Une méthode d'étude de novo Formation des Domaines chromatine

Résumé

Cette méthode est conçue pour suivre la formation de domaines de chromatine à médiation PRC2 dans les lignées cellulaires, et la méthode peut être adaptée à de nombreux autres systèmes.

Résumé

L'organisation et la structure des domaines de chromatine sont uniques aux lignées cellulaires individuelles. Leur mauvaise réglementation pourrait entraîner une perte de l'identité cellulaire et/ou de la maladie. Malgré d'énormes efforts, notre compréhension de la formation et de la propagation des domaines de la chromatine est encore limitée. Les domaines de chromatine ont été étudiés dans des conditions d'état stable, qui ne sont pas propices à suivre les événements initiaux pendant leur établissement. Ici, nous présentons une méthode pour reconstruire inducibly les domaines de chromatine et suivre leur reformation en fonction du temps. Bien que, d'abord appliqué au cas de la formation de domaine de chromatine répressive à médiation PRC2, il pourrait être facilement adapté à d'autres domaines de chromatine. La modification et/ou la combinaison de cette méthode avec la génomique et les technologies d'imagerie fournira des outils précieux pour étudier en détail l'établissement des domaines de la chromatine. Nous croyons que cette méthode va révolutionner notre compréhension de la façon dont les domaines de chromatine se forment et interagissent les uns avec les autres.

Introduction

Les génomes eucaryotes sont très organisés et les changements dans l'accessibilité de la chromatine contrôlent directement la transcription des gènes¹. Le génome contient des types distincts de domaines de chromatine, qui sont en corrélation avec l'activité transcriptionnelle et le calendrier de réplication^2,3. Ces domaines de chromatine varient en taille de quelques kilobases (kb) à plus de 100 kb et sont caractérisés par un enrichissement dans les modifications histone s'agit de distincts⁴. Les questions centrales sont les suivantes : comment ces domaines sont-....

Protocole

Génération de MESC de sauvetage EED inductibles

1. Culture cellulaire

1. Utilisez des cellules souches embryonnaires C57BL/6 sans mangeoire (MESC) possédant un transgène CreERT2 intégré de façon stable, qui peut se transposer au noyau sur l'administration de 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT)¹³.
2. Cultivez des MESC dans le milieu ESC conventionnel^14,15, complété par 1000 U/mL LIF, 1 inhibiteur ERK PD0325901 et 3 inhibiteur sGSK3 CHIR99021. Pour le milieu ESC conventionnel, utilisez le DMEM knock-out contenant 15 % de sérum bovin fœtal ....

Résultats

Un régime général du système de sauvetage conditionnel
La figure 1 montre le schéma de ciblage pour sauver conditionnellement les cellules EED KO avec WT ou cage-mutant (Y365A) EED qui est exprimé à partir du locus EED endogène. Après avoir éliminé EED, une sous-unité centrale de PRC2 essentielle à sa stabilité et à son activité enzymatique, une cassette dans l'intron suivant l'exon 9 de l'EED est introduite (Figure 1). La cassette se compose.......

Discussion

Une approche puissante pour comprendre les détails mécanistes lors de la formation d'un domaine de chromatine donnée, est d'abord perturber le domaine, puis suivre sa reconstruction en cours au sein des cellules. Le processus peut être interrompu à tout moment pendant la reconstruction pour analyser en détail les événements en cours. Les études antérieures sur les domaines de chromatine n'ont pas été en mesure de résoudre de tels événements car ils ont été effectués dans des conditions d'état stable (par exemple, en comp.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
(Z)-4-Hydroxytamoxifène (5 mg)	Sigma	H7904-5MG	Pour l’induction de l’expression de l’EED
Solution aqueuse de paraformaldéhyde à 16 % (10x10 ml)	Microscopie électronique Sciences	15710	Pour l’immunofluorescence
2-mercaptoéthanol	LifeTechnologies	21985-023	Pour la culture de mESC
de gélatine à 2 %	Sigma	G1393-100ml	Pour mESC culture
Accutase 500 ML	Innovative Cell Tech/FISHER	AT 104-500	Pour la culture mESCs
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson immunoresaerch	711-585-152	Pour l’immunofluorescence
Aqua-Mount Montage Medium	FISHER/VWR	41799-008	Pour l’immunofluorescence
CHAMBRE SLD TC PRMA 8-CHM 16 PK	Fisher Sci	177445PK	Pour l’immunofluorescence
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phénylindole, Dichlorhydrate) - 10 mg	Life Tech	D1306	Pour l’inhibiteur d’immunofluorescence
ERK, PD0325901	Stemgent	04-0006	Pour la culture de mESCs
ESGRO Souris recombinante LIF Protein	Millipore/Fisher	ESG1107	Pour la culture de mESCs
FBS Stem Cell Qualified	Atlanta	S10250	Pour la culture de mESCs
Gibson Assembly Master Mix	NEB	E2611L	Pour le clonage de matrice donneuse
Inhibiteur de GSK3, CHIR99021	Stemgent	04-0004	Pour la culture de mESCs
H3K27me2 (D18C8) Signalisation cellulaire de lapin mAB		9728S	Anticorps pour ChIP-seq
H3K27me3	Signalisation cellulaire	9733S	Anticorps pour ChIP-seq
Histone H2Av anticorps (pAb)	Motif actif	39715	Contrôle du pic pour ChIP-seq
Knockout DMEM	Invitrogen	10829-018	Pour la culture de mESCs
L-glutamine	Sigma	G7513	Pour la culture de mESCs
Lipofectamine 2000	LifeTech	11668019	Pour la transfection
MangoTaq DNA Polymerase	Bioline	BIO-21079	Pour le génotypage PCR
Sérum d’âne normal (10 mL)	Jackson ImmunoResearch	017-000-121	Pour l’immunofluorescence
Pénicilline-Streptomycine	Sigma/Roche	P0781	Pour la culture de mESCs
pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)	Addgene	48138	Pour le clonage d’ARNg Solution d’extraction d’ADN
QuickExtract	Lucigen	QE0905T	Pour le génotypage PCR
Triton X-100	Sigma	T8787-250ML
Kit de clonage PCR Zero Blunt	Thermo Fisher	K270020	Pour le clonage de modèles de donneurs
Primers/gBlocks
EED-KO-gRNA-1			Sequence : ctctggctactgtcaactag. Les ARNg s’apparient pour knock-out EED dans C57BL/6 ESCs pour les systèmes i-WT-r et i-MT-r.
Séquence EED-KO-gRNA-2			: TAGGCTATGACGCAGCTCAG. Les ARNg s’apparient pour neutraliser l’EED dans les ESC C57BL/6 pour les systèmes i-WT-r et i-MT-r.
		par l’EED-gRNA	: atggcaccccgaaattagaa. gRNA et donneur pour générer le système i-WT-r dans le contexte EED-KO.
i-WT-r Donor			https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI. gRNA et Donor pour générer le système i-WT-r dans le contexte EED-KO.
		par l’EED-gRNA	: atggcaccccgaaattagaa. gRNA et donneur pour générer le système i-WT-r dans le contexte EED-KO.
i-MT-r Donor			https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM. gRNA et Donor pour générer le système i-MT-r dans le contexte EED-KO.
Genotyping Primers
Gnt-EED-KO-FW-1			Séquence : ctgtaggctgccatctgtga. L’allèle de type sauvage produira un produit de 1,9 kb. L’allèle knockout produira un produit de 200 pb.
Gnt-EED-KO-REV-1			Séquence : agccagggctacacagagaa. L’allèle de type sauvage produira un produit de 1,9 kb. L’allèle knockout produira un produit de 200 pb.
Inducible_Genotype-FW-1			Séquence : tgcagtgaaacaaatttggaa. Lorsque la casette est insérée, les amorces produiront 1863 pb. L’allèle de type sauvage produira un produit de ~200 pb.
Inducible_Genotype-REV-1			Séquence : gagaggggtggcactgtaaa. Lorsque la casette est insérée, les amorces produiront 1863 pb. L’allèle de type sauvage produira un produit de ~200 pb.
Inducible_Genotype-FW-2			Séquence : ccccctctttctctctctttttttct. Lorsque la casette est insérée, les amorces produiront 3200 pb. L’allèle de type sauvage produira un produit de 1560 pb.
Inducible_Genotype-REV-2			Séquence : atgcctgggtgaatgaaaaa. Lorsque la casette est insérée, les amorces produiront 3200 pb. L’allèle de type sauvage produira un produit de 1560 pb.

Solution Séquence induite Séquence induite