El objetivo de este método es generar un modelo in vivo de angiogénesis tumoral mediante células tumorales de mamíferos xenografting en un embrión de pez cebra que tiene vasos sanguíneos marcados fluorescentemente. Mediante la toma de imágenes del xenoinjerto y los vasos asociados, se puede obtener una medición cuantitativa de la respuesta angiogénica.
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Artículo de método
In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts
En este artículo
Resumen
Resumen
La angiogénesis tumoral es un objetivo clave de la terapia contra el cáncer y este método ha sido desarrollado para proporcionar un nuevo modelo para estudiar este proceso in vivo. Un xenoinjerto de pez cebra se crea implantando células tumorales de mamíferos en el espacio perivitelina de dos embriones de pez cebra de post-fertilización de días, seguido de medir la extensión de la respuesta angiogénica observada en un punto final experimental de hasta dos días postimplantación. La ventaja clave de este método es la capacidad de cuantificar con precisión la respuesta angiogénica del huésped de pez cebra al injerto. Esto permite un examen detallado de los mecanismos moleculares, así como de la contribución del huésped contra el tumor a la respuesta angiogénica. Los embriones xenoinjerados pueden ser sometidos a una variedad de tratamientos, como la incubación con posibles fármacos anti-angiogénesis, con el fin de investigar estrategias para inhibir la angiogénesis tumoral. La respuesta angiogénica también puede ser imagen en vivo con el fin de examinar procesos celulares más dinámicos. La técnica experimental relativamente poco exigente, los costos de mantenimiento baratos del pez cebra y la breve línea de tiempo experimental hacen que este modelo sea especialmente útil para el desarrollo de estrategias para manipular la angiogénesis tumoral.
Introducción
La angiogénesis es una de las señas de identidadclásicas del cáncer y representa un objetivo de la terapia contra el cáncer 1,2. Para estudiar este proceso, se han creado modelos de xenoinjerto de cáncermediante la implantación de células tumorales de mamíferos en animales como ratones 3. También se ha desarrollado un modelo de xenoinjerto de pez cebra, que implica la implantación de células tumorales en 2 días después de la fertilización (dpi) peces cebra que resulta en el crecimiento rápido de los vasos sanguíneos del pez cebra en el xenoinjerto4.
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Protocolo
1. Preparación de agujas de microinyección
- Encienda un tirador de micropipeta y ajuste los siguientes parámetros (calibrados para el modelo de tirador de micropipeta enumerados en Tabla de materiales:Calor, 680; Tire, 75; Velocidad, 40; Tiempo, 55; Presión: 530.
- Asegure un capilar de vidrio borosilicato en el tirador de micropipetas y tire del capilar para hacer dos agujas. Repita el procedimiento para tantas agujas como desee.
2. Cultivo celular para la implantación
NOTA: Cuando se utiliza este protocolo, cualquier línea celular de cáncer de mamífero sin ....
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Resultados
Mediante la toma de imágenes de un xenoinjerto individual a 6, 24 y 48 hpi, la respuesta angiogénica en diferentes puntos de tiempo se puede calcular como se muestra en la Figura 1A-C. La respuesta angiogénica más grande se observa entre 24-48 h después de la implantación, con los niveles máximos de vascularización del injerto observados alrededor de 2 dpi (Figura1A-C). Una película de lapso de t.......
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Discusión
El primer paso crítico en el protocolo es la implantación de células tumorales. Es esencial que las células se inyecten en un lugar que permita que el xenoinjerto se implante con éxito en el embrión sin hacer que el embrión sea edematoso. Una inyección demasiado anterior puede permitir que las células se muevan hacia el corazón, bloqueando el torrente sanguíneo y provocando edema, mientras que una inyección demasiado posterior dará lugar a un xenoinjerto mal implantado. Una inyección anterior se evita mejor insertando la.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos al Sr. Alhad Mahagaonkar por administrar las instalaciones de peces cebra de la Universidad de Auckland y la Unidad de Investigación de Imágenes Biomédicas de la Facultad de Ciencias Médicas de la Universidad de Auckland, por su asistencia en la microscopía confocal de lapso de tiempo. Este trabajo fue apoyado por una subvención del proyecto del Consejo de Investigación Sanitaria de Nueva Zelanda (14/105), una Beca de Proyecto del Fondo Marsden de la Royal Society of New Zealand (UOA1602) y una Beca de Proyecto de la Fundación de Investigación Médica de Auckland (1116012) otorgada a J.W.A.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Cilindro de aire | BOC | 011G | Xenotrasplante |
| Células B16-F1 | ATCC | Cultivo celular | |
| BD Matrigel Libre de LDEV (mezcla de matriz extracelular) | Corning | 356235 | Xenotrasplante |
| Capilares de vidrio de borosilicato | Warner Instruments | G100T-4 | OD = 1,00 mm, ID = 0,78 mm, Longitud = 10 cm |
| Célula de inyección plato de cultivo de 35 mm de diámetro | Thermofisher NZ NUN153066 | Cría de peces | |
| Plato de cultivo celular de 100 mm de diámetro | Sigma-Aldrich | CLS430167-500EA | Cría de peces |
| Matraz de cultivo celular de 75 cm2 | In Vitro Technologies | COR430641 | Cultivo celular |
| CellTracker Green | Invitrogen | C2925 | Etiquetado de células, concentración de existencias (10 mM en DMSO), concentración de trabajo (0,2 μ M en medios sin suero) |
| Dimetilsulfóxido | Sigma-Aldrich | D8418 | Tratamiento farmacológico, Marcaje celular |
| E3 Medio (60x en 2 L de agua) 34,8 g NaCl 1,6 g KCl 5,8 g CaCl2· 2H2O 9,78 g MgCl2· 6H2O ajustar a pH 7.2 con NaOH | En casa [1] | Cría de peces | |
| Etil-3-aminobenzoato metanosulfonato (Tricaína) | Sigma-Aldrich | E10521 | Xenotrasplante, Imagen |
| Punta de filtro 1,000 μ L | VWR | 732-1491 | Se utiliza durante varios pasos |
| Punta de filtro 200 μ L | VWR | 732-1489 | Se utiliza durante varios pasos |
| Punta de filtro 10 μ L | VWR | 732-1487 | Se utiliza en varios pasos |
| Microscopio de fluorescencia | Leica | MZ16FA | Preparación de embriones |
| FBS (origen NZ) | Thermofisher Scientific | 10091148 | Guantes de cultivo celular |
| Cualquier marca | Se utiliza durante varios pasos | ||
| Hemotómetro Cámara de recuento de células Neubauer | HawksleyVet | mejoradoAC1000 | Xenotrasplante |
| Heraeus Multifuge X3R Centrífuga | Thermofisher Scientific | 75004500 | Cultivo celular, Marcaje celular |
| Hoechst 33342 | Thermofisher Scientific | 62249 | Etiquetado celular, Concentración de stock (1 mg/ml en DMSO), concentración de trabajo (6 μ g/ml en medios sin suero) |
| Bajo punto de fusión, Agarosa ultrapura Thermofisher | Scientific | 16520050 | Imaging |
| Metilcelulosa | Sigma-Aldrich | 9004 67 5 | Xenotrasplante |
| Azul de metileno | sigma-Aldrich | M9140 | Microcargador de cría |
| de peces 0.5-20 μ Punta de pipeta en L para la carga de microcapilares | Eppendorf | 5242956003 | Xenotransplantation |
| Micropipetas | Cualquier marca | Se utiliza durante varios pasos | |
| Extractor de micropipetas P 87 | Sutter Instruments | Xenotransplantation Incubadora | |
| jaula para microscopio | Okolab | Imágenes time-lapse | |
| Microondas | Cualquier marca comercial | Imagen | |
| Aceite mineral | Sigma-Aldrich | M3516 | Xenotrasplante |
| Medios Esenciales Mínimos (MEM) - alpha | Thermofisher Scientfic 12561056 | Cultivo | |
| Celular MPPI-2 Inyector de Presión | Instrumentación | Xenotrasplante | |
| Micromanipulador Narishige | Grupo | NarishigeXenotrasplante | |
| Nikon D Eclipse C1 Microscopio confocal | Nikon | Imaging | |
| N-feniltiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | Cría de peces |
| PBS | Gibco | 10010023 | Cultivo celular |
| Penicilina Estreptomicina | Life Technologies | 15140122 | Cultivo celular |
| S1 llenadora de pipetas | Thermoscientific | 9501 | Cultivo celular |
| Stripette serológico 10 mL | Corning | 4488 | Cultivo celular |
| Stripette serológico 25 mL | Corning | 4489 | Cultivo celular |
| Stripette serológico 5 | mL Corning | 4485 | Cultivo celular |
| Stripette serológico 2 mL | Corning | 4486 | Cultivo celular |
| Aguja Terumo 22 g | Amtech | SH 182 | Cría de peces |
| Incubadora de cultivo de tejidos | Thermofisher Scientfic | HeraCell 150i | Cultivo celular |
| Tivozanib (AV951) | AVEO Pharmaceuticals | Tratamiento farmacológico | |
| cultivo celular | |||
| Fine Science Tools | 11295-10 | Cría de peces | |
| Volocity Software (v6.3) | Improvision/Perkin Elmer | Análisis de imágenes |
Referencias
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Huang, D., et al. Sunitinib acts primarily on tumor endothelium rather than tumor cells to inhibit the growth of renal cell carcinoma. Cancer Rese....
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Reimpresiones y permisos
