL pipett överför du de skrapade cellerna till en steril 1 L konisk kolv eller flaska.
- Skölj plattan igen med 5 mL LB + carbenicillin medium och överför lösningen till flaskan.
- Upprepa för alla plattor till poolceller från 20 plattor till en steril flaska.
- Blanda insamlade celler med en röra bar för 1 h vid rumstemperatur (RT) för att bryta upp cell klumpar. Överför celler till förvägda centrifugflaskor och centrifugera vid 7 000 x g till pellets bakterier och kassera sedan media.
- Väg den våta cellpelleten och subtrahera vikten av Centrifugera flaskan för att bestämma den slutliga vikten av den våta pelleten. Purify plasmid DNA med en Maxi-eller Mega-skala plasmid rening kit beroende på mängden av bakteriell pellet varje kolumn kan bearbeta.
2. storskaliga CRISPR sgRNA bibliotek lentivirus produktion
Anmärkning: alla steg i detta avsnitt av protokollet utförs i en BSL2 + anläggning i en klass II, typ a2 biosäkerhetsskåp.
- Beräkna det antal 15 cm plåtar som krävs för virus produktion baserat på uppskattningen att 18 mL virus normalt skördas från 1 15 cm plåt.
- Förbered cellerna för transfektion genom att sådd HEK-293T förpacknings celler i låg-antibiotikum tillväxtmedia (DMEM + 10% FBS + tillval: 0.1 x penna/STREP) vid 8 x 106 celler per 15 cm tallrik i 20 ml media. Inkubera celler över natten vid 37 ° c, 5% CO2. Se till att de pläterade cellerna är 70%-80% konfluenta och jämnt fördelade vid tidpunkten för transfektion.
- Nästa dag, Förbered tre transfektion plasmider blandningen som beskrivs i tabell 1 för 15 cm plattor. Beräkna mängden plasmid behövs för en transfektion och göra en blandning av plasmider för antalet plattor, plus en som skall transfected.
- Bered ett lipidbaserat transfektionsreagens för varje transfektion som beskrivs i tabell 2. Alikvot reducerade serum mediet till enskilda 1,5 mL mikrocentrifugrör för det antal plattor som ska transfected. Tillsätt transfektionsreagens, blanda försiktigt och inkubera i 5 minuter vid RT.
- Efter 5 min inkubation, tillsätt mängden DNA som krävs för en transfektion till transfektionsreagens för ett 3:1-förhållande av transfektionsreagens-till-μg DNA-komplex. Blanda försiktigt och inkubera i 30 minuter vid RT.
Anmärkning: efterföljande transfektioner kan förberedas i uppsättningar om fem eller mindre, med 5 minuters mellanrum för att optimera för tid och undvika över-inkubation. - Efter 30 min av inkubering, noggrant överföra varje transfektion blandning till varje platta av förpacknings celler. Tillsätt hela blandningen med hjälp av en 1 ml pipettspets droppvis i en cirkulär, sicksackrörelse utan att störa cellens monolayer. Inkubera cellerna vid 37 ° c i 18 h vid 5% CO2.
- Förbered viral Harvest media: 500 mL av DMEM medium + 32 mL BSA-lager (20 g/100 mL, upplöst i DMEM, filtersteriliserat med 0,22 μm filter) + 5 mL 100x penna/STREP.
- Efter 18 h, ta bort media (Använd korrekt hantering av lentivirus avfall såsom inkubation i 1% natriumhypoklorit för 30 min före bortskaffande). Ersätt försiktigt med 18 mL viral Harvest media till varje tallrik. Inkubera cellerna vid 37 ° c i 18 h vid 5% CO2.
- Efter 24 h, kontrollera förpacknings celler för onormal och smält morfologi som en indikation på god virus produktion. Sedan, skörda lentivirus genom att samla alla supernatanten och överföra till en steril konisk centrifug röret.
- Snurra mediet som innehåller virus på 300 x g i 5 min och pellet förpacknings cellerna. Alikvot supernatanten i ett sterilt Polypropenrör utan att störa pelleten.
- Förvara viruset vid 4 ° c under kortare perioder (mindre än 1 vecka) eller omedelbart vid-80 ° c för långtidsförvaring. Aliquot storskalig virus Preps till engångsvolymer för långtidslagring för att undvika frysning/upptinning.
3. cellinskarakterisering för screening
- Välj önskad cellrad.
- Mät och anteckna den ungefärliga fördubblings tiden för cellerna.
- Bestäm optimal cellplätering densitet för odling celler varje 3-4 cell dubbleringar i en vävnad kultur fartyg val (t. ex., 15 cm vävnad kultur plattor).
- Bestäm puromycin koncentrationen att använda i önskad cell linje för val av TKO bibliotek som innehåller puromycin resistens markör enligt följande:
- Frö celler i en 12 väl tallrik vid densiteten som krävs för att nå sammanflödet efter 72 h, sedan Inkubera över natten (37 ° c, 5% CO2).
- Nästa dag, Byt till ett medium som innehåller ett utspädnings intervall av puromycinkoncentrationer från 0 μg/mL till 10 μg/mL, i steg om 0,5 μg/mL. Inkubera cellerna för 48 h.
- Efter 48 h, mäta cellernas lönsamhet genom cellräkning eller alamarBlue färgning.
- Bestäm den lägsta koncentrationen som dödar 100% av cellerna i 48 h. Använd denna koncentration för att välja för CRISPR bibliotek sensorik cellpopulationer i steg 4,6 och 5.2.6.
Anmärkning: för cellinjer med längre fördubblings tider, längre inkuberingar med puromycin kan tolereras. I dessa situationer, bestämma Kill kurvan för inkubationstiden krävs för < 3 cell doublings. Minimera tiden för val för att undvika avsläppning av viktiga gener innan screening påbörjas.
- Kontrollera cellerna för känslighet för hexadimetrin bromid (upp till 8 μg/mL) genom att utföra en dosresponskurva i samma metod som används för att mäta puromycinkänslighet (steg 3,2). Om toxicitet observeras med < 8 μg/mL hexadimetrin bromid, Använd inte.
4. funktionell titrering av det poolade CRISPR lentivirus biblioteket för bestämning av MOI
- Tina en ny alikvot av poolade CRISPR sgRNA bibliotek lentivirus (t. ex. LCV2:: TKOv3) och håll på is.
- Designa en serie virus volymer för att testa mellan intervallet 0 – 2 mL (dvs. 0 mL, 0,25 mL, 0,5 mL, 1 mL och 2 mL).
- Skörd målceller och frö celler i 15 cm plattor vid densiteten som krävs för att nå sammanflödet i 72 h.
- Förbered dubbla plåtar för varje virus volym som ska testas. Tillsätt celler, virus, hexadimetrin bromid (8 μg/mL) och media till en slutlig volym på 20 mL. Blanda plattorna grundligt, sitt plattor nivå i inkubator och inkubera för 24 h (37 ° c, 5% CO2).
- Efter 24 h, ta bort virus som innehåller Media och kassera (Använd biosäkerhetsåtgärder för hantering av lentivirus avfall). Alternativt, försiktigt tvätta plattan med varm PBS att ta bort främmande virus.
- För varje virus tillstånd, Ersätt med 20 mL media som innehåller puromycin med den koncentration som bestäms för att döda celler i avsnitt 3, till en replikat platta. Till den andra plattan, tillsätt 20 mL färskt material utan puromycin. Inkubera för 48 h (37 ° c, 5% CO2).
- Efter 48 h, kontrollera att alla oinfekterade celler (0 mL virus tillstånd) som behandlats med puromycin är döda. Skörda alla plattor individuellt och skingra celler genom upprepad skonsam pipettering.
- Räkna celler från alla plattor och beräkna MOI för varje virus volym genom att jämföra cellantal med puromycin urval till cell räknas utan puromycin (dvs., +/-puromycin).
- Graph resultat för att bestämma viruset volym som leder till 30%-40% cellöverlevnad med puromycin urval kontra utan puromycin. Använd denna virus volym för att uppnå en MOI på 0,3-0,4 under skärmen under samma vävnads odlingsförhållanden.
5. primär skärm infektion, urval och cell passaging
- Välj det CRISPR sgRNA-bibliotek som ska underhållas under hela skärmen (rekommenderas minst 200 gånger).
- Baserat på bibliotekets täckning, bestämma antalet celler som krävs för att bibehålla denna täckning per sgRNA och antalet celler som krävs för infektion i MOI 0,3 (tabell 3).
- Bestäm hur många plattor som krävs för att ställa in infektionen (tabell 4).
- Infektera cellerna med CRISPR-bibliotek
- Skörda celler och frö det erforderliga cellnumret till varje 15 cm plåt.
- Tillsätt hexadimetrin bromid (8 μg/mL) till alla plattor.
- Tillsätt viruset på den volym som krävs för MOI 0,3 till screening och kontroll 2 plattor. För kontroll 1 ska du inte lägga till virus och ersätta den volymen med media.
- Blanda plattorna noggrant genom att luta. Placera plattorna i inkubator och se till att de är jämna.
Obs: batch infektioner kan göras genom att kombinera en Master Mix av virus, media, och hexadimethrine bromid till celler i suspension före plätering. - Ta bort media och Ersätt med färska medier som innehåller puromycin vid den koncentration som bestäms i steg 3.2.4 till screening och kontroll 1 plattor 24 h efter virusinfektion. Tillsätt färska medier utan puromycin till kontroll 2 plattan. Inkubera celler för 48 h (37 ° c, 5% CO2).
- 48 h efter puromycin dessutom, se till att alla oinfekterade celler är döda (kontroll 1) för att bekräfta puromycin aktivitet, sedan skörda de infekterade cellerna.
- Skörd infekterade cellpopulation och cell passaging
- Skörda de puromycin-valda cellerna från alla screening plattor i en steril behållare. Samla in cellerna från varje kontroll platta separat. Dispersera celler genom skonsam upprepad pipettering.
- Räkna celler från poolade screening-celler, kontroll 1 och kontroll 2 separat och beräkna antalet celler per 1 mL.
- Beräkna MOI och vik täckning uppnås enligt följande:
- Samla in tre replikat av cell pellets från de poolade cellerna vid den valda biblioteks täckningen för genomisk DNA-extraktion. Centrifugera cellerna vid 500 x g i 5 min. Tvätta med PBS. Märk rören och frys-torka cell pellets vid-80 ° c (dessa är t0 referensprover).
- Dela upp poolen med infekterade celler i tre replikgrupper (t. ex. replikera A, replikera B, replikera C), samtidigt som biblioteks täckningen bibehålls inom varje replikat. Frö celler vid samma sådddensitet som normalt skulle användas när de expanderade. Använd samma antal celler för varje replikat platta och samma totala antalet celler mellan replikat.
- Fortsätt att passage celler och skörda tre replikat av cell pellets från varje replikat av poolade-infekterade celler som ovan, var 3 – 8 dagar beroende på cellinje, för upp till 15 – 20 cell doublings. Vid varje passage, skörda cellerna från alla plattor i varje replikat grupp med varandra (dvs, alla celler från replikera en tallrikar blandas igen tillsammans, alla celler från replikat B-plattor blandas igen tillsammans, etc.).
- Märk varje pellet med en tid (T) och replikera beteckningen. Detta motsvarar antalet dagar efter t0 pelleten samlas in (t. ex., T3_A, T3_B, T3_C, etc).
- För den negativa urvals drogen skärmar, tillåta celler att återhämta sig för minst en passage efter t0 före behandling. Vid T3 eller T6, dela cellerna från varje replikat grupp (A, B, C) till läkemedelsbehandling och kontrollpopulationer, med samma sådd densitet som används i steg 5.3.5.
- Separat pool antalet celler som krävs för biblioteks täckning för varje replikat i gruppen för läkemedelsbehandling. Tillsätt läkemedlet vid mellanliggande koncentrationer (IC20-IC50). Frö cellerna och inkubera (37 ° c, 5% CO2) tills nästa passage.
- Separat pool antalet celler som krävs för biblioteks täckning för varje replikat i fordonets kontrollgrupp. Lägg till fordonets kontroll med samma volym som drogen (< 0,5% v/v). Frö cellerna och inkubera (37 ° c, 5% CO2) tills nästa passage.
- Fortsätt att passage cellerna och skörda cell pellets för genomiskt DNA var 3 dagar som beskrivs i steg 5.3.5, medan uppfriskande drogen eller fordonet vid varje passage.
- För de positiva urvals-eller läkemedelsresistens skärmarna, dela varje replikeringsgrupp enligt antalet celler som krävs för biblioteks täckningen. Tillsätt IC90 läkemedelskoncentrationer till varje replikat. Vid IC90, en majoritet av cellerna kommer att dödas. Tillåt resistenta populationer att växa och samla in cell pellets (1 – 2 x 107 celler) för GENOMISK DNA-extraktion.
6. CRISPR provberedning och sekvensering
- Genomisk DNA-rening
- Inkubera frysta cell pellets i 5 – 10 min vid RT för upptinning.
- Tillsätt 1,4 mL PBS till ett 50 mL centrifugerör som innehåller en cellpellet. Vortex för 20 s att Omsuspendera cellerna och vila i 1 min. Om det behövs, Pipettera 15x med P1000 att bryta upp de återstående cellklumpar. Om överföring av celler från en 15 mL eller 1,5 mL rör, Omsuspendera cellerna med 1 mL PBS, sedan överföra celler till en 50 mL tub och skölj det ursprungliga röret med 400 μL PBS.
- Tillsätt 5 mL Nuklei Lys lösning till de återsuspenderade cellerna. Blanda provet med en 10 mL pipett genom att Pipettera upp och ner 5x.
- Tillsätt 32 μL RNase A (20 mg/mL; för att erhålla en slutlig koncentration på 100 μg/mL) till det nukleära lysatet och blanda provet genom att invertera röret 5x. Inkubera blandningen vid 37 ° c i 15 minuter och låt provet svalna i 10 minuter vid RT.
- Tillsätt 1,67 mL protein Utfällnings lösning till lysatet och skaka kraftigt i 20 s. små proteinklumpar kan vara synliga efter blandning.
- Centrifugera vid 4 500 x g i 10 minuter vid RT.
- Överför supernatanten med en 10 mL pipett till ett 50 mL centrifugeringsrör som innehåller 5 mL isopropanol. Blanda försiktigt lösningen 10X med inversion tills DNA observeras.
Anmärkning: DNA kan observeras som vita, tråd-liknande trådar som bildar en synlig massa. - Centrifugera vid 4 500 x g i 5 minuter vid RT för att pelleten av DNA.
- Använd en 10 mL pipett och ta försiktigt bort supernatanten och Undvik att lossa DNA-pelleten. Tillsätt 5 mL 70% etanol vid RT till DNA. Rotera röret försiktigt för att tvätta DNA-pelleten och sidorna av centrifugerröret.
- Centrifugera vid 4 500 x g i 5 minuter vid RT.
- Använd en 10 mL pipett och ta försiktigt bort 70% etanol och Undvik att lossa DNA-pelleten. Luft-torrt genomiskt DNA i 10 minuter vid RT.
- Tillsätt 400 μL TE-lösning på röret och låt DNA lösas upp genom att inkuberas vid 65 ° c i 1 h. Blanda DNA genom att försiktigt snärta röret var 15 min. Om DNA inte löses upp helt, Inkubera röret vid 65 ° c i ytterligare 1 h medan försiktigt snärta röret var 15 min, och lämna den vid 4 ° c över natten.
- Centrifugera vid 4 500 x g i 1 min vid RT och överför GENOMISKT DNA till en 1,5 ml låg bindnings slang.
- Kvantifiera och mät renheten hos genomiskt DNA på både spektrofotometer (för total nukleinsyramhalt) och fluorometer (för dubbelsträngad DNA-halt).
- Alternativt, fällning av genomisk DNA om det finns problem med nedströms PCR amplifiering av sgRNA enligt följande.
- Överför 400 μL genomiskt DNA till ett 1,5 mL microcentrifugerör.
- Tillsätt 18 μL 5 M NaCl (slutlig koncentration på 0,2 M) och 900 μL 95% etanol.
- Invertera röret 10X tills det blandas grundligt och centrifugera sedan på 16 000 x g i 10 minuter vid RT.
- Ta försiktigt bort supernatanten och Undvik att lossa DNA-pelleten. Tvätta DNA-pelleten med 500 μL 70% etanol. Rotera röret försiktigt för att tvätta DNA-pelleten.
- Centrifugera vid 16 000 x g i 5 minuter vid RT.
- Ta försiktigt bort supernatanten och Undvik att lossa DNA-pelleten. Luft-torrt genomiskt DNA i 10 minuter vid RT.
- Tillsätt 300 μL TE för att lösa upp DNA enligt beskrivningen i steg 6.1.12.
- Kvantifiera och mäta renhet av genomiskt DNA enligt beskrivningen i steg 6.1.14.
- Beredning av CRISPR-sekvenserings bibliotek
- Ställ in PCR 1 enligt tabell 5 med sammanlagt 100 μg GENOMISKT DNA. Tillsätt 3,5 μg genomiskt DNA per 50 μL reaktion och Ställ in identiska 50 μL reaktioner för att uppnå önskad täckning. Tabell 6 innehåller exempel på primer-sekvenser för förstärkning av LCV2:: TKOv3 sekvenserings bibliotek. Tabell 7 innehåller exempel på primer-sekvenser för förstärkning av pLCKO2:: TKOv3 sekvenserings bibliotek.
- Amplifiera PCR 1 reaktioner i en termocycler med hjälp av programmet som beskrivs i tabell 8.
- Kontrollera PCR 1-amplifiering genom att köra 2 μL av PCR-produkten på en 1% aguppkom gel. PCR 1 ger en produkt av 600 BP.
- Pool alla enskilda 50 μL reaktioner för varje genomiskt DNA-prov och blanda genom vortexing.
- Ställ in en PCR 2-reaktion (50 μL) för varje prov som beskrivs i tabell 9 med 5 μl av den poolade PCR 1-produkten som mall. Använd unika index primer-kombinationer för varje enskilt exempel för att tillåta sammanslagning av biblioteks exempel för sekvensering.
- Amplifiera PCR 2 reaktionen i en termocycler med hjälp av programmet som beskrivs i tabell 10.
- Rengör aguppstod gel utrustning för rening av förstärkta produkter med 0,1 N HCl i 10 min innan du kastar en gel. Bered en 2% agaros gel som innehåller DNA-fläck för rening av PCR 2-förstärkta produkter.
- Kör PCR 2-produkten på 2% aguppstod gel vid låg spänning (1,0-1.5 h run). PCR 2 ger en produkt av 200 BP.
- Visualisera PCR-produkterna på en blå ljus transilluminator. Punktskatter 200 BP band och rena DNA från aguppstod gel slice med hjälp av en gel extraktion kit. Kvantifiera och mät renheten hos sekvenserings biblioteket på både spektrofotometer och fluorometer.
Anmärkning: en typisk gel-renad sekvenserings biblioteks koncentration varierar mellan 5 – 10 ng/μL och en total avkastning på 150 – 300 ng.
- Sekvensering av höga dataflöden
- Sekvens CRISPR sekvenserings biblioteken på nästa generations sequencers.
- Sekvens referens t0 prover vid högre läsdjup 400-till 500-Fold bibliotek täckning. Sekvens experimentella tidpunkten prover för Drop-out skärmar vid ett minimum läsdjup 200-faldigt. För starka positiva urvals skärmar räcker minst Läs djup på 50-faldig täckning för identifiering av anrikad sgRNAs.
ANMÄRKNINGAR: det är viktigt att sekvensera t0-provet för att bestämma biblioteks representation för en viss skärm och fungera som en referens för den avgörande sgRNA-luckan ändras över tiden.
7. analys av data
- Justera sekvens med hjälp av program som bowtie att mappa sekvens läsningar till referens biblioteket med hjälp av följande parametrar:-v2 (som tillåter två missmatchningar) och-M1 (kasta alla läsa som mappas till mer än en sekvens i biblioteket).
- Normalisera antalet unikt mappade läsningar för varje sgRNA för ett givet exempel till 10 000 000 läsningar per sampling enligt följande:
107
- Beräkna log2 faldig förändring av varje sgrna för varje replikat vid varje tidpunkten (TN) jämfört med t0 provet (TN/t0). Lägg till ett pseudoantal på 0,5 läsningar till alla Läs antal för att förhindra avbrott från nollor. Undanta sgRNAs med < 30 RAW-läsningar i t0-provet från beräkning av viknings förändring och nedströms analys.
- Analysera Fold förändringar med Bayesian analys av Gene viktiga (bagel) algoritm < https://-github.com/Hart-Lab/bagel >, med hjälp av grundläggande grundläggande och icke-väsentliga utbildning som definierats tidigare19 för gen essentialitet skärmar ( Tilläggstabell S1) eller drugz < https://github.com/Hart-Lab/Drugz > för drog skärmar20.
- Beräkna precision och återkallande för skärmprestanda bedömning med BF poäng. Använd den grundläggande uppsättningen från steg 7,4 som den sanna positiva listan för precision_recall_curve-funktionen i Scikit-Learn-biblioteket för python, tillsammans med ovanstående BF score-delmängd. Du kan också utföra samma med hjälp av PRROC-paketet i R.
- Beräkna den genomsnittliga vik förändringen av alla guider för varje gen. Generera densitet tomter för essentiella och icke-väsentliga gener (se steg 7,4) i R eller motsvarande programvara. I R, om x. ess är en vektor som innehåller log Fold ändra värden av essentiella gener och x. nonEss innehåller icke-väsentliga gener, rita med hjälp av följande kommando:
Plot (densitet (x. ESS), xlab = "Mean logFC", Col = "röd", LWD = 2)
fodrar (täthet (x. nonEss), kolonn = "blått", LWD = 2)
Anmärkning: för python versionsinformation och paket som används, se scikit-Learn v 0.19.1: (utgiven av Pedregosa et al.21).
107
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Översikt över genomskalningsarbetsflödet för CRISPR
Figur 1 illustrerar en översikt över det POOLADE CRISPR-screeningflödet, som börjar med infektion av målceller med CRISPR Library lentivirus vid en låg Moi för att säkerställa en enda integrations händelse och adekvat biblioteks representation (typiskt 200-till 1000 -Fold). Efter infektion, celler behandlas med antibiotikum puromycin att välja för sensorik celler. Efter val, en baslinje t0 cell pellet samlas för att bedöma biblioteks distributionen i början av screening. De återstående cellerna, som består av en heterogen population av genetiska störningar, är blint på önskad biblioteks representation varje 3-4 dagar för 15-20 dubbleringar att tillåta genredigering och de resulterande effekterna att manifestera. Skärmar med läkemedel behandlingar läggs vanligtvis på T3 eller T6 efter att cellerna har återhämtat sig från virusinfektion och puromycin urval. Celler skördas på önskad biblioteks representation vid varje passage för genomiskt DNA, för att avgöra riktlinje överflöd med nästa generations sekvensering vid önskade tidpunkter.
Det rekommenderas att samla in flera exempel i händelse av fel som kan uppstå i efterföljande sekvensering bibliotek förberedelsesteg. Poolade skärmar är vanligtvis genomförbarhet-baserade analyser som är utformade för antingen positivt eller negativt urval av viktiga sgRNAs. Positiva skärmar identifierar gener som visar resistens eller ökar överlevnaden under ett specifikt urvals tryck (t. ex. droger eller muterad cellinjer). I det här fallet kommer de flesta celler att dö av urvalet, och celler som återstår kommer att berikas för sgRNAs som riktar sig mot gener som är resistenta mot läkemedlet eller villkoret som testas. Negativa urvals skärmar eller "Drop-out"-skärmar identifierar genknock-outs med ökad känslighet eller förlust av överlevnad under trycket på skärm valet. För att identifiera störningar som har en fenotypisk effekt som en tillväxtdefekt, guide överflöd vid varje tidpunkten kvantifieras av nästa generations sekvensering och jämfört med t0 att bedöma Drop-out eller berikning av guider under loppet av skärmen. Med hjälp av analysplattformar mäts logg-faldig förändringar för guider, och algoritmer som BAGEL kan användas för att möjliggöra rangordning av gen träffar.
Biblioteks förstärkning och underhåll av biblioteks representation i poolade CRISPR-skärmar
Figur 2 illustrerar den förväntade fördelningen av stödlinjer efter förstärkning av plasmid biblioteket. TKOv3 biblioteket består av 71 090 sgRNAs med fyra sgRNAs per gen, inriktning ~ 18 000 proteinkodninggener10. Ett idealiskt bibliotek bör ha varenda sgRNA representerade på liknande kvantiteter. Därför rekommenderas det att bekräfta distributionen av guider i det förstärkta biblioteket med nästa generations sekvensering. Här visas ett förstärkt bibliotek med mycket snäv fördelning av sgRNAs, vilket bekräftar att > 95% av alla sgRNAs ligger inom 4-faldigt distributionsområde (figur 2). En bredare fördelning av sgRNAs kommer att indikera att överflödet av biblioteks guider inte är lika representerade och kan bidra till bullret i poolade skärmar.
Utvärdering av skärmens prestanda
Figur 3 visar att prestanda kvaliteten på en skärm kan utvärderas genom att bedöma viknings förändringen för alla sgRNA mot en standard referenslista för guld (684 gener) och icke väsentliga gener (926 gener) och visualiseras som precision-Recall kurvor10. Med hjälp av standard referens uppsättningarna för guld beräknas Bayes Factor (BF)-poängen för skärm slutpunkten, och precisions återkallnings kurvor ritas. BF Poäng beräknas genom att analysera log-faldig förändring för alla guider som riktar en gen med hjälp av en Bayesian ram (den BAGEL algoritm som beskrivs tidigare19) att jämföra distributioner av kända viktiga och icke-väsentliga guide uppsättningar. Falska identifierings frekvenser (FDR) härleds empiriskt med samma standard referensuppsättningar för guld. En högpresterande skärm bör återvinna ett stort antal viktiga gener vid ett tröskelvärde för BF > 6 och FDR < 5%, vilket framgår av en skarp "armbåge" i de flesta kurvor och en rak linje till terminalen punkt som visas av den blå linjen i figur 3a. Avlämningarna av guider som riktar sig till essentiella och icke väsentliga gener bör också undersökas (figur 3b). Guider som riktar sig till icke väsentliga referens gener bör visa en i stort sett symmetrisk fördelning av logg-viknings förändringar centrerade till noll, vilket framgår av den streckade linjen i figur 3b. Vikningen förändring distribution av guider som riktar sig till väsentliga gener visar en stark negativ förskjutning i förhållande till fördelningen av guider som riktar sig till icke väsentliga gener, vilket framgår av den solida linjen i figur 3b.
Essentiella gener
En av de grundläggande tillämpningarna av poolade genomavlämnings skärmar är att identifiera viktiga gener. Essentiella gener, en underkategori av fitness gener, är gener vars störning orsakar cell dödlighet, också anses löst som proliferation gener. I samband med cancerbiologi, är det möjligt att identifiera kontext-specifika väsentligheter för att identifiera beroenden för en viss tumör cell linje. Figur 4, visar genen rang av viktiga gener med Bayes Factor score, som härrör från bagel algoritmen. Bayes Factor (BF) representerar ett förtroende mått som genen knock-out resulterar i en fitness defekt. Mer positiva poäng indikerar högre förtroende för att störning orsakar en minskning av konditionen.
Positiv urvals skärm
Genom-wide knock-out pooler kan odlas i närvaro av överskott Drug agent att leta efter suppressor/resistens gener. Visas här är ett exempel på HCT116 celler screening i närvaro av tymidin att leta efter dämpning av G1/S gripande3. Information om den här skärmen finns i en tidigare publikation3. Kort, 6 dagar efter val av CRISPR biblioteket infekterade celler, celler delades i replikat upprätthålla biblioteks täckningen och behandlas med thymidine. Celler var blint i närvaro av läkemedel tills rikliga resistenta celler återfanns för genomisk DNA-provtagning. Positiva val kan sekvenseras (Läs djup) vid lägre täckning än negativa skärmar eftersom endast en liten del av guiderna kommer att förbli på grund av det starka selektiva trycket. I det här exemplet erhölls sekvensering med några få miljoner läsningar och 11 av 12 sgRNAs inriktade på tymidinkinas (TK1) återfanns och anrikades som förväntat (figur 5).
| Beloppen fastställdes baserat på molar förhållandet 1:1:1 | ||
| Komponent | Mängd per 15 cm plåt en en | |
| LCV2::TKOv3 | pLCKO2::TKOv3 | |
| psPAX2 | 4,8 μg | 7,0 μg |
| pMD2. G | 3,8 μg | 4,0 μg |
| TKOv3Berglund | 8,0 μg | 5,0 μg |
| en en Belopp som bestäms baserat på de flesta produktiva plasmid kombination för TKO Library på 1:1:1 molar ratio | ||
| b Belopp TKO plasmid baserat på CRISPR bibliotek vektor stamnät. LCV2 allt-i-ett vektor = 13 KB, icke-Cas9 pLCKO2 Vector = 7,6 KB | ||
Tabell 1: Rekommenderad mängd plasmid för TKOv3 transfektion.
| Komponent | Mängd per 15 cm plåt |
| Opti-MEM | 800 μL |
| Transfektionsreagens | 48 μL |
Tabell 2: Lipidbaserade transfektionsreagens set-up.
| Fold-täckning | Antal celler per sgRNAb | Antal celler som krävs för infektionb |
| (sgRNA bibliotek storleken × Fold täckning) | (sgRNA bibliotek storlek × vik täckning ÷ 0,3 MOI) | |
| 200 | 1,5 x 107 | 5 x 107 |
| 500 | 3,6 x 107 | 1,2 x 108 |
| 1000 | 7,1 x 107 | 2,4 x 108 |
| en en Baserat på TKOv3 biblioteks storlek = 71 090 sgRNA | ||
| b Numren avrundas uppåt | ||
Tabell 3: bestämning av cell nummer som krävs för TKOv3 CRISPR Library infektion och cellplätering vid olika Fold-täckning.
| Behandling | Antal plattor som krävs för infektion | |
| Screening plattor | Virus, + puromycin | (sgRNA library storlek × 200-Fold) ÷ 0,3 MOI ÷ cell seedning densitet vid infektion = antal plattor krävsen |
| Kontroll 1 | Inga virus, + puromycin (0% överlevnad kontroll) | 1 |
| Kontroll 2 | Virus, + ingen puromycin (100% överlevnad kontroll) | 1 |
| a inkluderar extra tallrikar för att RYMMA för Moi fluktuationer och tillväxttakt | ||
Tabell 4: beräkning för infektions uppsättning.
| Reagenser | Mängd per 1x reaktion |
| 2x Master Mix | 25 μL |
| 10 mM PCR 1 LCV2 framåt primer | 2,5 μL |
| 10 mM PCR 1 LCV2 omvänd primer | 2,5 μL |
| Genomiskt DNA | 3,5 μg |
| Vatten | upp till 50 μL |
| Totala | 50 μL |
Tabell 5: set-up för PCR-1.
Tabell 6: PCR-primers för amplifiering av LCV2:: TKOv3 sekvenserings bibliotek. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Tabell 7: PCR-primers för amplifiering av pLCKO2:: TKOv3 sekvenserings bibliotek. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
| Steg | Temperatur | Tid | |
| 1 | 98 ° c | 30 SEK | |
| 2 | 98 ° c | 10 SEK | 25 cykler (steg 2 – 4) |
| 3 | 66 ° c | 30 SEK | |
| 4 | 72 ° c | 15 SEK | |
| 5 | 72 ° c | 2 min | |
| 6 | 10 ° c | Hålla |
Tabell 8: parametrar för PCR 1-cykeln.
| Reagenser | Mängd per 1x reaktion |
| 2x Master Mix | 25 μL |
| 10 mM i5 framåt primer | 2,5 μL |
| 10 mM i7 omvänd primer | 2,5 μL |
| PCR 1-produkt | 5 μL |
| Vatten | 15 μL |
| Totala | 50 μL |
Tabell 9: set-up för PCR 2.
| Steg | Temperatur | Tid | |
| 1 | 98 ° c | 30 SEK | |
| 2 | 98 ° c | 10 SEK | 10 cykler (steg 2 – 4) |
| 3 | 55 ° c | 30 SEK | |
| 4 | 65 ° c | 15 SEK | |
| 5 | 65 ° c | 5 min | |
| 6 | 10 ° c | Hålla |
Tabell 10: cykel parametrar för PCR 2.
Tilläggstabell S1. TKO referens genuppsättningar vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Figur 1: Schematisk översikt över poolade screening arbetsflöden. (A) mål cells populationen är infekterad med CRISPR Library lentivirus vid Low Moi för att säkerställa att de flesta celler får en viral integration och att biblioteks representation upprätthålls. De olika färgerna representerar olika sgRNAs i varje viral partikel. Genetiskt modifierade cellpooler väljs. När markeringen är klar samplas celler för t0 referens och seriellt passaged. (B) vid första passage efter t0 har cellerna återhämtat sig från smitta och läkemedelsbehandlingar kan vid behov tillsättas. Efter behandling, cellpopulationer är seriellt blint i flera veckor. Under varje passage samlas celler in för genomiskt DNA och reseeded vid den erforderliga luckan täckning av sgRNA biblioteket. (C) två typer av skärmar kan utföras: 1) positiva urvals skärmar, som identifierar muterade celler som visar resistens eller ökad överlevnad under det specifika urvals trycket (t. ex. droger eller muterad cellinjer), eftersom de kommer att berikas under platt eller 2) negativa urvals skärmar, som identifierar muterade celler med ökad känslighet eller förlust av överlevnad under skärmen urvals tryck, eftersom de kommer att förloras under skärmen. D) GENOMISKT DNA SKÖRDAS och PCR-amplifieras för att berika för stödregionerna. (E) rikt linjalöverflöd kvantifieras med nästa generations sekvensering och berikade eller utarmade guider bestäms för "hit"-identifiering. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: kvaliteten på det förstärkta biblioteket CRISPR sgRNA. Amplified Library plasmider analyseras av nästa generations sekvensering (rekommenderas lyder: 30 000 000 läsningar, motsvarande ~ 400-faldig representation av biblioteket). Här visas ett bibliotek med snäv fördelning av sgRNAs, med > 95% av alla sgRNAs inom ett 4-faldigt distributionsområde. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: utvärdering av avlämnings skärmens kvalitet med hjälp av viktiga gen referensuppsättningar av guld standard. Aprecisions återkallelse analys av screening resulterar i återhämtning av essentiella gener vid ett tröskelvärde för BF > 6 och FDR på 5%. Högpresterande skärm representeras av blå linje och lågpresterande skärmar representeras av röd linje. (B) vik förändring fördelning av sgRNA inriktning viktiga gener (solid linje) och icke väsentliga gener (prickig linjer). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: bestämning av gen essentialitet. Bayes Factor rangordning av genen i huvudsak i en viss skärm. Bayes Factor (BF) representerar ett förtroende mått som genen knock-out resulterar i en fitness defekt. Högre Bayes faktorer indikerar ökat förtroende att Gene knock-out resulterar i Fitness defekt, (röda prickar). Lägre Bayes Factor Poäng föreslå Knock-Out ger tillväxtfördelen (blå prickar). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: positiv urvals skärm för suppressor av tymidin-block i HCT116-celler. Normaliserade Läs antal för alla sgRNAs vid T0 plottas mot genomsnittliga normaliserade Läs antal för thymidinbehandlade prover. För positiva urvals skärmar (dvs. med hjälp av en IC90 koncentration av läkemedel), antalet störningar som kommer att ge resistens mot drogen förväntas vara liten. Av denna anledning kan Läs djupet vara lägre än vad som behövs för negativa skärmar, i whch de flesta av biblioteket förväntas vara representerade. TK1 sgrnas är inringade i rött. Denna siffra har ändrats från en tidigare publikation3. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På grund av sin enkelhet i användning och hög följbarhet, CRISPR teknik har allmänt antagits som verktyg för val för exakt genomredigering. Poolade CRISPR screening ger en metod för att förhöra tusentals genetiska störningar i ett enda experiment. I poolade skärmar fungerar sgRNA-biblioteken som molekylära streckkoder, eftersom varje sekvens är unik och mappas till den riktade genen. Genom att isolera det genomiska DNA från cellpopulationen kan gener som orsakar fenotypen av intresse bestämmas genom att kvantifiera sgRNA-överflöd med nästa generations sekvensering. Massivt parallella sekvenserings metoder utnyttjas för att kvantifiera sgRNAs i prover, vilket innebär att flera oberoende cellpopulationer kan slås samman till samma sekvenserings-Lane för att minimera kostnaden.
Innan man inleder ett storskaligt screening projekt är det viktigt att ha en väl karaktäriserad och tekniskt optimerad modell. Genetisk bakgrund, tillväxttakt och transduktionseffektivitet är viktiga faktorer när du väljer dina cellinjer för screening. Till exempel, tillväxttakt och redigering effektivitet kommer att avgöra skalbarhet och teknisk lämplighet för modellen. För att på ett adekvat sätt representera stora sgRNA-bibliotek krävs tiotals miljoner celler, varför cell nummer kan vara en begränsande faktor vid screening av genomförbarheten för cellinjer med långsammare dubbleringar eller sådana som inte har god proliferativ kapacitet (t. ex. primära celler). Baserat på tillväxttakt, cell odlingsförhållanden såsom cell sådd densitet och plåt storlek för screening bör väljas i enlighet med detta. Det rekommenderas att odla celler i det största kärlet som är praktiskt och tekniskt genomförbart för skärmen.
Lentivirus signaltransduktion effektivitet varierar mellan celltyper, som celler skiljer sig i inneboende smittsamhet. Som ett resultat, den volym av virus som krävs för att uppnå tillräcklig infektion i en celltyp kommer inte nödvändigtvis vara densamma i en annan. Därför är det viktigt att funktionellt titer varje parti lentivirus bibliotek som produceras i cellen linje som ska screenas för att säkerställa tillräcklig täckning av biblioteket och mestadels enstaka transduktion händelser per cell genom att transducing på lägre MOIs runt 0,3 (avsnitt 4). Transduktioneffektiviseringar kan också påverkas av cell odlingsförhållanden; Därför bör funktionella titrar bestämmas med hjälp av samma cell förhållanden som kommer att användas på skärmen. Det är, det är viktigt att använda samma vävnadsodling fartyg, media beståndsdelar och volym, cellplätering densitet, och virus Preps utan föregående thaws. Mätningar som görs i olika format eller förhållanden kommer inte att skala på ett tillförlitligt sätt till screening formatet.
Trots fördelen med att använda allt-i-ett CRISPR-Cas9 guide bibliotek som LCV2:: TKOv3, är genen kodning Cas9 ganska stor, vilket gör det svårt att effektivt paketera i viruspartiklar (105-106 tu/ml). Att leverera lägre lentivirala titrar kan vara en begränsning för cellinjer som är svåra att transduce, eftersom de kommer att ha ännu mer problem med all-One-CRISPR bibliotek. För att mildra detta bör Cas9 uttryckas i cell linjen i förväg, följt av leverans av CRISPR-bibliotek som endast innehåller sgRNAs (t. ex. pLCKO2:: TKOv3), som kan göras med mycket högre titrar (107-108 tu/ml). Ploidi av en cellinjer är också viktigt, eftersom det avgör antalet mål loci som behöver ändras. Förmågan att generera kompletta knock-outs i haploida celler är effektivare än i celler med flera kopior av en given gen. Därför, skärmar i haploida celler kan vara känsligare och ge högre kvalitet data än skärmar som utförs i diploida eller aneuploid cellinjer6. Testa kända gener som är länkade till fenotypen kommer att hjälpa till att bestämma skärmens förmåga av en cellinsmodell. Till exempel, för viktiga skärmar, kan guider som riktar sig till en subenhet av 26S Proteasome, PSMD1 (addgene: plasmid #74180), en grundläggande viktig gen, användas för att testa redigering effektivitet och smittsamhet av cellinjer, som störning av PSMD1 kommer att resultera i celldöd.
Robustheten av poolade skärmar beror mycket på sgRNA representation. Detta är ett viktigt mått som avgör bibliotekets prestanda under en skärm och möjligheten att identifiera träffar. Bibliotekets mångfald är partisk i representationen av varje sgRNA; Därför bör populationen av celler som ska undersökas och analyseras vara tillräckligt stor för att säkerställa fångst av underrepresenterade sgRNAs6. 200-till 1000-faldig representation av varje sgrna är den typiska täckning som har använts i publicerade skärmar (dvs., 200-1000 celler per sgrna)10,15. Denna representation bör bibehållas vid förstärkning biblioteket plasmid (avsnitt 1) och hela skärmen genom att infektera och passaging det erforderliga cellnumret (avsnitt 5) för att representera önskad biblioteks täckning och under sekvensering bibliotek beredning (protokoll 6), enligt beskrivningen i protokollet. Till exempel, för att uppnå ~ 200-faldig täckning av TKOv3 biblioteket kräver val och passaging av 15 000 000 infekterade celler. Under sekvensering, förutsatt att en diploida humant arvsmassa innehåller ~ 7,2 PG av DNA och 1 sgRNA per genom, krävs totalt 100 μg genomiskt DNA för att generera sekvenserings biblioteket för 15 000 000-sekvensläsningar. Beslutet om täckning kommer att bero på storleken på biblioteket, som täckning av större bibliotek kommer att kräva odling av större antal celler som kan vara svåra att underhålla och inte tekniskt praktiskt. Ett minimum av 200-faldig täckning är rekommendera med TKOv3 bibliotek, som 200-Fold ger en optimal balans mellan logistiken för screening stort antal celler och bibehålla tillräckligt dynamiskt omfång för att upptäcka sanna biologiska sgRNA Drop-outs med begränsad buller från slumpmässiga utbrotten22,23. Högre vikning biblioteks representationer kommer att resultera i förbättrad reproducerbarhet och säkerställa tillräckliga fönster för att upptäcka förändringar i sgRNA överflöd, särskilt för negativa val. Ett begränsande inslag i negativa skärmar är att störning endast utarmat i den mån det var närvarande i Start biblioteket24. I jämförelse är det dynamiska utbudet av positiva urvals skärmar mycket större, eftersom de förlitar sig på berikning av celler, och kan berika till 100% av den slutliga populationen23. Därför, för positiva urvals skärmar (t. ex. läkemedelsresistens skärmar), biblioteks täckning och Läs djup kan reduceras till 50-till 100-faldig representation eftersom endast en liten cellpopulation förväntas överleva.
Sekvenserings biblioteket protokollet som beskrivs här är en två-stegs PCR optimerad för TKOv3 CRISPR bibliotek i både vektor ryggrader och sekvenserade på Illumina sekvenserings plattform. Dessa sekvenserings bibliotek kan också genereras med ett enda PCR-protokoll, liknande det som beskrivs i Hart et al.3. För andra färdiga bibliotek bör de primers och sekvenserings protokoll som tillhandahålls för dessa bibliotek konsulteras. Vid beredning av genomisk DNA-och PCR-prov är det viktigt att ta hänsyn till kontaminations försiktighetsåtgärder. Till exempel, ett särskilt område för genomisk DNA-rening rekommenderas starkt. Det bör också vara fysiskt skild från bakteriell plasmid Preps, som är vanliga föroreningar som finns i genomisk DNA-prover. PCR-reaktioner bör ställas in i en dedikerad PCR Hood, eftersom detta kommer att minimera kontaminering från plasmider och andra sekvenserings bibliotek. För god sed, en nej-mallen negativ kontroll kanna bli omfattat till hjälp ordningsmanen för PCR kontamination.
Data analys för att översätta sekvensering läsningar från skärmar är en icke-trivial uppgift, med tanke på storleken och mångfalden av dessa dataset. När sekvensen läsningar har anpassats och normaliserats, finns flera bioinformatiska verktyg tillgängliga för att hjälpa till med att utvärdera skärmens prestanda (figur 3) och träff identifiering (figur 4). BAGEL beskrivs i detta protokoll som det viktigaste verktyget för dataanalys. BAGEL använder en Bayesian ram för att jämföra distributioner av kända väsentliga och icke-väsentliga genuppsättningar till log-faldig förändring av alla guider som riktar en gen. Denna metod beskrivs i detalj i Hart et al3. Förutom BAGEL kan även andra algoritmer som utformats för att identifiera både berikade och utarmade sgRNAs, såsom MAGeCK25 , användas. För drog skärmar, är det rekommenderat att använda DrugZ algoritm för att identifiera både synergistiska och suppressor kemiska genetiska interaktioner. DrugZ var utformad för att jämföra det relativa överflöd av sgRNA i en behandlad population till det relativa överflöd av sgRNA i en obehandlad population vid samma tidpunkt20.
En begränsning av CRISPR skärmar är att Cas9 inte alltid leder till en knock-out, eftersom det finns alltid en möjlighet att de indels skapade är i-Frame mutationer, lämnar genfunktion intakt13. Detta resulterar i en blandad population, vilket gör skärmen "bullrig" och tolkning av data utmanande. Att använda flera oberoende sgRNAs som riktar sig mot en gen kan bygga in redundans, vilket minskar effekten av sgRNAs med låg aktivitet. En ytterligare varning till CRISPR studier är effekten av dubbel strand raster som skapats av Cas9 Nuclease, vilket kan leda till cellulära dödlighet oberoende av genen som riktas. Denna anti-proliferativa effekt ökar med målplatsens kopierings nummer, vilket leder till falsk positiv identifiering av gener inom starkt förstärkta regioner26. Beräkningsmetoder som CERES har utvecklats för att korrigera för kopierings nummer effekter27. Dessa arbetsflöden överväga effekten kopiera antal att uppskatta gen beroendenivåer i knock-out-baserade essentialitet skärmar. Noggrann undersökning av genomiska platser av drabbade gener i amplifierade regioner kan bidra till att fastställa falska positiva identifieringar som beror på mångfald av skär effekter13. Primära skärmar kan bara identifiera potentiella träffar. Det är viktigt att följa upp med en sekundär skärm eller protokoll för att validera träffar och skilja på mål från off-Target effekter, ogräsrensning ut falska positiva och säkerställa gener som gjorde svagt på grund av ineffektiva störningar inte lämnas kvar som falsk negativen23.
Detta protokoll är inriktat på genomförbarhetsbaserade screeningmetoder, där studiens tillstånd bör leda till ett spridningsfel eller celldöd. För processer som inte leder till en förändring av cellernas lönsamhet kan den genomförbarhet-baserade poolade screeningmetoden vara restriktiv. Ett alternativ är att utföra skärmar med hjälp av reporter eller markör-baserade analyser och berikning av fluorescensaktiverade cell sortering (FACS) metoder. I markeringsbaserade urvals skärmar baseras fenotypen på mutationer som reglerar markörgen uttryck snarare än cell hälsan13,23. Arrayed CRISPR format finns också för en-gen per brunn screening. Arrayed formaten är mer mottaglig till komplex eller Mikroskop-baserat läsa ute. Men, klädd format kräver automatiserad utrustning och stora mängder reagens28.
Screening protokollet diskuteras här använder S. pyogenes Cas9 Nuclease att skapa null alleles, som är den mest använda för genetiska skärmar och för vilka många bibliotek är tillgängliga (addgene: poolade bibliotek). Alternativa alternativ till knock-out bibliotek finns också, som använder en katalytiskt död dCas9 bundna till kromatin modifierare proteiner för att hämma (crispri) eller aktivera (crispra) transkription av gener. I likhet med RNAi erbjuder CRISPRi möjligheten att studera fenotypiska effekter vid olika gen doser och essentiella gener som inte tål fullständig knock-out, medan CRISPRa kan användas för att utföra Gain-of-funktion skärmar. Var och en av dessa teknologier har sina fördelar, men i allmänhet är CRISPR knock-out-metoden den mest utvecklade. Det har visat sig prestera bra med låg ljudnivå, minimala off-Target effekter, och experimentell konsistens, särskilt i dödlighet-baserade viktiga gen skärmar, jämfört med knock-down metoder med antingen CRISPRi och shRNAs5. Trots den omfattande tillämpligheten hittills är CRISPR-screeningsteknik fortfarande i ett tidigt skede. Nya verktyg fortsätter att byggas från de grundläggande komponenterna i CRISPR. Dessa inkluderar kombinatoriska genredigering strategier som kan rikta flera genomisk loci, optimering av ortogonala CAS enzymer, och modifieringar med kromatin funktionella domäner att diversifiera Cas9 aktiviteter. Eftersom CRISPR Technology fortsätter att växa, kommer dess koppling till genetiska screeningmetoder fungera som en kraftfull plattform för funktionell upptäckt i genetik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av arvsmassa Kanada, Ontarios forskningsfond och de kanadensiska instituten för hälsoforskning (MOP-142375, PJT-148802).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 micron filter | |||
| 30°C plate incubator | |||
| 37°C shaking incubator | |||
| 37°C, 5% CO2 incubator | |||
| 5 M NaCl | Promega | V4221 | |
| 50X TAE buffer | BioShop | TAE222.4 | |
| 6 N Hydrochloric acid solution | BioShop | HCL666.500 | |
| 95% Ethanol | |||
| Alamar blue | ThermoFisher Scientific | DAL1025 | |
| Blue-light transilluminator | ThermoFisher Scientific | G6600 | |
| Bovine Serum Albumin,Heat Shock Isolation, Fraction V. Min. 98%, Biotechnology grade | Bioshop | ALB001.250 | |
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium | Life Technologies | 11995-065 | Cel culture media |
| Electroporation cuvettes | BTX | 45-0134 | |
| Electroporator | BTX | 45-0651 | |
| Endura electrocompetent cells | Lucigen | 90293 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 12483-020 | |
| HEK293T packaging cells | ATCC | CRL-3216 | recommend passage number <15 |
| Hexadimethrine Bromide (Polybrene) | Sigma | H9268 | Cationic polymer to enhance transduction efficiency |
| Hexadimethrine Bromide (Polybrene) | |||
| LB agar plates with carbenicillin | |||
| LB medium with carbenicillin | |||
| Low molecular weight DNA ladder | New England Biolabs | N3233S | |
| Nanodrop spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-ONE-W | |
| NEBNext Ultra II Q5 Master Mix | New England Biolabs | M0544L | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Reduced serum media |
| Plasmid maxi purification kit | Qiagen | 12963 | |
| pMD2.G (envelope plasmid) | Addgene | Plasmid #12259 | lentiviral system |
| psPAX2 (packaging plasmid) | Addgene | Plasmid #12260 | lentiviral system |
| Puromycin | Wisent | 400-160-UG | |
| QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Qubit dsDNA BR assay | ThermoFisher Scientific | Q32853 | |
| Qubit fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33226 | |
| RNAse A | Invitrogen | 12091021 | |
| S.O.C recovery medium | Invitrogen | 15544034 | |
| SYRB Safe DNA gel stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
| Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) - Cas9 included | Addgene | Addgene ID #90203 | Genome-wide CRISPR library , includes Cas9, 71,090 sgRNA |
| Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) - non-cas9 | Addgene | Addgene ID #125517 | Genome-wide CRISPR library, non-Cas9, 71,090 sgRNA |
| Tris-EDTA (TE) solution, pH8.0 | |||
| UltraPure agarose | ThermoFisher Scientific | 16500500 | |
| Wizard genomic DNA purification kit | Promega | A1120 | |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent | Roche | 06 365 809 001 | Lipid based transfection reagent |
References
- Jiang, F., Doudna, J. A. CRISPR-Cas9 Structures and Mechanisms. Annual Review of Biophysics. 46, 505-529 (2017).
- Baliou, S., et al. CRISPR therapeutic tools for complex genetic disorders and cancer (Review). International Journal of Oncology. 53 (2), 443-468 (2018).
- Hart, T., et al. High-Resolution CRISPR Screens Reveal Fitness Genes and Genotype-Specific Cancer Liabilities. Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).
- Morgens, D. W., Deans, R. M., Li, A., Bassik, M. C. Systematic comparison of CRISPR/Cas9 and RNAi screens for essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 634-636 (2016).
- Evers, B., et al. CRISPR knock-out screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
- Miles, L. A., Garippa, R. J., Poirier, J. T. Design, execution, and analysis of pooled in vitro CRISPR/Cas9 screens. The FEBS Journal. 283 (17), 3170-3180 (2016).
- Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
- Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).
- Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nature Communications. 9 (1), 5416 (2018).
- Hart, T., et al. Evaluation and Design of Genome-Wide CRISPR/SpCas9 Knock-out Screens. G3: Genes|Genomes|Genetics. 7 (8), 2719-2727 (2017).
- Mair, B., Tomic, J., et al. Essential gene profiles for human pluripotent stem cells identify uncharacterized genes and substrate dependencies. Cell Reports. 27 (2), 599-615 (2019).
- Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knock-out screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
- Sharma, S., Petsalaki, E. Application of CRISPR-Cas9 Based Genome-Wide Screening Approaches to Study Cellular Signalling Mechanisms. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).
- Steinhart, Z., et al. Genome-wide CRISPR screens reveal a Wnt-FZD5 signaling circuit as a druggable vulnerability of RNF43-mutant pancreatic tumors. Nature Medicine. 23 (1), 60-68 (2017).
- Wang, T., et al. Gene Essentiality Profiling Reveals Gene Networks and Synthetic Lethal Interactions with Oncogenic Ras. Cell. 168 (5), 890-903 (2017).
- Zimmermann, M., et al. CRISPR screens identify genomic ribonucleotides as a source of PARP-trapping lesions. Nature. 559 (7713), 285-289 (2018).
- Deans, R. M., et al. Parallel shRNA and CRISPR-Cas9 screens enable antiviral drug target identification. Nature Chemical Biology. 12 (5), 361-366 (2016).
- Trinh, T. J. J., Bloom, F., Hirsch, V. STBL2: an Escherichia coli strain for the stable propagation of retroviral clones and direct repeat sequences. Focus. 16, 78-80 (1994).
- Hart, T., Moffat, J. BAGEL: a computational framework for identifying essential genes from pooled library screens. BMC Bioinformatics. 17, 164 (2016).
- Wang, G. Z. M., et al. Identifying drug-gene interactions from CRISPR knock-out screens with drugZ. bioRxiv. , Available from: https://doi.org/10.1101/232736 (2017).
- Pedregosa, F. V., G,, et al. Scikit-learn: Machine Learning in Python. Journal of Machine Learning Research. 12, 2825-2830 (2011).
- Ketela, T., et al. A comprehensive platform for highly multiplexed mammalian functional genetic screens. BMC Genomics. 12, 213 (2011).
- Doench, J. G. Am I ready for CRISPR? A user's guide to genetic screens. Nature Review Genetics. 19 (2), 67-80 (2018).
- Hartenian, E., Doench, J. G. Genetic screens and functional genomics using CRISPR/Cas9 technology. FEBS Journal. 282 (8), 1383-1393 (2015).
- Li, W., et al. MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knock-out screens. Genome Biology. 15 (12), 554 (2014).
- Sheel, A., Xue, W. Genomic Amplifications Cause False Positives in CRISPR Screens. Cancer Discovery. 6 (8), 824-826 (2016).
- Meyers, R. M., et al. Computational correction of copy number effect improves specificity of CRISPR-Cas9 essentiality screens in cancer cells. Nature Genetics. 49 (12), 1779-1784 (2017).
- Henser-Brownhill, T., Monserrat, J., Scaffidi, P. Generation of an arrayed CRISPR-Cas9 library targeting epigenetic regulators: from high-content screens to in vivo assays. Epigenetics. 12 (12), 1065-1075 (2017).
