Bu yazıda, içinde vitro kinaz assay, raf Co-aktivasyon tahlil ve tamamlayıcı Split Lusiferaz assay dahil raf aile kinazları, hastalık ile ilgili mutantlar karakterize için pratik ve uygulanabilir Yöntemler bir dizi sundu.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Bir dizi pratik ve uygulanabilir yöntem kullanarak RAF aile Kinazlarının hastalıkla ilgili mutantları karakterize etme
Bu makalede
Özet
Özet
Hızla hızlandırılmış Fibrosarkom (RAF) aile kinazları hücre biyolojisinde merkezi bir rol oynamaktadır ve bunların fonksiyon bozukluğu kanserler ve gelişimsel bozukluklara yol açar. Hastalık ile ilgili RAF mutantlarının bir karakterizasyonu, bu hastalıkların tedavisinde uygun terapötik stratejileri seçmemize yardımcı olacaktır. Son çalışmalar RAF aile kinazların hem katalizör ve allosterik faaliyetler, sıkı dimerization tarafından düzenlenmiş olduğunu göstermiştir. Burada, katalitik ve allosterik faaliyetleri ve RAF ailesinin kinazlarının ve mutantların bağıl dimer yakınlık/stabilitesi belirlemek için pratik ve uygulanabilir Yöntemler bir dizi inşa ettik. Öncelikle, biz tampon deterjan konsantrasyonu azaltarak klasik in vitro kinaz tahlil değiştirildi, nazik bir hızlı yıkama prosedürü kullanarak, ve bir glutatyon S-transferase (GST) füzyon sırasında bunalımları raf dimerleri önlemek için istihdam Arıtma. Bu da bize, kurucu aktif RAF mutantların katalitik aktivitesini uygun şekilde ölçmemizi sağlar. İkincisi, biz bir roman raf Co-aktivasyon assay N-terminal kesilmiş raf proteinleri kullanarak kinaz-ölü raf mutantlar allosterik etkinliğini değerlendirmek için geliştirilen, geçerli protokollerde aktif RAS gereksinimini ortadan kaldırarak ve böylece daha yüksek bir elde Duyarlılık. Son olarak, biz kantitatif bağıl dimer yakınlık ölçmek için benzersiz bir tamamlayıcı bölünmüş Lusiferaz tahlil oluşturulan/çeşitli raf mutantların istikrar, hangi daha güvenilir ve duyarlı geleneksel Co-immünoprecipitation tahlil kıyasla. Özetle, bu yöntemlerin aşağıdaki avantajları vardır: (1) Kullanıcı dostu; (2) gelişmiş ekipman olmadan etkili bir şekilde yürütmek mümkün; (3) maliyet-etkili; (4) son derece hassas ve yeniden oluşturulabilir.
Giriş
Raf aile kinazları RAS/raf/mek/erk sinyalizasyon Cascade, Mitojen aktif protein kinaz (mek)1,2,3,4etkinleştirmek için RAS bir sinyal iletme önemli bir bileşenidir. Bu kinazlar ailesi hücre büyüme, hayatta kalma ve farklılaşma önemli bir rol oynar, ve onların değişiklikler birçok hastalık neden, özellikle kanser5,6,7,8. Son zamanlarda, genomik sequencings RAS/raf/mek/erk Cascade9,<....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. RAF mutantların katalitik etkinliğini ölçmek için In vitro kinaz assay
- , Gibson Assembly ya da geleneksel moleküler klonlama yöntemleri kullanarak C-Terminus Flag (dykddddk) etiketi ile raf mutantlar (Şekil 1A) kodlama vektörler oluşturun.
- Flag etiketini ve mutasyonlar raf kodlama dizileri PCRs tarafından tanıtmak ve sonra tüm dizileri pcdna 3.1 (+) vector Gibson derleme veya T4 DNA ligasyonu kullanarak ve üretim protokolleri aşağıdaki ekleyin. PCR reaksiyonları için aşağıdaki koşulları kullanın: (1) 95 °C, 2 dak; (2) 95 °C, 30 s; (3) 59 °C, 30 s; (4) 68 °C, 3 dk; (5) 20 döngüleri (2 için 4); (6) 4 ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
RAF ailesinin kinazları hem katalizör hem de allosterik faaliyetlere sahiptir, bu da hastalıkla ilgili mutantların farklı mekanizmalar üzerinden akış sinyallerini açmasını sağlar13,14,16,17 ,18. Kurucu aktif RAF mutantları doğrudan fosforylate onların substratlar, kinaz-ölü RAF mutantlar vahşi tip meslektaşları transaktive yoluyla işlevlerini yerine getirmek........
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu yazıda, içinde vitro kinaz assay, raf Co-aktivasyon tahlil ve ücretsiz bölünmüş Lusiferaz tahlil dahil hastalık ile ilgili raf mutantlar, karakterize etmek için üç yöntem sundu. Raf kinazları hem katalitik aktivite ve allosterik aktivite olduğundan, çeşitli raf mutantlar iki farklı mekanizmalar aracılığıyla akış sinyalizasyon aktive edebilir13,14,16,17, 18........
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, rakip finansal çıkarların olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Yazarlar Yuan Jimin desteği için Tüylü hücre lösemi Bursu kabul etmek istiyorum. Bu çalışma Asya Fonu kanser Araştırması (AFCR2017/2019-JH), Duke-NUS KBrFA/2018/0014), NCCRF köprüleme hibe (NCCRF-YR2018-JUL-BG4), NCCRF pilot hibe (NCCRF-YR2017-JUL-PG3) ve SHF akademik tıp tarafından desteklenmektedir Araştırma hibe (AM/TP011/2018).
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| anti-fosfoERK1/2 | Hücre Sinyalizasyon Teknolojileri | 4370 | |
| anti-fosfoMEK1/2 | Hücre Sinyalizasyon Teknolojileri | 9154 | |
| anti-ERK1/2 | AB klonal | A0229 | |
| anti-MEK1/2 | Hücre Sinyalizasyon Teknolojileri | 9124 | |
| anti-FLAG (fare) | Sigma-Aldrich | F3165 | |
| anti-HA | Novus Biologicals | MAB6875 | |
| anti-FLAG (Tavşan) | Hücre Sinyal Teknolojileri | 14793 | |
| anti-β-aktin | Sigma-Aldrich | A2228 | |
| anti-FLAG boncukları (M2) | Sigma-Aldrich | A4596 | |
| HRP konjuge anti-fare IgG Jackson | Laboratuvarları | 115-035-003 | |
| HRP konjuge anti-Tavşan IgG | Jackson Laboratuvarları | 111-035-144 | |
| pcDNA3.1 (+) | In vitrojen | V79020 | |
| Gibson Montaj Klonlama Kit | New England Biolabs | E5510 | |
| T4 DNA ligaz | New England Biolabs | M0202 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| Fugene 6 | Roche | 11 814 443 001 | |
| DMEM fenol kırmızı | Invitrogen | 21063-029 | |
| D-lusiferin ve nbsp; | GoldBio | LUCK-100 | |
| 6xhis etiketli MEK1 (K97A) | Daha önceki çalışmalarımızda hazırlanan | N.A. | Referans 15. |
| GloMax-Multi Algılama Sistemi. | Promega | E7041 |
Kaynaklar
- Chong, H., Vikis, H. G., Guan, K. L. Mechanisms of regulating the Raf kinase family. Cellular Signalling. 15 (5), 463-469 (2003).
- Wellbrock, C., Karasarides, M., Marais, R. The RAF proteins take center stage. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (11), 875-885 (2004).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
