Summary
CRISPR-Cas9 teknologien skaffer en effektiv metoden å presist redigere det pattedyr Genova dersom noe cellen type og representerer en ny betyr å utføre Genova-bred genetisk skjermene. En detaljert protokoll diskuterer trinnene som kreves for vellykket gjennomføring av samlet Genova hele CRISPR-Cas9 skjermene er gitt her.
Abstract
Genova redigere bort benytter det CRISPR-CAS system har kraftig avansert evnen å presist redigere det genomer av forskjellige organisere. I sammenheng med pattedyrceller, representerer denne teknologien en roman betyr å utføre Genova-brede genetiske skjermer for funksjonell Genomics studier. Bibliotekene for guide RNAs (sgRNA) målretting alle åpne lese RAM mer tillate facile generasjon av tusenvis av genetiske forstyrrelser i en enkelt pool av celler som kan bli vist for bestemte fenotyper å implisere gen funksjon og cellulære prosesser i en på en upartisk og systematisk måte. CRISPR-CAS-skjermene gir forskere en enkel, effektiv og rimelig metode for å avdekke de genetiske tegningene for mobil fenotyper. Videre differensial analyse av skjermer utført i ulike cellelinjer og fra ulike krefttyper kan identifisere gener som er innholdsrettede essensielle i tumorceller, avslørende potensielle mål for bestemte anticancer terapier. Utføring av Genova-skjermer i menneskelige celler kan være skremmende, da dette innebærer håndtering av titalls millioner av celler og krever analyse av store datasett. Detaljene av disse skjermene, som cellelinje karakterisering, CRISPR biblioteket betraktninger, og forstå begrensningene og egenskapene til CRISPR teknologi under analyse, blir ofte oversett. Forsynt her over er en detaljert protokollen for det heldig gjennomførelse av samlet Genova-bred CRISPR-Cas9 basert skjermene.
Introduction
CRISPR-CAS, forkortelse for gruppert regelmessig oppdelt korte palindromic repetisjoner og CRISPR-Associated nuklease, består av et enkelt nuklease protein (f. eks Cas9) i komplekse med en syntetisk guide RNA (sgRNA). Dette ribonucleoprotein komplekse mål Cas9 enzymet å indusere dobbel-strandet DNA pauser på en bestemt genomisk geometriske1. Double-strandet pauser kan repareres via homologi rettet reparasjon (HDR) eller, oftere, gjennom ikke-homologe ende sammenføyning (NHEJ), en feil utsatt reparasjon mekanisme som resulterer i innsetting og/eller slettinger (INDELER) som ofte forstyrrer gen funksjon 1. effektiviteten og enkelhet av CRISPR aktiverer en tidligere uoppnåelig nivå av genomisk målgruppe som langt overgår tidligere Genova redigering teknologier [dvs., sink finger NUKLEASER (ZNF) eller transkripsjon aktivator-lignende effektor nukleaser ( TALENS), som begge lider av økt design kompleksitet, lavere transfeksjoner effektivitet, og begrensninger i multiplex genredigering2].
Den grunnleggende forskning anvendelse av CRISPR single-guide RNA-baserte Genova redigering har tillatt forskerne å effektivt og billig avhøre funksjonene til individuelle gener og topologi av genetisk interaksjon nettverk. Evnen å utføre funksjonell Genova-bred skjermene er blitt høyeste forsterket av bruk av det CRISPR-CAS system, spesielt når sammenlignet med tidligere genetisk forstyrrelsene teknologiene som RNA innblanding (RNAi) og gen felle mutagenese. Spesielt lider RNAi fra høye off-Target effekter og ufullstendige knockdown, noe som resulterer i lavere følsomhet og spesifisitet i forhold til CRISPR3,4,5, mens genet felle metoder er bare gjennomførbart i haploide celler for skjermbilder med tap av funksjon, som begrenser omfanget av celle modeller som kan bli avhørt6. CRISPR evne til å generere fullstendig gen-Knock-Out gir et mer biologisk robust system for å forhøre mutert fenotyper, med lavt støynivå, minimale off-mål-effekter og konsistent aktivitet på tvers av reagenser5. CRISPR-Cas9 sgRNA biblioteker som er rettet mot hele menneskelige Genova er nå allment tilgjengelig, slik at samtidig generasjon av tusenvis av genet knock-outs i en enkelt eksperiment3,7,8,9 .
Vi har utviklet unike CRISPR-Cas9 Genova-brede sgRNA lentiviral bibliotekene kalt Toronto Knock-Out (TKO) bibliotekene (tilgjengelig gjennom Addgene) som er kompakte og sekvens-optimalisert for å lette høyoppløselig funksjonell Genomics skjermer. Den nyeste biblioteket, TKOv3, mål ~ 18 000 Human protein-koding gener med 71 090 guider optimalisert for redigering effektivitet ved hjelp av empiriske data10. I tillegg er TKOv3 tilgjengelig som en en-komponent bibliotek (LCV2:: TKOv3, Addgene ID #90294) uttrykker Cas9 og sgRNAs på en enkelt vektor, lindre behovet for å generere stabile Cas9-uttrykker celler, slik at Genova-brede Knock-Out over et bredt spekter av pattedyr celletyper. TKOv3 er også tilgjengelig i en vektor uten Cas9 (pLCKO2:: TKOv3, Addgene ID # 125517) og kan brukes i celler som uttrykker Cas911.
En Genova-brede CRISPR-Cas9 redigert celle befolkningen kan bli utsatt for ulike vekstforhold, med overflod av sgRNAs over tid kvantifisert av neste generasjons sekvensering, gir en avlesning for å vurdere drop-out eller berikelse av celler med sporbar genetisk forstyrrelser. CRISPR Knock-Out biblioteker kan utnyttes til å identifisere gener som, ved forstyrrelsene, forårsake cellulære egnethet defekter, moderat narkotika følsomhet (f. eks følsomme eller resistente gener), regulere protein uttrykk (f. eks, reporter), eller er nødvendig for en viss Pathway funksjon og mobil tilstand12,13,14. For eksempel kan differensial fitness skjermer i en kreftcelle linje identifisere både forringelse eller reduksjon av oncogenes og berikelse eller en økning av tumor Suppressors gener3,14,15. På samme måte kan bruk av mellomliggende doser av terapeutiske legemidler avdekke både resistens og allergi gener16,17.
Forutsatt her er en detaljert screening protokoll for Genova-skala CRISPR-Cas9 tap-av-funksjon screening ved hjelp av Toronto Knock-Out bibliotekene (TKOv1 eller v3) i pattedyrceller fra biblioteket generasjon, screening ytelse til dataanalyse. Selv om denne protokollen er optimalisert for screening ved hjelp av Toronto Knock-Out biblioteker, kan den brukes og bli skalerbar for alle CRISPR sgRNA gruppert bibliotekene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Eksperimentene som er skissert nedenfor, bør følge instituttets retningslinjer for miljø helse og sikkerhet.
1. samlet CRISPR sgRNA lentiviral bibliotek plasmider forsterkning
- Fortynne det ferdige CRISPR sgRNA plasmider DNA-biblioteket til 50 ng/μL i TE (f.eks. TKOv3).
- Electroporate biblioteket ved hjelp av electrocompetent celler. Sett opp totalt fire electroporation reaksjoner som beskrevet nedenfor.
- Tilsett 2 μL av 50 ng/μL TKO bibliotek til 25 μL av tint electrocompetent celler til pre-kjølt kyvetter (1,0 mm) på is.
- Electroporate bruker optimale innstillinger foreslått av produsentens protokoll. Innen 10 s av pulsen, tilsett 975 μL av Recovery medium (eller SOC medium) til Cuvette.
- Overfør electroporated celler til et kultur rør og tilsett 1 mL Recovery medium. Ruge rør i en risting inkubator ved 250 RPM for 1 time ved 37 ° c.
- Sett opp en fortynning plate for å titer biblioteket og anslå transformasjon effektivitet.
- Pool alle 8 mL av gjenopprettede celler og bland godt. Overfør 10 μL av de sammenslåtte cellene til 990, μL av Recovery medium for en 800-fold fortynning og bland godt.
- Plate 20 μL av fortynning på en pre-varmet 10 cm LB + carbenicillin (100 μg/L) agar plate. Dette resulterer i en 40 000-fold fortynning av transformants som vil bli brukt til å beregne transformasjon effektivitet.
- Plate 400 μL av gjenopprettede celler på hver plate over totalt 20 pre-varmet 15 cm LB + carbenicillin agar plater. Ruge platene i 14 – 16 timer ved 30 ° c.
Merk: veksten ved denne lavere temperaturen minimerer rekombinasjon mellom lange-Terminal repetisjoner (LTR)18. - For å beregne transformasjon effektivitet, telle antall kolonier på 40 000-fold fortynning plate (trinn 1.3.2). Multipliser antall kolonier telles med 40 000 for å oppnå det totale antall kolonier på alle platene. Fortsett hvis det totale antall kolonier representerer et bibliotek dekning tilsvarende minimum 200x kolonier per sgRNA (mest optimale er 500-1000x).
- For eksempel, det minimal kolon antallet for TKOv3 bibliotek (71 090 sgRNA) er 1,4 x 107, hvilke er ekvivalent å 200x kolon per sgRNA. Hvis kolonien representasjon er utilstrekkelig, øke antall electroporations i trinn 1,2 basert på antall kolonier på fortynning plate for å oppnå minimum biblioteket dekning.
- Harvest koloniene som beskrevet nedenfor
- Til hver plate på 15 cm, tilsett 7 mL LB + carbenicillin (100 μg/L) medium, og skrap deretter koloniene av med et celle trykk. Med en 10 mL pipette, Overfør de skrapte cellene til en steril 1 L konisk kolbe eller flaske.
- Igjen skyll platen med 5 mL LB + carbenicillin medium og overføre løsningen til flasken.
- Gjenta for alle platene til basseng celler fra 20 plater til en steril flaske.
- Bland innsamlede celler med en bevegelse bar for 1 t ved romtemperatur (RT) for å bryte opp celle klumper. Overfør celler til pre-veide sentrifuge flasker og sentrifuger på 7 000 x g til pellets bakterier, og deretter forkaste Media.
- Veie den våte celle pellet og subtrahere vekten av sentrifuge flasken for å bestemme den endelige vekten av den våte pellet. Rens plasmider DNA ved hjelp av en maxi-eller mega-skala plasmider rensing kit avhengig av hvor mye bakteriell pellet hver kolonne kan behandle.
2. stor skala CRISPR sgRNA bibliotek lentivirus produksjon
Merk: alle trinnene i denne delen av protokollen utføres i et BSL2 +-anlegg i en klasse II, type a2 biosafety kabinett.
- Beregn antall 15 cm plater som kreves for virus produksjon basert på anslaget at 18 mL av viruset er vanligvis høstet fra 1 15 cm plate.
- Forbered celler for transfeksjoner av seeding HEK-293T emballasje celler i lav antibiotika vekst medier (DMEM + 10% FBS + Valgfritt: 0,1 x penn/strep) ved 8 x 106 celler per 15 cm plate i 20 ml av Media. Ruge celler over natten ved 37 ° c, 5% CO2. Sørg for at de belagte cellene er 70% – 80% confluent og jevnt fordelt i øyeblikk av transfeksjoner.
- Neste dag, utarbeide tre transfeksjoner plasmider blanding som beskrevet i tabell 1 for 15 cm plater. Beregn mengden av plasmider som trengs for en transfeksjoner og lage en blanding av plasmider for antall plater, pluss en som skal transfekterte.
- Forbered en lipid-basert transfeksjoner reagens for hver transfeksjoner som beskrevet i tabell 2. Alikvot reduserte serum medier i individuelle 1,5 mL mikrosentrifugen rør for antall plater som skal transfekterte. Tilsett transfeksjoner reagens, bland forsiktig og ruge i 5 minutter ved RT.
- Etter 5 min inkubasjons, tilsett mengden DNA som kreves for en transfeksjoner til transfeksjoner reagens for et 3:1-forhold på transfeksjoner reagens-til-mikrogram DNA-kompleks. Bland forsiktig og ruge i 30 min ved RT.
Merk: påfølgende transfections kan tilberedes i sett på fem eller færre, med 5 min intervaller for å optimalisere for tid og unngå over-inkubasjons. - Etter 30 min av inkubasjons, forsiktig overføre hver transfeksjoner Mix til hver plate av emballasje celler. Legg hele blandingen ved hjelp av en 1 mL pipette spissen dråpevis i en sirkulær, sikksakk bevegelse uten å forstyrre celle monolag. Ruge celler ved 37 ° c i 18 timer ved 5% CO2.
- Klargjør viral Harvest Media: 500 mL DMEM medium + 32 mL BSA lager (20 g/100 mL, oppløst i DMEM, filter sterilisert med 0,22 μm filter) + 5 mL med 100% penn/strep.
- Etter 18 timer, Fjern Media (Bruk riktig håndtering av lentivirus avfall som inkubasjons i 1% natrium natriumhypokloritt i 30 minutter før avhending). Forsiktig erstatte med 18 mL viral Harvest medier til hver plate. Ruge celler ved 37 ° c i 18 timer ved 5% CO2.
- Etter 24 h, sjekk emballasje celler for unormal og smeltet morfologi som en indikasjon på god virus produksjon. Deretter høste lentivirus ved å samle alle supernatanten og overføring til en steril konisk sentrifuge tube.
- Spin mediene inneholder virus på 300 x g i 5 min og pellets emballasjen cellene. Alikvot supernatanten i et sterilt polypropylen rør uten å forstyrre pellet.
- Oppbevar viruset ved 4 ° c i korte perioder (mindre enn 1 uke) eller umiddelbart ved-80 ° c for langtidslagring. Alikvot stor skala virus forbereder til engangsbruk volumer for langtidslagring for å unngå fryse/tine.
3. cellelinje karakterisering for screening
- Velg ønsket cellelinje.
- Mål og registrere omtrentlig dobling tid av cellene.
- Bestem optimal celle plating tetthet for dyrking celler hver 3-4 celle doublings i et vev kultur fartøy av valget (f. eks, 15 cm vev kultur plater).
- Bestem puromycin konsentrasjon som skal brukes i ønsket cellelinje for valg av TKO-biblioteker som inneholder puromycin motstands markør som følger:
- Seed celler i en 12 brønn plate på tettheten som kreves for å nå samløpet etter 72 h, deretter ruge over natten (37 ° c, 5% CO2).
- Neste dag, Bytt til et medium som inneholder et fortynnings område av puromycin konsentrasjoner fra 0 μg/mL til 10 μg/mL, i 0,5 mikrogram/mL trinn. Ruge cellene for 48 h.
- Etter 48 h måles celle levedyktigheten ved celle telling eller alamarBlue farging.
- Bestem den laveste konsentrasjonen som dreper 100% av cellene i 48 h. Bruk denne konsentrasjonen til å velge for CRISPR bibliotek transduced celle populasjoner i trinn 4,6 og 5.2.6.
Merk: for cellelinjer med lengre dobling ganger, kan lengre incubations med puromycin tolereres. I disse situasjonene kan du bestemme Kill Curve for den inkubasjonstiden som kreves for < 3 celle doublings. Minimer tiden for valg for å unngå frafall av essensielle gener før starten av screening.
- Sjekk celler for følsomhet for hexadimethrine bromide (opp til 8 μg/mL) ved å utføre en dose respons kurve i samme metode som brukes for måling av puromycin følsomhet (trinn 3,2). Hvis toksisitet observeres med < 8 μg/mL hexadimethrine bromide, må du ikke bruke.
4. funksjonell titrering av sammenslåtte CRISPR lentivirus bibliotek for fastsettelse av MOI
- Tin en frisk alikvot av sammenslåtte CRISPR sgRNA bibliotek lentivirus (f. eks, LCV2:: TKOv3) og holde på isen.
- Utform en serie med virus volumer som skal testes mellom 0 – 2 mL (dvs. 0 mL, 0,25 mL, 0,5 mL, 1 mL og 2 mL).
- Harvest målceller og frø celler i 15 cm plater på tettheten som kreves for å nå samløpet i 72 h.
- Klargjør duplikat plater for hvert virus volum som skal testes. Legg til celler, virus, hexadimethrine bromide (8 μg/mL) og medier til et endelig volum på 20 mL. Bland platene grundig, sitte plater nivå i inkubator og ruge for 24 h (37 ° c, 5% CO2).
- Etter 24 h, fjerne virus som inneholder Media og kast (bruk biosafety forholdsregler for håndtering av lentivirus avfall). Alternativt, forsiktig vaske platen med varm PBS å fjerne overflødig virus.
- For hver virus forfatning, ombytte med 20 mL av Media inneholder puromycin benytter konsentrasjonen besluttet å drepe celler inne del 3, å ettall duplisere plate. Til den andre platen, tilsett 20 mL ferske medier uten puromycin. Ruge for 48 h (37 ° c, 5% CO2).
- Etter 48 h, kontroller at alle infisert celler (0 mL virus tilstand) behandlet med puromycin er døde. Høste alle platene enkeltvis og spre celler ved gjentatte milde pipettering.
- Telle celler fra alle platene og beregne MOI for hvert virus volum ved å sammenligne celle tellinger med puromycin utvalg til celle tellinger uten puromycin (dvs. +/-puromycin).
- Graph resultater å bestemme viruset volum som fører til 30%-40% celle overlevelse med puromycin utvalg versus uten puromycin. Bruk dette viruset volum for å oppnå en MOI på 0,3-0,4 i løpet av skjermen under samme vev kultur forhold.
5. primærskjerm infeksjon, utvalg, og celle passaging
- Velg CRISPR sgRNA biblioteket dekningen skal opprettholdes gjennom hele skjermen (Anbefalt minimum 200-fold).
- Basert på biblioteket dekning, bestemme antall celler som kreves for å opprettholde denne dekningen per sgRNA og antall celler som kreves for smitte ved MOI 0,3 (tabell 3).
- Bestem antall plater som kreves for å sette opp infeksjonen (Tabell 4).
- Infiserer cellene med CRISPR bibliotek
- Høste celler og frø det nødvendige celle tallet til hver 15 cm plate.
- Legg til hexadimethrine bromide (8 μg/mL) på alle platene.
- Legg viruset på volumet som kreves for MOI 0,3 til screening og kontroll 2 platene. For kontroll 1, ikke Legg til virus, og erstatte dette volumet med Media.
- Bland platene grundig ved å vippe. Plasser platene i inkubator, slik at de er på nivå.
Merk: batch infeksjoner kan gjøres ved å kombinere en Master blanding av virus, Media, og hexadimethrine bromide til cellene i suspensjon før plating. - Fjern Media og Erstatt med ferske medier som inneholder puromycin ved konsentrasjonen bestemmes i trinn 3.2.4 til screening og kontroll 1 plater 24 h etter virus infeksjon. Legg friskt media uten puromycin til kontroll 2 platen. Ruge celler for 48 h (37 ° c, 5% CO2).
- 48 h etter puromycin tillegg, sikre at alle infisert celler er døde (kontroll 1) for å bekrefte puromycin aktivitet, og deretter høste de infiserte cellene.
- Høsting av smittet celle befolkning og celle passaging
- Høste de puromycin cellene fra alle screening platene i én steril beholder. Samle cellene fra hver kontroll plate separat. Spre celler ved milde gjentatte pipettering.
- Telle celler fra sammenslåtte screening celler, kontroll 1, og kontroll 2 separat og beregne antall celler per 1 mL.
- Beregn MOI og fold dekning oppnås som følger:
- Samle tre replikerer av celle pellets fra de grupperte cellene på den valgte biblioteket dekning for genomisk DNA-ekstraksjon. Sentrifuger cellene ved 500 x g i 5 min. vask med PBS. Merk rørene og Frys-tørk celle pellets ved-80 ° c (disse er T0 referanse prøver).
- Del opp utvalget av infiserte celler i tre replikere grupper (for eksempel replikere A, replikere B, replikere C), og samtidig opprettholde biblioteket dekning i hver replikere. Seed celler på samme seeding tetthet som normalt ville bli brukt når utvide dem. Bruk samme antall celler for hver replikere plate og samme totale antall celler mellom replikerer.
- Fortsett å passasje celler og høste tre replikerer av celle pellets fra hver replikere av gruppert-infiserte celler som ovenfor, hver 3-8 dager avhengig av cellelinjen, for opp til 15-20 celle doublings. På hvert avsnitt, høste cellene fra alle platene i hver replikere gruppe med hverandre (dvs. alle celler fra gjenskape en platene er re-blandet sammen, alle celler fra replikere B platene er re-blandet sammen, etc.).
- Merk hver pellet med en gang (T), og kopier betegnelsen. Dette tilsvarer antall dager etter T0 pellet er samlet (f. eks, T3_A, T3_B, T3_C, etc).
- For det negative utvalget narkotika skjermer, tillate celler å gjenopprette for minst én passasje etter T0 før behandling. På T3 eller T6, dele cellene fra hver replikere gruppe (A, B, C) i narkotikabehandling og kontroll populasjoner, bruker samme seeding tettheten som brukes i trinn 5.3.5.
- Separat Pool antall celler som kreves for biblioteket dekning for hver replikere i stoffet behandling gruppen. Tilsett stoffet ved mellomliggende konsentrasjoner (IC20-IC50). Seed cellene og ruge (37 ° c, 5% CO2) til neste passasje.
- Separat utvalg antall celler som kreves for biblioteket dekning for hver replikering i kjøretøy kontrollgruppen. Legg til kjøretøyets kontroll ved hjelp av samme volum som stoffet (< 0,5% v/v). Seed cellene og ruge (37 ° c, 5% CO2) til neste passasje.
- Fortsett å passasje cellene og høste celle pellets for genomisk DNA hver 3 dager som beskrevet i trinn 5.3.5, mens forfriskende stoffet eller kjøretøyet på hvert passasje.
- For de positive valg eller resistens skjermer, dele hver replikere gruppe i henhold til antall celler som kreves for biblioteket dekning. Legg til IC90 legemiddel konsentrasjoner i hver replikere. På IC90vil et flertall av celler bli drept. Tillat resistente populasjoner å vokse og samle celle pellets (1-2 x 107 celler) for genomisk DNA-ekstraksjon.
6. CRISPR sample forberedelse og sekvensering
- Genomisk DNA-rensing
- Ruge den frosne celle pellets i 5 – 10 min ved RT for tine.
- Tilsett 1,4 mL av PBS til et 50 mL sentrifugerør som inneholder en celle pellet. Vortex for 20 s å resuspend cellene og hvile i 1 min. Hvis det er nødvendig, må du Pipetter med en P1000 for å bryte opp de resterende celle klumper. Ved overføring av celler fra en 15 mL eller 1,5 mL rør, resuspend cellene med 1 mL PBS, deretter overføre celler til et 50 mL rør og skyll det opprinnelige røret med 400 μL av PBS.
- Tilsett 5 mL kjerner lyse løsning til resuspendert celler. Bruk en pipette på 10 mL og bland prøven ved å pipettering opp og ned 5x.
- Tilsett 32 μL av RNase A (20 mg/mL; for å oppnå en endelig konsentrasjon på 100 μg/mL) til den kjernefysiske lysat og bland prøven med invertere røret 5x. Ruge blandingen ved 37 ° c i 15 min og la prøven avkjøles i 10 min ved RT.
- Tilsett 1,67 mL protein nedbør løsning på lysat og Vortex kraftig for 20 s. små protein klumper kan være synlig etter blanding.
- Sentrifuger på 4 500 x g for 10 min ved RT.
- Bruk en 10 mL pipette, og Overfør supernatanten til et 50 mL sentrifugerør som inneholder 5 mL isopropanol. Bland forsiktig løsningen 10x ved inversjon til DNA er observert.
Merk: DNA kan observeres som hvit, tråd-lignende tråder som danner en synlig masse. - Sentrifuger på 4 500 x g for 5 min ved RT til pellets DNA.
- Bruk en 10 mL pipette, forsiktig Fjern supernatanten og unngå dislodging av DNA-pellet. Tilsett 5 mL 70% etanol ved RT til DNA. Roter forsiktig røret for å vaske DNA-pellet og sider av sentrifuge røret.
- Sentrifuger på 4 500 x g for 5 min ved RT.
- Bruk en 10 mL pipette, forsiktig Fjern 70% etanol og unngå å dislodging DNA pellet. Air-Dry genomisk DNA for 10 min ved RT.
- Tilsett 400 μL av TE-løsning på røret og la DNA oppløses ved incubating ved 65 ° c i 1 time. Bland DNA ved å sveipe forsiktig røret hver 15 min. Hvis DNA ikke oppløses helt, ruge tube ved 65 ° c i ytterligere 1 time mens du forsiktig blar røret hver 15 min, og la den ved 4 ° c over natten.
- Sentrifuger på 4 500 x g i 1 min ved RT og OVERFØR genomisk DNA til en 1,5 ml lav bindings slange.
- Kvantifisere og mål renheten av genomisk DNA på både spektrofotometer (for total nukleinsyre acid innhold) og fluorometer (for dobbel-strandet DNA innhold).
- Alternativt, utløse genomisk DNA hvis det er problemer med nedstrøms PCR forsterkning av sgRNA som følger.
- Overfør 400 μL genomisk DNA til et 1,5 mL mikrosentrifugen rør.
- Tilsett 18 μL av 5 M NaCl (endelig konsentrasjon på 0,2 M) og 900 μL av 95% etanol.
- Inverter rør 10x til grundig blandet, deretter sentrifuger ved 16 000 x g i 10 min ved RT.
- Fjern forsiktig supernatanten og unngå dislodging av DNA-pellets. Vask DNA-pellet-en med 500 μL av 70% etanol. Roter forsiktig røret for å vaske DNA-pellet.
- Sentrifuger på 16 000 x g for 5 min ved RT.
- Forsiktig fjerne supernatanten og unngå dislodging DNA pellet. Air-Dry genomisk DNA for 10 min ved RT.
- Tilsett 300 μL av TE for å oppløse DNA som beskrevet i trinn 6.1.12.
- Kvantifisere og mål renheten av genomisk DNA som beskrevet i trinn 6.1.14.
- CRISPR sekvensering biblioteket forberedelse
- Sett opp PCR 1 som beskrevet i tabell 5 med totalt 100 MIKROGRAM genomisk DNA. Tilsett 3,5 mikrogram genomisk DNA per 50 μL reaksjon og sett opp identiske 50 μL reaksjoner for å oppnå den ønskede dekningen. Tabell 6 viser eksempler på primer sekvenser for forsterkning av LCV2:: TKOv3 sekvensering biblioteker. Tabell 7 viser eksempler på primer sekvenser for forsterkning av pLCKO2:: TKOv3 sekvensering biblioteker.
- Forsterk PCR 1-reaksjonene i en thermocycler ved hjelp av programmet som er skissert i tabell 8.
- Sjekk PCR 1 forsterkning ved å kjøre 2 μL av PCR-produktet på en 1% agarose gel. PCR 1 gir et produkt av 600 BP.
- Pool alle individuelle 50 μL reaksjoner for hver genomisk DNA-prøve og bland av virvlingen.
- Definer en PCR 2-reaksjon (50 μL) for hver prøve som beskrevet i tabell 9 med 5 μL av det grupperte PCR 1-produktet som mal. Bruk unike indeks primer kombinasjoner for hvert enkelt utvalg for å tillate gruppering av sekvensering biblioteket prøver.
- Forsterk PCR 2-reaksjonen i en thermocycler ved hjelp av programmet som er skissert i Tabell 10.
- Rengjør agarose gel-utstyr for rensing av forsterkede produkter med 0,1 i N HCl i 10 minutter før du Caster en gel. Forbered en 2% agarose gel som inneholder DNA-flekken for rensing av PCR 2-forsterkede produkter.
- Kjør PCR 2-produktet på 2% agarose gel ved lav spenning (1,0 – 1.5 h Run). PCR 2 gir et produkt av 200 BP.
- Visualiser PCR-produktene på et blått lys transilluminator. Avgiftsdirektoratet den 200 BP bandet og rense DNA fra agarose gel skive ved hjelp av en gel Extraction Kit. Kvantifisere og mål renheten av sekvensering biblioteket på både spektrofotometer og fluorometer.
Merk: en typisk gel-renset sekvensering biblioteket konsentrasjon varierer fra 5-10 ng/μL og en total avkastning på 150-300 ng.
- Sekvensering med høy gjennomstrømming
- Sekvens av CRISPR sekvensering bibliotekene på neste generasjons sequencere.
- Sekvens referanse T0 prøver ved høyere lese dybde på 400-til 500-fold biblioteket dekning. Sekvens eksperimentelle timepoint prøver for drop-out skjermene på et minimum lese dybde på 200-fold. For sterke positive valg skjermer, et minimum av lese dybde på 50-fold dekning er tilstrekkelig for identifisering av beriket sgRNAs.
Merk: det er avgjørende å sekvens T0 prøven for å bestemme biblioteket representasjon for en bestemt skjerm og tjene som en referanse for den avgjørende sgRNA fold endringer over tid.
7. data analyse
- Juster sekvens ved hjelp av programmer som Bowtie å kartlegge sekvensen leser til referanse biblioteket ved hjelp av følgende parametere:-v2 (tillater to uoverensstemmelser) og-M1 (kaste alle lese som er tilordnet mer enn én sekvens i biblioteket).
- Normalisere antall unikt kartlagt leser for hver sgRNA for en gitt prøve til 10 000 000 leser per prøve som følger:
107
- Beregn log2 fold endring av hver sgRNA for hver replikere på hver timepoint (TN) i forhold til T0 sample (TN/T0). Legg til en pseudo greven av 0,5 leser til alle lese teller for å hindre avbrudd fra nuller. Ekskluder sgRNAs med < 30 rå leser i T0 prøven fra fold-endring beregning og nedstrøms analyse.
- Analyser fold endringer med Bayesisk Analysis of Gene essentiality (BAGEL) algoritme < https://GitHub.com/Hart-Lab/bagel >, ved hjelp av kjernen essensielle og ikke-essensielle opplæringssett som er definert tidligere19 for gen essentiality skjermer ( Tilleggs tabell S1) eller DrugZ < https://github.com/hart-lab/drugZ > for narkotika skjermer20.
- Beregn presisjon og tilbakekalling for skjermen ytelse vurdering ved hjelp av BF score. Bruk den essensielle sett fra trinn 7,4 som den sanne positive listen for precision_recall_curve funksjon av Scikit-Lær biblioteket for Python, sammen med over BF score delsett. Du kan også utføre det samme ved hjelp av PRROC-pakken i R.
- Beregn gjennomsnittlig fold endring av alle guider for hvert gen. Generer tetthet tomter for de essensielle og ikke-essensielle gener (se trinn 7,4) i R eller tilsvarende programvare. I R, hvis x. ess er en vektor som inneholder loggen fold endre verdier av essensielle gener og x. nonEss inneholder ikke-essensielle gener, plot ved hjelp av følgende kommando:
Plot (tetthet (x. ess), XLAB = "Mean logFC", Col = "rød", LWD = 2)
linjer (tetthet (x. nonEss), Col = "blå", LWD = 2)
Merk: for Python versjon detaljer og pakker som brukes, se scikit-Learn v 0.19.1: (utgitt av Pedregosa et al.21).
107
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Oversikt over Genova-skala CRISPR screening arbeidsflyt
Figur 1 illustrerer en oversikt over de samlede CRISPR screening arbeidsflyt, og starter med infeksjon av målceller med CRISPR biblioteket lentivirus på et lavt Moi å sikre én integrasjon hendelser og tilstrekkelig biblioteket representasjon (typisk 200-til 1000 -fold). Etter infeksjon behandles celler med antibiotika puromycin for å velge for transduced celler. Etter valget, en Baseline T0 celle pellet er samlet for å vurdere biblioteket distribusjon ved starten av screening. De resterende cellene, som består av en heterogen befolkning på genetisk forstyrrelser, er passert på ønsket bibliotek representasjon hver 3-4 dager for 15-20 doublings å tillate genredigering og de resulterende effektene å manifestere. Skjermene med bedøve handling er karakteristisk addert for T3 eller T6 etter cellene ha kommet til hektene fra virus infeksjon og puromycin utvalg. Celler høstes på ønsket biblioteket representasjon på hvert passasje for genomisk DNA, for å avgjøre guide overflod av neste generasjons sekvensering på ønsket tidspunkter.
Det anbefales å samle flere prøver i tilfelle eventuelle feil som kan oppstå i forberedelse av nedstrøms sekvensering av biblioteket. Grupperte skjermer er typisk levedyktighet baserte analyser som er designet for enten positive eller negative valg av essensielle sgRNAs. Positive skjermer identifiserer gener som viser motstand eller øker overlevelse under spesifikt utvalgs trykk (f.eks. narkotika eller mutant cellelinje). I dette tilfellet vil de fleste cellene dø fra utvalget, og celler som gjenstår vil bli beriket for sgRNAs målretting gener som er resistente for stoffet eller tilstanden blir testet. Negative utvalgs skjermer eller "drop-out" skjermer identifisere genet knock-outs med økt følsomhet for eller tap av overlevelse under skjermen valg trykk. For å identifisere forstyrrelser som har en fenotypiske effekt som en vekst defekt, guide overflod på hver timepoint er kvantifisert av neste generasjons sekvensering og sammenlignet med T0 å vurdere drop-out eller berikelse av guider i løpet av skjermen. Ved hjelp av analyse plattformer måles endringer i innloggings brett for hjelpelinjer, og algoritmer som BAGEL kan brukes for å muliggjøre rangering av gen treff.
Bibliotek forsterkning og vedlikehold av bibliotek representasjon i grupperte CRISPR-skjermer
Figur 2 illustrerer den forventede fordelingen av guider etter forsterkning av plasmider biblioteket. TKOv3 biblioteket består av 71 090 sgRNAs med fire sgRNAs per gen, målretting ~ 18 000 protein koding gener10. Et ideelt bibliotek bør ha hver eneste sgRNA representert på lignende mengder. Derfor anbefales det å bekrefte distribusjonen av guider i det forsterkede biblioteket av neste generasjons sekvensering. Vist her er en forsterket bibliotek med svært stramt distribusjon av sgRNAs, bekrefter at > 95% av alle sgRNAs er innenfor 4-fold distribusjonsområde (figur 2). En bredere fordeling av sgRNAs vil indikere at overflod av biblioteket guider er ikke like representert og kan bidra til støy i grupperte skjermer.
Evaluering av skjermytelse
Figur 3 illustrerer at ytelses kvaliteten til en skjerm kan evalueres ved å vurdere fordelingen av fold endringer av alle sgRNA mot en gull standard referanseliste over essensielle (684 gener) og unødvendige gener (926 gener) og visualisere som presisjon-husker kurver10. Ved hjelp av gull standard referanse sett beregnes Bayes Factor (BF)-resultater for skjermende punktet, og kurver med presisjons tilbakekalling tegnes inn. BF score beregnes ved å analysere log-fold endring for alle guider rettet mot et gen ved hjelp av en Bayesisk rammeverk (den BAGEL algoritmen beskrevet tidligere19) for å sammenligne distribusjoner av kjente essensielle og ikke-essensielle guide sett. Falske oppdagelses rater (FDR) avledes empirisk ved hjelp av de samme gull standard referanse settene. En høy ytelse skjermen bør gjenopprette et høyt antall essensielle gener på en terskel på BF > 6 og FDR < 5%, noe som gjenspeiles av en skarp "albue" i de fleste kurver og en rett linje til Terminal punktet som vist ved den blå linjen i figur 3a. Den frafall av veiledere rettet mot essensielle og unødvendige gener bør også undersøkes (figur 3b). Guider rettet mot referansen unødvendige gener bør vise en stor grad symmetrisk fordeling av log-fold endringer sentrert på null, som vist ved den stiplede linjen i figur 3b. Fold endre fordelingen av guider rettet mot essensielle gener viser en sterk negativ forskyvning i forhold til fordelingen av guider rettet mot unødvendige gener, som vist av den solide linjen i figur 3b.
Essensielle gener
En av de grunnleggende anvendelser av samlede Genova hele drop-out skjermene er å identifisere essensielle gener. Essensielle gener, en underkategori av fitness gener, er gener som forstyrrelsene forårsaker celle dødelighet, også betraktet som løst som spredning gener. I sammenheng med kreft biologi, er det mulig å identifisere kontekst-spesifikke nødvendigheter for å identifisere avhengigheter for en bestemt tumor cellelinje. Figur 4, viser genet rang av essensielle gener ved hjelp av Bayes Factor score, AVLEDET fra BAGEL algoritmen. Bayes Factor (BF) representerer et sikkerhetstiltak som resulterer i at genet slår ut i en trenings feil. Mer positive score indikerer høyere tillit til at forstyrrelsene forårsaker en nedgang i fitness.
Skjermbildet for positiv merking
Genova-Wide Knock-Out bassengene kan være kultivert i nærvær av overflødig legemiddel agent å se etter Suppressor/motstand gener. Vist her er et eksempel på HCT116 celler vist i nærvær av tymidin å se etter Suppressors av G1/S arrest3. Du finner detaljer om dette skjermbildet i en tidligere publikasjon3. Kort, 6 dager etter valg av CRISPR biblioteket infiserte celler, celler ble delt inn i replikerer opprettholde biblioteket dekning og behandles med tymidin. Celler ble passert i nærvær av stoffet inntil rikelig resistente celler ble utvunnet for genomisk DNA-prøvetaking. Positive valg kan være sekvensert (lese dybde) med lavere dekning enn negative skjermer, siden bare en liten brøkdel av førerne vil forbli på grunn av det sterke, selektive trykket. I dette eksempelet ble sekvensering innhentet med noen millioner leser, og 11 av 12 sgRNAs målretting tymidin kinase (TK1) ble gjenopprettet og beriket som forventet (figur 5).
| Beløpene ble bestemt basert på molar ratio på 1:1:1 | ||
| Komponent | Beløp per 15 cm plate en egen | |
| LCV2::TKOv3 | pLCKO2::TKOv3 | |
| psPAX2 | 4,8 μg | 7,0 μg |
| pMD2. G | 3,8 μg | 4,0 μg |
| TKOv3b | 8,0 μg | 5,0 μg |
| en egen Beløp fastsatt basert på den mest produktive plasmider kombinasjonen for TKO-biblioteket på 1:1:1 molar forhold | ||
| b Mengde TKO plasmider basert på CRISPR bibliotek vektor ryggrad. LCV2 alt-i-ett-vektor = 13 KB, ikke-Cas9 pLCKO2 vektor = 7,6 KB | ||
Tabell 1: anbefalt mengde plasmider for TKOv3-transfeksjoner.
| Komponent | Beløp per 15 cm plate |
| OPTi-MEM | 800 μL |
| Transfeksjoner reagens | 48 μL |
Tabell 2: lipid-baserte transfeksjoner reagens oppsett.
| Fold-dekning | Antall celler per sgRNAb | Antall celler som kreves for infeksjonb |
| (sgRNA biblioteket størrelsea × fold dekning) | (sgRNA biblioteket størrelse × fold dekning ÷ 0,3 MOI) | |
| 200 | 1,5 x 107 | 5 x 107 |
| 500 | 3,6 x 107 | 1,2 x 108 |
| 1000 | 7,1 x 107 | 2,4 x 108 |
| en egen Basert på TKOv3 bibliotek størrelse = 71 090 sgRNA | ||
| b Tall avrundes oppover | ||
Tabell 3: bestemmelse av celle tall som kreves for TKOv3 CRISPR bibliotek infeksjon og celle plating på ulike fold-dekning.
| Behandling | Antall plater som kreves for infeksjon | |
| Screening plater | Virus, + puromycin | (sgRNA biblioteket størrelse × 200-fold) ÷ 0,3 MOI ÷ celle seeding tetthet ved infeksjon = antall plater som krevesen |
| Kontroll 1 | Ingen virus, + puromycin (0% overlevelses kontroll) | 1 |
| Kontroll 2 | Virus, + ingen puromycin (100% overlevelse kontroll) | 1 |
| a inkluderer ekstra tallerkener for å imøtekomme Moi svingninger og vekstrater | ||
Tabell 4: beregning av infeksjons oppsett.
| Reagenser | Beløp per 1x reaksjon |
| 2x Master Mix | 25 μL |
| 10 mM PCR 1 LCV2 forover primer | 2,5 μL |
| 10 mM PCR 1 LCV2 omvendt primer | 2,5 μL |
| Genomisk DNA | 3,5 μg |
| Vann | opptil 50 μL |
| Totalt | 50 μL |
Tabell 5: PCR 1-oppsett.
Tabell 6: PCR-primere for forsterkning av LCV2:: TKOv3 sekvensering biblioteker. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Tabell 7: PCR-primere for forsterkning av pLCKO2:: TKOv3 sekvensering biblioteker. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
| Trinn | Temperatur | Tid | |
| 1 | 98 ° c | 30 sek | |
| 2 | 98 ° c | 10 sek | 25 sykluser (trinn 2 – 4) |
| 3 | 66 ° c | 30 sek | |
| 4 | 72 ° c | 15 sek | |
| 5 | 72 ° c | 2 min | |
| 6 | 10 ° c | Holde |
Tabell 8: PCR 1 syklus parametere.
| Reagenser | Beløp per 1x reaksjon |
| 2x Master Mix | 25 μL |
| 10 mM i5-primer forover | 2,5 μL |
| 10 mM i7 omvendt primer | 2,5 μL |
| PCR 1-produkt | 5 μL |
| Vann | 15 μL |
| Totalt | 50 μL |
Tabell 9: PCR 2-oppsett.
| Trinn | Temperatur | Tid | |
| 1 | 98 ° c | 30 sek | |
| 2 | 98 ° c | 10 sek | 10 sykluser (trinn 2 – 4) |
| 3 | 55 ° c | 30 sek | |
| 4 | 65 ° c | 15 sek | |
| 5 | 65 ° c | 5 min | |
| 6 | 10 ° c | Holde |
Tabell 10: parametere for PCR 2-syklus.
Supplerende tabell S1. TKO referanse gen sett , Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Figur 1: skjematisk oversikt over samlet screening arbeidsflyt. (A) mål cellepopulasjon er infisert med CRISPR biblioteket lentivirus ved lave Moi å sikre at de fleste cellene får en viral integrasjon og at biblioteket representasjon opprettholdes. De forskjellige fargene representerer ulike sgRNAs i hver viral partikkel. Genmodifiserte celleutvalg er valgt. Når utvalget er fullført, Samples celler for T0 referanse og serielt passert. (B) ved den første passasjen etter T0, har cellene utvinnes fra infeksjon og narkotika behandlinger kan legges til, hvis nødvendig. Etter behandling er celle populasjoner serielt passert i flere uker. Under hver passering, celler er samlet for genomisk DNA og reseeded på ønsket fold dekning av sgRNA biblioteket. (C) to typer skjermer kan utføres: 1) positive valg skjermer, som identifiserer muterte celler som viser motstand eller økt overlevelse under det spesifikke utvalgs trykket (for eksempel narkotika eller mutant cellelinje), da de vil bli beriket i løpet av skjermen eller 2) negative utvalgs skjermer, som identifiserer muterte celler med økt følsomhet for eller tap av overlevelse under Skjermvalg trykket, som de vil gå tapt i løpet av skjermen. (D) genomisk DNA HØSTES og PCR-forsterket til å berike for guide regioner. (E) guide overflod er kvantifisert av neste generasjons sekvensering og beriket, eller utarmet guider bestemmes for "hit" identifikasjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: kvaliteten på FORSTERKET CRISPR sgRNA bibliotek. Forsterket biblioteket plasmider er analysert av neste generasjons sekvensering (anbefales leser: 30 000 000 leser, tilsvarende ~ 400-fold representasjon av biblioteket). Vist her er et bibliotek med tett distribusjon av sgRNAs, med > 95% av alle sgRNAs innenfor en 4-fold distribusjonsområde. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: evaluering av kvaliteten på dråpe-ut-skjermen ved hjelp av gull standardiserte, essensielle gen referanse sett. (A) presisjon tilbakekalling analyse av screening resulterer i gjenvinning av essensielle gener ved en TERSKEL på BF > 6 og FDR på 5%. Høy ytelse skjermen er representert med blå linje og lave resultater skjermene er representert med rød linje. (B) fold endre fordelingen av sgRNA målretting essensielle gener (solid linje) og unødvendige gener (stiplede linjer). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: bestemmelse av gen essentiality. Bayes Factor rangering av genet i hovedsak i en bestemt skjerm. Bayes Factor (BF) representerer et sikkerhetstiltak som resulterer i at genet slår ut i en trenings feil. Høyere Bayes faktorer indikerer økt tillit til at gen Knock-Out resulterer i fitness defekt, (røde prikker). Lavere Bayes Factor score foreslår Knock-Out gir vekst fordel (blå prikker). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: positiv markering skjermen for Suppressor av tymidin blokk i HCT116 celler. Normalisert lese teller for alle sgRNAs på T0 plottet mot bety normalisert lese teller for tymidin behandlede prøvene. For positive utvalgs skjermer (dvs. ved hjelp av en IC90 konsentrasjon av stoffet), antall forstyrrelser som vil tildele resistens til stoffet forventes å være liten. Av denne grunn kan lese dybden være lavere enn det som er nødvendig for negative skjermer, i whch det meste av biblioteket er forventet å være representert. TK1 sgRNAs er markert med rødt. Dette tallet er endret fra en tidligere publikasjon3. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På grunn av sin enkelhet i bruk og høy pliability, CRISPR teknologi har vært allment vedtatt som verktøy for å velge nøyaktig Genova redigering. Gruppert CRISPR-screening gir en metode for å forhøre tusenvis av genetiske forstyrrelser i et enkelt eksperiment. I grupperte skjermer tjener sgRNA-biblioteker som molekylære strekkoder, ettersom hver sekvens er unik og er kartlagt i det målrettede genet. Ved å isolere genomisk DNA fra cellen befolkning, gener forårsaker fenotype av interesse kan bestemmes av kvantifisere sgRNA overflod av neste generasjons sekvensering. Massivt parallelle sekvensering metoder benyttes for å kvantifisere sgRNAs i prøvene, noe som betyr at flere uavhengige celle populasjoner kan samles inn i samme sekvensering kjørefelt for å minimere kostnadene.
Før du tar fatt på en storstilt screening prosjektet, er det viktig å ha en godt preget og teknisk optimalisert modell. Genetisk bakgrunn, vekstrate, og Transduction effektivitet er viktige faktorer når du velger din cellelinjer for screening. For eksempel vil vekstrater og redigerings effektivitet avgjøre skalerbarhet og teknisk egnethet for modellen. For å tilstrekkelig representere store sgRNA biblioteker, titalls millioner av celler er nødvendig, derfor celle nummer kan være en begrensende faktor i screening gjennomførbarhet for cellelinjer med tregere doublings eller de som ikke har god proliferativ kapasitet (f. eks primære celler). Basert på vekstrater, cellekultur forhold som celle seeding tetthet og plate størrelse for screening bør velges tilsvarende. Det anbefales å kultur celler i det største fartøyet som er praktisk og teknisk mulig for skjermen.
Lentivirus Transduction effektivitet varierer mellom celletyper, ettersom cellene varierer iboende infectivity. Som et resultat, vil volumet av viruset som kreves for å oppnå tilstrekkelig infeksjon i en celle type ikke nødvendigvis være den samme i en annen. Derfor er det avgjørende å funksjonelt titer hver batch av lentivirus bibliotek produsert i cellelinjen som skal undersøkes for å sikre tilstrekkelig dekning av biblioteket og for det meste enkelt Transduction hendelser per celle ved transducing ved lavere fuktighet rundt 0,3 (del 4). Transduction effektivitet kan også påvirkes av cellekultur forhold; funksjonelle titers bør derfor bestemmes ved hjelp av de samme celle betingelsene som skal brukes på skjermen. Det er, det er viktig å bruke samme vev kulturen fartøy, Media bestanddeler og volum, celle plating tetthet, og virus forbereder uten tidligere tiner. Målinger gjort i ulike formater eller forhold vil ikke pålitelig skalere til screening-format.
Til tross for fordelen av benytter alle-inne-ettall CRISPR-Cas9 guide biblioteker som LCV2:: TKOv3, det gen omsette til kode Cas9 er helt stor, gjør den vanskelig å effektivt pakke i viral partikler (105-106 Tu/ml). Å levere lavere lentiviral titers kan være en begrensning for cellelinjer som er vanskelige å overfører, ettersom de vil ha enda større vanskeligheter med alt-One-CRISPR-bibliotekene. For å redusere dette, Cas9 bør uttrykkes i cellelinjen på forhånd, etterfulgt av levering av CRISPR bibliotekene bare inneholder sgRNAs (f. eks, pLCKO2:: TKOv3), som kan gjøres ved mye høyere titers (107-108 Tu/ml). Ploidy av en cellelinje er også viktig, ettersom den bestemmer antall mål Loci som må endres. Evnen til å generere komplette knock-outs i haploide celler er mer effektiv enn i celler med flere eksemplarer av et gitt gen. Derfor skjermer i haploide celler kan være mer følsomme og gi høyere kvalitet data enn skjermer utført i diploid eller aneuploid cellelinjer6. Testing kjente gener som er knyttet til fenotype vil bidra til å bestemme skjermen-evne til en cellelinje modell. For eksempel, for essentiality skjermer, guider rettet mot en delenhet av 26S proteasomet, PSMD1 (Addgene: plasmider #74180), en kjerne essensielle genet, kan brukes til å teste redigering effektivitet og infectibility av cellelinjer, som forstyrrelsene av PSMD1 vil resultere i celle død.
Robusthet av sammenslåtte skjermer avhenger sterkt av sgRNA representasjon. Dette er en viktig beregning som bestemmer bibliotek ytelsen under en skjerm og muligheten til å identifisere treff. Bibliotek mangfold er partisk i representasjonen av hver sgRNA; Derfor bør bestanden av celler som skal undersøkes og analyseres være tilstrekkelig store for å sikre fangst av under-representert sgRNAs6. 200-til 1000-fold representasjon av hver sgRNA er den typiske dekningen som har blitt brukt i publiserte skjermer (dvs. 200-1000 celler per sgRNA)10,15. Denne representasjon bør opprettholdes når forsterke biblioteket plasmider (del 1) og gjennom hele skjermen ved å infisere og passaging nødvendig celle nummer (§ 5) for å representere ønsket biblioteket dekning og under sekvensering biblioteket Forberedelse (protokoll 6), som beskrevet i hele protokollen. For eksempel, for å oppnå ~ 200-fold dekning av TKOv3 biblioteket krever valg og passaging av 15 000 000 infiserte celler. I løpet av sekvensering, antar en diploid Human Genova behersker ~ 7,2 PG av DNA og 1 sgRNA per Genova, en samlet sum 100 μg av genomisk DNA er krevde å utvikle det sekvensering bibliotek for 15 000 000 orden leser. Avgjørelsen av dekningen vil avhenge av størrelsen på biblioteket, som dekning av større biblioteker vil kreve dyrking større antall celler som kan være vanskelig å vedlikeholde og ikke teknisk praktisk. Et minimum av 200-fold dekning er anbefaler med TKOv3 biblioteker, som 200-fold gir en optimal balanse mellom logistikk av screening stort antall celler og opprettholde tilstrekkelig dynamisk område for å oppdage sanne biologiske sgRNA drop-outs med begrenset støy fra Random depletions22,23. Høyere fold bibliotek representasjoner vil resultere i bedre reproduserbarhet og sikre tilstrekkelig vindu for påvisning av endringer i sgRNA overflod, spesielt for negative valg. En begrensende funksjon av negative skjermer er at forstyrrelsene er bare utarmet i den grad det var til stede i Start biblioteket24. Til sammenligning er det dynamiske spekteret av positive valg skjermer mye større, som de er avhengige av berikelse av celler, og kunne berike til 100% av den endelige befolkningen23. Derfor, for positive valg skjermer (f. eks resistens skjermer), bibliotek dekning og lese dybde kan reduseres til 50-til 100-fold representasjon siden bare en liten celle befolkning er ventet å overleve.
Sekvensering biblioteket protokollen beskrevet her er en to-trinns PCR optimalisert for TKOv3 CRISPR biblioteker i både vektor-infrastruktur og sekvensert på Illumina sekvensering plattformen. Disse sekvensering bibliotekene kan også genereres ved hjelp av en enkelt PCR-protokollen, lik som beskrevet i Hart et al.3. For andre ferdige biblioteker, primere og sekvensering protokoller som tilbys for disse bibliotekene bør konsulteres. Når du klargjør genomisk DNA-og PCR-prøver, er det viktig å være hensyn til forholdsregler ved forurensning. For eksempel er et eget område for genomisk av DNA-rensing sterkt anbefalt. Det bør også være fysisk forskjellig fra bakteriell plasmider forbereder, som er vanlige forurensninger som finnes i genomisk DNA-prøver. PCR-reaksjoner bør settes opp i en dedikert PCR-hette, da dette vil redusere forurensning fra plasmider og andre sekvenser biblioteker. For god praksis kan en ingen-mal negativ kontroll inkluderes for å overvåke for PCR-forurensning.
Data analyse for å oversette sekvensering leser fra skjermene er en ikke-triviell oppgave, gitt størrelsen og mangfoldet av disse datasettene. Når sekvensen leser har blitt justert og normalisert, flere Bioinformatic verktøy er tilgjengelig for å bistå med evaluering skjermen ytelse (Figur 3) og trykk identifisering (Figur 4). BAGEL er beskrevet i denne protokollen som nøkkel verktøy for dataanalyse. BAGEL bruker en Bayesisk rammeverk for å sammenligne distribusjoner av kjente viktige og ikke-essensielle genet sett til log-fold endring av alle guider rettet mot et gen. Denne metoden er beskrevet i detalj i Hart et al3. I tillegg til BAGEL, andre algoritmer designet for å identifisere både beriket og utarmet sgRNAs, slik som MAGeCK25 kan også brukes. For narkotika skjermer, anbefales det å bruke DrugZ algoritme for å identifisere både synergi og Suppressor kjemiske genetiske interaksjoner. DrugZ ble designet for å sammenligne den relative overflod av sgRNA i en behandlet befolkning til den relative overflod av sgRNA i en ubehandlet befolkning på samme timepoint20.
En begrensning av CRISPR skjermene er at Cas9 ikke alltid fører til en knock-out, da det er alltid en mulighet for at indeler opprettet er in-Frame mutasjoner, forlater genet funksjonen intakt13. Dette resulterer i en blandet befolkning, noe som gjør skjermen "støyende" og tolkning av data utfordrende. Bruke flere uavhengige sgRNAs målretting et gen kan bygge-i redundans, redusere effekten av sgRNAs med lav aktivitet. En ekstra påminnelse til CRISPR studier er effekten av den doble tråden bryter skapt av Cas9 nuklease, som kan føre til cellulær dødelighet uavhengig av genet blir målrettet. Denne anti-proliferativ effekten øker med målområdet kopi nummer, som fører til falsk positiv identifisering av gener innen sterkt forsterket regioner26. Beregningsorientert metoder som CERES har blitt utviklet for å korrigere for kopi nummer effekter27. Disse arbeidsflytene vurderer kopierings nummer effekten til å beregne gen avhengighet nivåer i knock-out-baserte essentiality skjermer. Nøye undersøkelse av genomisk steder av hit gener i forsterkede regioner kan bidra til å bestemme falske positiver som skyldes mangfoldet av kutte effekter13. Primær skjermer kan bare identifisere potensielle treff. Det er viktig å følge opp med en sekundær skjerm eller protokoll for å validere treff og skille på målet fra off-målet effekter, Luke ut falske positiver og sikre gener som scoret svakt på grunn av ineffektive forstyrrelser ikke blir liggende igjen som falske negativer23.
Denne protokollen fokuserer på levedyktighet basert screening tilnærminger, der tilstanden til studien bør føre til en spredning defekt eller død av celler. For prosesser som ikke fører til en endring i cellulær levedyktighet, kan levedyktigheten basert gruppert screening metoden være restriktiv. Et alternativ er å utføre skjermer ved hjelp av reporter eller markør-baserte analyser og berikelse av fluorescens aktivert celle sortering (FACS) tilnærminger. I markør-baserte valg skjermer, er fenotype basert på mutasjoner som regulerer markør genuttrykk i stedet for celle helse13,23. Plassert CRISPR formater er også tilgjengelig for ett-genet per brønn screening. Plassert formatter er flere mottagelig å innviklet eller mikroskopi-basert lese outs. Plassert formater krever imidlertid automatisert utstyr og store mengder reagenser28.
Den screening protokollen diskutert her bruker S. pyogenes Cas9 nuklease å lage null alleler, som er den mest brukte for genetiske skjermer og som mange biblioteker er tilgjengelige (Addgene: grupperte biblioteker). Alternative alternativer til Knock-Out biblioteker er også tilgjengelig, som bruker en katalytisk døde dCas9 bundet til kromatin modifikasjons proteiner å hemme (CRISPRi) eller aktivere (CRISPRa) transkripsjon av gener. Analog med RNAi, CRISPRi tilbyder evnen å studere fenotypiske virkninger for annerledes gen doser og vesentlige gener det kan ikke tolerere fullstendig banke-ut, stund CRISPRa kan brukes å utføre fortjene-av-funksjonen skjermene. Hver av disse teknologiene har sine fordeler, men generelt er det CRISPR Knock-Out tilnærming er den mest utviklede. Det har vist seg å prestere godt med lavt støynivå, minimale off-mål effekter, og eksperimentell konsistens, spesielt i dødelighet-baserte essensielle genet skjermer, sammenlignet med knock-Down tilnærminger ved hjelp av enten CRISPRi og shRNAs5. Til tross for den omfattende anvendelsen hittil, forblir CRISPR screening-teknologi i en tidlig fase. Nye verktøy fortsetter å bli bygget fra de grunnleggende komponentene i CRISPR. Disse inkluderer Kombinatorisk genredigering strategier som kan målrette flere genomisk Loci, optimalisering av ortogonale CAS enzymer, og modifikasjoner med kromatin funksjonelle domener for å diversifisere Cas9 aktiviteter. Som CRISPR teknologi fortsetter å vokse, vil koblingen til genetisk screening tilnærminger tjene som en kraftig plattform for funksjonell oppdagelse i genetikk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Genova Canada, Ontario Research Fund, og Canadian Institutes for Health Research (MOP-142375, PJT-148802).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 micron filter | |||
| 30°C plate incubator | |||
| 37°C shaking incubator | |||
| 37°C, 5% CO2 incubator | |||
| 5 M NaCl | Promega | V4221 | |
| 50X TAE buffer | BioShop | TAE222.4 | |
| 6 N Hydrochloric acid solution | BioShop | HCL666.500 | |
| 95% Ethanol | |||
| Alamar blue | ThermoFisher Scientific | DAL1025 | |
| Blue-light transilluminator | ThermoFisher Scientific | G6600 | |
| Bovine Serum Albumin,Heat Shock Isolation, Fraction V. Min. 98%, Biotechnology grade | Bioshop | ALB001.250 | |
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium | Life Technologies | 11995-065 | Cel culture media |
| Electroporation cuvettes | BTX | 45-0134 | |
| Electroporator | BTX | 45-0651 | |
| Endura electrocompetent cells | Lucigen | 90293 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 12483-020 | |
| HEK293T packaging cells | ATCC | CRL-3216 | recommend passage number <15 |
| Hexadimethrine Bromide (Polybrene) | Sigma | H9268 | Cationic polymer to enhance transduction efficiency |
| Hexadimethrine Bromide (Polybrene) | |||
| LB agar plates with carbenicillin | |||
| LB medium with carbenicillin | |||
| Low molecular weight DNA ladder | New England Biolabs | N3233S | |
| Nanodrop spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-ONE-W | |
| NEBNext Ultra II Q5 Master Mix | New England Biolabs | M0544L | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Reduced serum media |
| Plasmid maxi purification kit | Qiagen | 12963 | |
| pMD2.G (envelope plasmid) | Addgene | Plasmid #12259 | lentiviral system |
| psPAX2 (packaging plasmid) | Addgene | Plasmid #12260 | lentiviral system |
| Puromycin | Wisent | 400-160-UG | |
| QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Qubit dsDNA BR assay | ThermoFisher Scientific | Q32853 | |
| Qubit fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33226 | |
| RNAse A | Invitrogen | 12091021 | |
| S.O.C recovery medium | Invitrogen | 15544034 | |
| SYRB Safe DNA gel stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
| Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) - Cas9 included | Addgene | Addgene ID #90203 | Genome-wide CRISPR library , includes Cas9, 71,090 sgRNA |
| Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) - non-cas9 | Addgene | Addgene ID #125517 | Genome-wide CRISPR library, non-Cas9, 71,090 sgRNA |
| Tris-EDTA (TE) solution, pH8.0 | |||
| UltraPure agarose | ThermoFisher Scientific | 16500500 | |
| Wizard genomic DNA purification kit | Promega | A1120 | |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent | Roche | 06 365 809 001 | Lipid based transfection reagent |
References
- Jiang, F., Doudna, J. A. CRISPR-Cas9 Structures and Mechanisms. Annual Review of Biophysics. 46, 505-529 (2017).
- Baliou, S., et al. CRISPR therapeutic tools for complex genetic disorders and cancer (Review). International Journal of Oncology. 53 (2), 443-468 (2018).
- Hart, T., et al. High-Resolution CRISPR Screens Reveal Fitness Genes and Genotype-Specific Cancer Liabilities. Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).
- Morgens, D. W., Deans, R. M., Li, A., Bassik, M. C. Systematic comparison of CRISPR/Cas9 and RNAi screens for essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 634-636 (2016).
- Evers, B., et al. CRISPR knock-out screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
- Miles, L. A., Garippa, R. J., Poirier, J. T. Design, execution, and analysis of pooled in vitro CRISPR/Cas9 screens. The FEBS Journal. 283 (17), 3170-3180 (2016).
- Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
- Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).
- Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nature Communications. 9 (1), 5416 (2018).
- Hart, T., et al. Evaluation and Design of Genome-Wide CRISPR/SpCas9 Knock-out Screens. G3: Genes|Genomes|Genetics. 7 (8), 2719-2727 (2017).
- Mair, B., Tomic, J., et al. Essential gene profiles for human pluripotent stem cells identify uncharacterized genes and substrate dependencies. Cell Reports. 27 (2), 599-615 (2019).
- Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knock-out screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
- Sharma, S., Petsalaki, E. Application of CRISPR-Cas9 Based Genome-Wide Screening Approaches to Study Cellular Signalling Mechanisms. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).
- Steinhart, Z., et al. Genome-wide CRISPR screens reveal a Wnt-FZD5 signaling circuit as a druggable vulnerability of RNF43-mutant pancreatic tumors. Nature Medicine. 23 (1), 60-68 (2017).
- Wang, T., et al. Gene Essentiality Profiling Reveals Gene Networks and Synthetic Lethal Interactions with Oncogenic Ras. Cell. 168 (5), 890-903 (2017).
- Zimmermann, M., et al. CRISPR screens identify genomic ribonucleotides as a source of PARP-trapping lesions. Nature. 559 (7713), 285-289 (2018).
- Deans, R. M., et al. Parallel shRNA and CRISPR-Cas9 screens enable antiviral drug target identification. Nature Chemical Biology. 12 (5), 361-366 (2016).
- Trinh, T. J. J., Bloom, F., Hirsch, V. STBL2: an Escherichia coli strain for the stable propagation of retroviral clones and direct repeat sequences. Focus. 16, 78-80 (1994).
- Hart, T., Moffat, J. BAGEL: a computational framework for identifying essential genes from pooled library screens. BMC Bioinformatics. 17, 164 (2016).
- Wang, G. Z. M., et al. Identifying drug-gene interactions from CRISPR knock-out screens with drugZ. bioRxiv. , Available from: https://doi.org/10.1101/232736 (2017).
- Pedregosa, F. V., G,, et al. Scikit-learn: Machine Learning in Python. Journal of Machine Learning Research. 12, 2825-2830 (2011).
- Ketela, T., et al. A comprehensive platform for highly multiplexed mammalian functional genetic screens. BMC Genomics. 12, 213 (2011).
- Doench, J. G. Am I ready for CRISPR? A user's guide to genetic screens. Nature Review Genetics. 19 (2), 67-80 (2018).
- Hartenian, E., Doench, J. G. Genetic screens and functional genomics using CRISPR/Cas9 technology. FEBS Journal. 282 (8), 1383-1393 (2015).
- Li, W., et al. MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knock-out screens. Genome Biology. 15 (12), 554 (2014).
- Sheel, A., Xue, W. Genomic Amplifications Cause False Positives in CRISPR Screens. Cancer Discovery. 6 (8), 824-826 (2016).
- Meyers, R. M., et al. Computational correction of copy number effect improves specificity of CRISPR-Cas9 essentiality screens in cancer cells. Nature Genetics. 49 (12), 1779-1784 (2017).
- Henser-Brownhill, T., Monserrat, J., Scaffidi, P. Generation of an arrayed CRISPR-Cas9 library targeting epigenetic regulators: from high-content screens to in vivo assays. Epigenetics. 12 (12), 1065-1075 (2017).
