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Utilisation des cellules Drosophila S2 pour l'imagerie en direct de la division cellulaire

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DOI :

10.3791/60049

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23 août 2019

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1Department of Biology, University of New Mexico

Dans cet article

Résumé

Les divisions cellulaires peuvent être visualisées en temps réel à l'aide de protéines étiquetées fluorescentes et de microscopie en accéléré. En utilisant le protocole présenté ici, les utilisateurs peuvent analyser la dynamique de synchronisation de division cellulaire, l'assemblage mitotique de fuseau, et le congrès et la ségrégation de chromosome. Les défauts dans ces événements suivant l'interférence d'ARN (RNAi)-négocié le gène knockdown peuvent être évalués et quantifiés.

Résumé

Drosophile Les cellules S2 sont un outil important dans l'étude de la mitose dans la culture tissulaire, fournissant des aperçus moléculaires dans ce processus cellulaire fondamental d'une manière rapide et à haut débit. Les cellules S2 se sont avérées favorables aux applications d'imagerie à cellules fixes et vivantes. Notamment, l'imagerie cellulaire vivante peut fournir des informations précieuses sur la façon dont la perte ou le renversement d'un gène peut affecter la cinétique et la dynamique des événements clés au cours de la division cellulaire, y compris l'assemblage de fuseaux mitotiques, le congrès chromosomique et la ségrégation, ainsi que calendrier global du cycle cellulaire. Ici, nous utilisons des cellules S2 poignardée transfecté avec fluorescent marqué mCherry: -tubulin pour marquer le fuseau mitotique et GFP:CENP-A (appelé «CID» gène dans Drosophila) pour marquer le centroromere pour analyser les effets des gènes mitotiques clés sur le moment de divisions cellulaires, de la prophase (en particulier à la rupture de l'enveloppe nucléaire; NEBD) au début de l'anaphase. Ce protocole d'imagerie permet également la visualisation du microtubule de fuseau et de la dynamique de chromosome tout au long de la mitose. Ici, nous visons à fournir un protocole simple mais complet qui permettra aux lecteurs d'adapter facilement les cellules S2 pour des expériences d'imagerie en direct. Les résultats obtenus à partir de telles expériences devraient élargir notre compréhension des gènes impliqués dans la division cellulaire en définissant leur rôle dans plusieurs événements simultanés et dynamiques. Les observations faites dans ce système de culture cellulaire peuvent être validées et étudiées plus en détail in vivo à l'aide de l'impressionnante boîte à outils d'approches génétiques chez les mouches.

Introduction

La Division cellulaire est un processus essentiel à tous les organismes multicellulaires, à la fois dans leur développement et l'homéostasie1. Drosophila a longtemps été utilisé comme un modèle pour l'étude de la division cellulaire, avec des expériences dans divers types de tissus et des conditions génétiques fournissant des informations clés sur le processus. Tandis que beaucoup de ces perspicacités proviennent des conditions fixes de cellules, la division de cellules est une procédure dynamique avec beaucoup de pièces mobiles, faisant la visualisation des cellules vivantes faisant partie intégrante à évaluer des effets de KNOCK ou génétiques sur de nombreuses parties de la division cellulaire, y compris formation de fuseau, pléinochromosome et ségrégation, et cytokinesis.

De nombreux protocoles ont été développés et utilisés au fil des ans pour visualiser les divisions cellulaires drosophila in vivo. Divers groupes ont cultivé des techniques pour les divisions d'image dans les disques imaginaires larvaires et les cerveaux larvaires2,3,4,5,6,7,8 . Ces techniques, bien qu'utiles pour l'imagerie dans des tissus spécifiques, sont limitées dans le débit et nécessitent souvent la génération et le maintien des stocks génétiques pour générer des composants fluorescents et modifier l'expression des gènes d'intérêt. Les cellules S2 cultivées de Drosophila offrent une alternative de débit plus élevée pour tester rapidement les effets de divers gènes dans la division cellulaire. En outre, avec la capacité de transfect diverses protéines fluorescentes, les cellules S2 peuvent être rapidement modifiées pour déterminer les effets de knockdown d'ARNi sur de nombreux composants de la division cellulaire. Les gènes d'intérêt étiquetés fluorescents peuvent également être observés dans la division cellulaire, permettant une caractérisation dynamique de leur fonction9.

Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour l'imagerie en direct des cellules Mitotiques S2 en utilisant des méthodes que nous avons récemment décrit10. Notre méthode utilise des cellules transfectées stablement avec des marqueurs fluorescents pour les microtubules et les centromères dont l'expression est sous le contrôle d'un promoteur inductible de cuivre (metallothionein; pMT). Cette méthodologie peut être utilisée pour imager le fuseau et la dynamique chromosomique dans toutes les phases de la mitose en utilisant un microscope fluorescent relativement simple avec un logiciel d'imagerie de base. Il peut être encore personnalisé pour répondre aux besoins individuels de recherche, avec la transfection transitoire et l'ARNi offrant des possibilités élargies pour déterminer le rôle des gènes candidats dans la mitose. En raison de la relative simplicité du protocole, il peut être utilisé pour les écrans de perte de fonction à petite échelle pour identifier les gènes pour lesquels une étude plus approfondie in vivo serait bénéfique, permettant des efforts plus ciblés et l'efficacité avec la génétique ultérieure manipulation chez les mouches.

Protocole

1. Préparation des cellules S2 pour le traitement par ARNi

  1. D'une culture de stock de confluent pMT:GFP:CID et pMT:mCherry:-tubulin stably transfected S2 cells (80% viable; grown at 24-28 'C), seed cells in a 6 well sterile culture plate at a density of 1 x 106 cells/mL in fresh, warmed, 10% fetal bovine serum (FBS) a complété les médias d'insectes de Schneider (SIM).
    REMARQUE :     Les cellules S2 transfectées de stably peuvent être générées en suivant un protocole du centre de criblage d'ARNi de Drosophila (DRSC) (https://dgrc.bio.indiana.edu/Protocols?tab=cells). Bien que la ligne S2 stable spécifique utilisée ici utilise GFP et mCherry, de nombreuses alternatives existent à la fois dans ces spectres fluorescents ainsi que d'autres. Une discussion détaillée de ces protéines fluorescentes est au-delà de la portée de ce protocole, mais leurs propriétés et les avantages potentiels / inconvénients ont été savamment examinés ailleurs 11.
    1. À l'aide d'un compteur cellulaire ou d'un hémocytomètre, déterminez la densité du stock de cellules confluentes.
    2. Déterminer le volume de suspension des cellules confluentes nécessaire pour atteindre 1 x 106 cellules/mL dans un volume total de 4 ml (p. ex., 4 x 106 cellules totales). Ajoutez ce volume de stock cellulaire à un volume de SIM frais pour faire 4 mL/puits de volume total. Déterminer la densité du stock cellulaire (cellules/mL) en diluant 100 l de cellules directement à partir du flacon de stock avec 100 l de support et en comptant cette dilution de 1:2 manuellement avec un hémocytomètre ou avec un compteur cellulaire automatique si disponible.
      REMARQUE: Si vous utilisez des cellules S2 non transfectées de façon stable, un test transitoire de transfection avec une étiquette fluorescente (GFP, mCherry, etc.) et un marqueur d'ADN (CENP-A, Histone H2B, etc.) peut être effectué. En outre, des lignées cellulaires transfectées de façon stable avec divers marqueurs de fuseau mitotique et d'ADN sont disponibles auprès du Drosophila Genetics Resource Center qui pourrait mieux répondre aux besoins expérimentaux exacts de l'utilisateur (https://dgrc.bio.indiana.edu/cells/Catalog).
    3. Placer les cellules fraîchement ensemoir dans un incubateur de 24 à 28 oC pendant 36 à 48 h.

2. Traitement des cellules ensedues avec dsRNA contre gene(s) d'intérêt

REMARQUE: L'exemple suivant et la section Résultats utiliseront Shortstop (Shot), un agent de liaison actin-microtubule comme gène d'intérêt. Utilisez un traitement simulé sans dsRNA ou avec dsRNA dirigé contre un gène non pertinent (par exemple, bêta-galactosidase, lacZ) comme un contrôle négatif.

  1. Les médias d'insectes de Warm Schneider ne sont pas complétés par des FBS (Serum free media; SFM) dans un incubateur de 24 à 28 oC.
  2. Transférer les cellules du puits précédemment ensemencé (à partir de l'étape 1.1.2) dans un tube stérile de 15 ml, notant le volume total des cellules transférées.
    1. Conserver un petit volume de cellules (100 l) pour le comptage dans un compteur cellulaire ou un hémocytomètre.
  3. Pelleter délicatement les cellules en centrifuge à 1 000 x g pendant 3 min à température ambiante.
    1. Pendant que les cellules centrifugentes, déterminez la concentration des cellules par mL à l'aide d'un compteur cellulaire ou d'un hémocytomètre. Multipliez ce nombre par le volume total centrifugé (noté en 1,2,2.) pour obtenir le nombre total de cellules.
  4. Aspirez le supernatant des cellules granulées.
  5. Re-suspendre les cellules dans sFM réchauffé pour obtenir une concentration de 3 x 106 cellules/mL.
    1. Transférer 1 ml des cellules suspendues dans un nouveau puits dans une plaque de 6 puits.
  6. Ajouter 10 à 50 g de dsRNA (dilué dans 100 l d'eau exempte de RNAase) contre Shot (ou le gène cible d'intérêt) directement dans les cellules et faire tourbillonner la plaque pour mélanger. Incuber la plaque pendant 1 h dans l'incubateur de 24 à 28 oC pour permettre l'apport direct de dsRNA dans les cellules.
  7. Pendant l'incubation de 1 h, réchauffez la carte SIM complétée à 10 % de FBS dans l'incubateur de 24 à 28 oC.
  8. Après l'incubation des cellules avec dsRNA pendant 1 h, ajouter 2 ml de 10 % FBS complété SIM directement au puits sans enlever les 1 ml de médias.
  9. Placer les cellules dans un incubateur de 24 à 28 oC pendant 3 à 7 jours.
    REMARQUE: Comme avec la concentration de dsRNA, le temps total de traitement peut devoir être optimisé pour le gène cible désiré. Pour évaluer l'efficacité de l'ARNi, effectuer une tache occidentale sur l'ensemble des lysates de la cellule à l'aide d'un anticorps contre le gène cible. Si la séquence cible initiale de dsRNA s'avère inefficace, concevoir dsRNAs alternatifs ciblés sur des séquences uniques dans le gène cible.

3. Induction de l'expression et de la préparation de protéines fluorescentes pour l'imagerie

  1. Si des cellules transfectées de façon stable ont été générées à l'aide du plasmide pMT (contenant un promoteur inductible de la métallothionein) tel que décrit ici, induisez l'expression de protéines fluorescentes en traitant les cellules avec du sulfate de cuivre (CuSO4) à une concentration finale de 500 M pour 24-36 h avant l'imagerie et 4 jours après le traitement de l'ARNi. L'utilisation de plasmides constitutifs d'expression tels que pAct ne nécessite pas l'induction de cuivre.
  2. Préparer les cellules pour l'imagerie
    1. Réchauffez la carte SIM complétée par FBS de 10 % dans l'incubateur de 24 à 28 oC pendant 1 h.
    2. Transférer les cellules dans un tube stérile de 15 ml, en notant le volume total des cellules transférées.
      1. Conserver un petit volume de cellules (100 l) pour le comptage dans un compteur cellulaire ou un hémocytomètre.
    3. Pelleter délicatement les cellules en centrifuge à 1 000 x g pendant 3 min à température ambiante.
      1. Pendant que les cellules centrifugentes, déterminez la concentration (cellules/mL) à l'aide d'un compteur cellulaire ou d'un hémocytomètre. Multipliez ce nombre par le volume total centrifugé (noté en 2.2.2.) pour obtenir le nombre total de cellules.
    4. Aspirez le supernatant des cellules granulées.
    5. Resuspendre les cellules dans frais, réchauffé 10% FBS complété SIM pour obtenir une concentration de 2 x 106 cellules/mL. Ajouter une quantité appropriée de CuSO4 pour maintenir une concentration de 500 M.
    6. Transférer 200-500 l de cellules re-suspendues dans un puits d'une chambre cellulaire vivante multi-puits et placer sur le microscope fluorescent inversé. Laisser les cellules s'installer dans la chambre pendant 15-30 minutes avant les expériences d'imagerie.
      REMARQUE: Les puits de chambre cellulaire en direct peuvent être pré-enduits de poly-L-lysine pour une adhérence supplémentaire.

4. Mettre en place un programme d'imagerie cellulaire en direct

REMARQUE: L'imagerie cellulaire en direct dans cette expérience a été réalisée à l'aide d'un système d'imagerie inversé et de son logiciel associé (p. ex., Olympus IX83 avec le logiciel CellSens Dimensions). Les détails seront différents par fabricant de microscope et paquet de logiciel ; ainsi, les lignes directrices générales et les opérations sont énumérées ci-dessous.

  1. À l'aide du logiciel qui exécute le microscope fluorescent inversé, préparez un programme d'imagerie d'une cellule (ou de cellules) au fil du temps.
    1. Ouvrez le logiciel en cliquant en deux clics sur l'icône de bureau du logiciel.
    2. Créer un nouveau fichier expérimental en cliquant sur Fichier, puis Nouveau fichier expérimental.
    3. Tout d'abord, insérez une boucle time lapse sur laquelle les images seront prises. Pour ce faire, cliquez sur l'icône Stopwatch (time-lapseLoop icône) à partir de la barre d'icône. Placez l'intervalle en s dans l'onglet Experiment Manager, puis placez le nombre de cycles dans le même onglet en divisant la longueur globale de l'expérience souhaitée (en s) par l'intervalle. Laisser la boucle se répéter sur la période de temps totale désirée.
      REMARQUE: Typiquement, les images sont prises tous les 30-60 s sur une période de 3-4 h.
    4. Dans la couche de boucle de laps de temps, insérez une vérification infrarouge de mise au point pour maintenir le foyer de l'objectif (si disponible). Pour ce faire, ajoutez une étape de compensation Z-drift (ZDC) dans la couche Time-lapse Loop en cliquant sur l'icône Square with Two Arrows (Move XY icon) et en sélectionnant z-Drift Compensation dans le menu déroulant.
      REMARQUE: Le terme vérification de la mise au point infrarouge fait référence à un système par lequel une impulsion infrarouge est utilisée pour maintenir une distance constante entre l'objectif et la chambre de diapositive/imagerie. Beaucoup de microscopes ont un tel système, chacun avec leur propre nomenclature propriétaire. Les lecteurs doivent consulter leur manuel d'exploitation ou leur représentant pour obtenir des détails précis sur les noms.
    5. Après la vérification de mise au point infrarouge, ajoutez une étape dans le programme pour prendre une image multicanal (par exemple, FITC pour GFP et TRITC pour mCherry) sur un 3-5 z-stacks en insérant d'abord une étape de pile z, puis en spécifiant le canal. Pour ce faire, ajoutez une couche de groupe multicanal dans la couche de boucle Time-lapse en cliquant sur l'icône Color Wheel (icôneGroupe Multichannel). Ensuite, ajoutez une couche de boucle Z-Stack dans la couche du groupe Multichannel en cliquant sur l'icône à 3 couches (icône deboucle Z-stack). Définir la taille et le nombre de tranches souhaités dans l'onglet Gestionnaire d'expérience et définir l'exposition de chaque canal aussi bas que possible pour minimiser le photoblanchiment.
      REMARQUE: L'intervalle de z-stack, le temps d'exposition, et la transmission pour cent pour des LED peuvent varier. Typique dans ces expériences, utiliser trois z-stacks pris sur une plage de 3 m, donnant un intervalle de 1 m entre chaque pile. Définir le centre de la cellule plutôt que le haut et le bas tend à conduire aux meilleurs résultats. Les images sont ensuite collectées pour chaque canal (s) à une exposition de 50 ms et pour cent de transmission de 50% sans filtre de densité neutre (ND) engagé.

5. Cellules de division d'image utilisant le programme d'imagerie cellulaire en direct

REMARQUE: Les cellules S2 n'ont pas besoin de CO2 et se développent de façon optimale à 23-27 oC. Toute l'imagerie a été exécutée à la température ambiante dans une pièce bien commandée.

  1. À l'aide des oculaires, trouver le coin supérieur (ou inférieur) du puits et concentrer l'objectif (40-60x immersion d'huile) sur les cellules à l'aide du canal mCherry (-tubulin).
  2. Scannez le long du haut (ou du bas) du puits pour vous éloigner du diviseur vertical de puits.
    REMARQUE: L'imagerie trop près des diviseurs de puits peut interférer avec les contrôles de mise au point infrarouge.
  3. Trouvez une cellule (ou des cellules) qui sont en phase G2 ou en phase M (prophase).
    REMARQUE: Ces cellules peuvent être mieux identifiées par l'existence de deux structures microtubules ressemblant à des étoiles (centrosomes) et d'un noyau intact (indiqué par une région circulaire de lumière réfractée à l'intérieur de la cellule), toutes deux facilement distinguées à l'aide de la tubuline (rouge) filtre d'excitation. La sélection des cellules dans l'interphase antérieure, notable par un ou zéro centrosomes facilement visibles, peut avoir comme conséquence le temps perdu dû à un décalage dans la progression de G2/M. Inversement, la sélection des cellules après L'ONÉ empêchera le calcul précis de la synchronisation mitotique et de l'imagerie de l'assemblage précoce du fuseau et de la dynamique chromosomique. En outre, les cellules S2 contiennent souvent des centrosomes de l'année 2. Bien que ceux-ci se regroupe ntent généralement en un fuseau bipolaire12, il est conseillé aux utilisateurs d'éviter ces cellules, sauf si vous le souhaitez autrement pour la conception expérimentale. Les images et la discussion des cellules appropriées à sélectionner peuvent être trouvées dans la section Résultats représentatifs.
  4. Cliquez sur le bouton Afficher en direct pour commencer à afficher les cellules dans l'écran du logiciel. À l'aide du bouton de mise au point fine du microscope, concentrez la cellule (ou les cellules) d'intérêt. Définir la vérification de mise au point infrarouge en cliquant sur le bouton Set Focus.
  5. Lancez le programme d'imagerie time lapse en cliquant sur le bouton Démarrer. Ajustez les histogrammes au besoin en sélectionnant le canal désiré et en ajustant les intensités moyennes de pixels pour voir clairement la cellule (ou les cellules) d'intérêt.
  6. Permettre au programme de fonctionner, en vérifiant la cellule après 15-20 min pour s'assurer que la panne de l'enveloppe nucléaire (NEBD) a eu lieu, qui est déterminée par la disparition de l'obscurité ronde, un endroit réfracté près du centre cellulaire.
  7. Continuez à permettre au programme de fonctionner, en vérifiant par intermittence (toutes les 15-20 min) pour déterminer une fois l'apparition de l'anaphase. Arrêtez le programme à ce stade s'il reste plus de temps dans la période de temps totale et enregistrez le fichier. Alternativement, si les événements pendant la télophase et la cytokinesis sont d'intérêt, permettre au programme d'exécuter un temps suffisant afin d'imager ces processus ainsi.
  8. Effectuer l'analyse de l'ONÉPour au moment de l'anaphase en notant l'heure de l'ENBD (tNEBD)en min et le moment de la séparation initiale du chromosome (tdébut anaphase)dans la min et en soustrayant tNEBD de l'enclenchissement t pour obtenir le NEBD à l'heure de début anaphase pour une cellule donnée.
    1. Pour ce faire, en cliquant sur le bouton d'encadrement et en notant les images où l'ONÉ et l'anaphase débutse se produisent, en les soustrayant pour déterminer le nombre total d'images d'elapse, et en multipliant cela par l'intervalle de temps entre les images.
  9. Continuer la numérisation des cellules pré-divisant pour obtenir plusieurs n pour une condition donnée. Les cellules peuvent être bien représentées dans la chambre cellulaire vivante jusqu'à 12 h après leur installation initiale.

Résultats

Les méthodes que nous décrivons ci-dessus se traduiront par l'identification et la formation image des cellules S2 de Drosophila subissant une division cellulaire. Les cellules qui sont sur le point de se diviser (c.-à-d. juste avant d'entrer en phase M) peuvent être ciblées par la présence de deux centrosomes et d'un noyau intact indiqué par la lumière réfractée et une tache plus foncée dans la cellule lorsqu'elles sont vues dans le canal de la tubuline (figure1, panneaux les plus à gauche, canal rouge; pointe de flèche dans la figure 1A). Nous estimons qu'environ 2-5% des cellules tombent dans cette catégorie, et entre les expériences d'imagerie, nous passons généralement un maximum de 2-3 minutes de numérisation pour une autre cellule qualifiée. L'ONÉ peut être visualisé par la disparition de cette tache sombre, ce qui entraîne la coloration uniforme du cytoplasme (figure1, panneaux marqués "00:00", rouge). Après l'ONÉ, le temps que prend chaque cellule pour former le fuseau, les chromosomes du congrès et les chromosomes de ségrégation peut être mesuré simplement en notant les points de temps de ces événements par rapport à l'ONÉ.

Nous utilisons ces divisions pour évaluer la synchronisation mitotique, en particulier de l'ONÉpour l'anaphase, en notant le point où les chromosomes commencent à se séparer. Une majorité (90%) des cellules induites par le cuivre, exprimées à la fois mCherry : -tubulin et GFP:CID. Un faible pourcentage de cellules (10 %) n'a exprimé qu'un seul marqueur ou l'un ni l'autre. Ces cellules ont été évitées pendant la sélection cellulaire. En règle générale, les cellules S2 affichent l'ONÉ de l'anaphase de la synchronisation de début de 20-30 minutes (figure1A, contrôle). Nous avons ensuite traité des cellules avec dsRNA ciblées contre Shortstop (Shot), une protéine de liaison actin-microtubule que nous soupçonnions peut affecter la dynamique du cycle cellulaire. En effet, à la suite de cellules de renversement de shot ont montré un retard mitotique significatif (figure1B, retard ShotRNAi), avec de nombreuses cellules d'arrestation à la métaphase et ne jamais passer à l'anaphase au cours de l'expérience d'imagerie de 2-3 heures (Figure 1D, Arrestation shotRNAi). Nous avons estimé que ce phénotype de retard/arrêt pourrait probablement être dû à l'activation du point de contrôle d'assemblage du fuseau (c.-à-d. le point de contrôle de phase M). Pour tester directement cette hypothèse, nous avons co-traité les cellules avec dsRNA contre Shot and Rough deal (Rod), un composant important de ce point de contrôle13. Ceci a mené à une suppression du phénotype d'arrestation, ayant pour résultat NEBD aux temps d'anaphase semblables au contrôle (figure 1C, ShotRNAi-RodRNAi). Ainsi, ce protocole d'imagerie en direct nous a permis de conclure que Shot est nécessaire pour la progression en phase M en temps opportun et que sa perte conduit à l'activation du point de contrôle qui retarde ou arrête les cellules mitotiques.

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Figure 1 : L'imagerie en direct révèle des défauts du cycle cellulaire dus à l'activation du point de contrôle mitotique dans les cellules S2.
Dans toutes les conditions, la formation image de cellule vivante a été conduite sur des cellules de S2 poignardéement co-transfected avec GFP inductible : CID et mCherry : Tubulin comme décrit ci-dessus. (A) Les dessins animés illustrent des repères importants pendant la mitose, et les images correspondantes sont montrées à partir de films représentatifs de génotypes indiqués avec des points de temps par rapport à l'ONÉ (t-00:00) indiqué. Les cellules témoins progressent généralement à l'anaphase dans les 20-30 min.Les cellules traitées par ShotRNAi présentent un retard en anaphase NEBD (B ) et subissent fréquemment une capture de métaphase, n'entrant jamais en anaphase dans l'expérience d'imagerie (D). Le cotraitement des cellules avec ShotRNAi et RodRNAi, un composant du point de contrôle d'assemblage du fuseau, supprime le phénotype shot conduisant à une cinétique anaphase de début similaire aux cellules de contrôle (C). Les flèches dans (A) indiquent les structures centrosome 'star-like', et la grande pointe de flèche indique le noyau. Chaque barre d'échelle représente 5 microns. Ce chiffre est adapté et republié avec la permission de10 (https://www.molbiolcell.org/info-for-authors). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Vidéo 1: Time-lapse film de 'Control' S2 cell division. La vidéo montre un film représentatif de la division cellulaire S2 dans le génotype 'Control'. Ce film correspond à la figure 1A. Cette vidéo est adaptée et republiée avec la permission de10 (https://www.molbiolcell.org/info-for-authors). S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo 2 : Film time-lapse de la division cellulaire S2 de ShotRNAi. La vidéo montre un film représentatif de la division cellulaire S2 dans le génotype 'ShotRNAi' qui conduit à un retard mitotique phénotypique. Ce film correspond à la figure 1B. S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo 3 : Film en time-lapse de la division cellulaire S2 de 'ShotRNAi-RodRNAi'. La vidéo montre un film représentatif de la division cellulaire S2 dans le génotype 'ShotRNAi'RodRNAi'. Ce film correspond à la figure 1C. Cette vidéo est adaptée et republiée avec la permission de10 (https://www.molbiolcell.org/info-for-authors). S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo 4: Time-lapse film of arrested 'ShotRNAi' S2 cell division. La vidéo montre un film représentatif de la division cellulaire S2 dans le génotype 'ShotRNAi' qui mène à une arrestation mitotique phénotypique. Ce film correspond à La figure 1D. S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.

Discussion

Identifier une cellule appropriée

La clé de l'imagerie en divisant les cellules S2 consiste d'abord à localiser la cellule appropriée. Le temps peut être gaspillé cellules d'imagerie qui sont pensés à tort pour être prêt à diviser, mais ne parviennent pas à le faire dans un délai raisonnable. Les cellules doivent être identifiées qui ont deux centrosomes distincts et visibles et un noyau intact. Les centrosomes doivent avoir des fibres de microtubule émanant d'eux, leur donnant un aspect "star-like". Un noyau intact réfracte la lumière lors de l'ajustement de la mise au point, et rend également le centre approximatif de la cellule plus sombre en apparence. Le noyau contiendra également les « points » GFP:CID, une autre caractéristique distinctive pour l'aider à identifier. Les cellules avec des centrosomes de 'gt;2, la ponctua de tubulin sans fibres de tubulin émanant d'eux, ou les cellules avec un seul centrosome devraient être évitées. En outre, si deux centrosomes sont visibles, mais qu'un noyau ne l'est pas, l'ONÉa l'a déjà eu lieu et la cellule est trop avancée dans sa division pour être imagenée si une analyse complète de la phase M est souhaitée. Une fois qu'une cellule appropriée est trouvée, la vitesse dans le démarrage de l'imagerie est cruciale car l'ONÉse se produit rapidement (généralement dans les 3-5 minutes) et retarder le début de l'imagerie peut conduire à des occasions manquées. Concentrez la cellule dans le logiciel d'imagerie rapidement de telle sorte que les deux centrosomes sont visibles, ou si les centrosomes sont hors du plan les uns avec les autres, définiz le point focal entre les deux, de sorte que chacun peut être capturé lorsque les piles Z sont recueillies au-dessus et au-dessous du centre défini moment. Une fois concentré, placez immédiatement le décalage entre la scène et la surface de la chambre cellulaire vivante à l'aide de la vérification de la mise au point infrarouge (si disponible) et commencez le programme d'imagerie. Bien que le protocole présenté ici soit spécifiquement conçu pour les expériences évaluant la dynamique DEBD à anaphase, de simples modifications pourraient convenir aux lecteurs qui étudient d'autres événements mitotiques. Pour l'imagerie NEBD-à-métaphase et anaphase-à-télophase, nous suggérons des intervalles de capture d'image de 10 s car ces processus sont fortement dynamiques et se produisent rapidement dans les cellules S2 (5-10 min). La transition de métaphase à anaphase (notre foyer expérimental typique) est un processus plus long (20-30 min) dans les cellules S2, et nous recueillons des images à des intervalles de 30 s. Enfin, la télophase-par-cytokinesis se produit assez lentement dans les cellules de S2, et nous suggérons des intervalles de 60 s fournissant la résolution assez pour ce processus approximatif d'heure-long.

Maintenir l'accent tout au long du programme d'imagerie

Si un dispositif de vérification de la mise au point infrarouge n'est pas disponible, assurez-vous d'éviter de heurter le microscope ou la table sur laquelle il repose, car cela peut entraîner le déplacement de la cellule hors de mise au point pendant le programme d'imagerie, conduisant à des résultats ambigus et inétables. Pré-enduit les puits de chambre cellulaire vivante avec Poly-L-lysine peut aider à l'adhérence cellulaire, ce qui peut aider à éviter le mouvement cellulaire et est particulièrement utile pour les configurations sans contrôles de mise au point infrarouge. En outre, les configurations, y compris les plates-formes absorbantes de choc ou les tables d'air, peuvent aider à éviter que les cellules ne se concentrent. Enfin, certains logiciels ont des fonctions de pause permettant à l'utilisateur de se recentrer et de reprendre le programme.

Imagerie des cellules multiples

Utile à l'accumulation de données est que souvent plusieurs cellules prêtes à se diviser peuvent être placées dans le même champ de vision pour l'imagerie. Cela peut être particulièrement utile pour les expériences dans lesquelles les cellules ont de longues durées de phase M ou une arrestation prolongée (par exemple, des conditions qui induisent l'activation du SAC). Pour ces cellules, nous avons généralement l'image jusqu'à ce que les cellules sont photobleached (environ 2-3 h), mais le calendrier complet des cellules arrêtées devrait être à la discrétion du chercheur. Parfois, les cellules de pré-division multiples peuvent être dans différents plans focaux, auquel cas il peut être utile d'ajouter des z-stacks pour accueillir toutes les cellules. L'ajout de plus de piles z peut également aider à améliorer la résolution. La prudence doit être prise en faisant ceci, cependant, car il exposera des cellules à plus de rayonnement et mènera au photobleaching plus rapide, aussi bien que mener à de grandes tailles de fichier sur des dispositifs de stockage de disque dur.

Éviter le blanchiment de photos et la phototoxicité

Notre méthode décrit des paramètres spécifiques pour les temps d'exposition, les intervalles d'imagerie, les piles z, et la transmission pour cent pour notre source de lumière LED qui fonctionnent généralement pour notre configuration expérimentale et les résultats souhaités. Comme les microscopes et les objectifs expérimentaux peuvent varier, ce qui pourrait bien fonctionner pour notre système peut conduire à un blanchiment prématuré ou phototoxicité chez d'autres. Photodamage peut présenter un manque de mouvement de fuseau, fragmentation de microtubule, dynamique défectueuse de microtubule, et activation prolongée de point de contrôle de fuseau. Une méthode potentielle pour éviter de tels pièges est de limiter le temps d'exposition. La plupart des caméras modernes possèdent maintenant de larges gammes dynamiques, et les histogrammes peuvent être ajustés pour visualiser les structures, même à des expositions très faibles. Une autre technique consiste à augmenter l'intervalle d'imagerie (p. ex., à plusieurs minutes entre les images) de sorte que le nombre de fois qu'une cellule est exposée à la lumière sur un intervalle de collecte total est réduit. Ceci est avantageux en particulier dans l'imagerie pour de plus longues périodes de temps (plusieurs heures), et peut en outre aider à diminuer la taille des fichiers de ces expériences. Limiter le nombre de piles z prises peut également aider à réduire l'exposition à la lumière, en utilisant 2 ou même seulement 1 au lieu de 3. De plus, l'ajustement de la transmission en pourcentage de la lumière (pour les sources lumineuses LED) ou l'utilisation de filtres à densité neutre (ND) (pour les sources de lumière Halogen Lamp et LED) diminueront l'intensité lumineuse et couplés à des temps d'exposition plus longs peuvent préserver la visibilité . En choisissant des cellules avec des centrosomes déjà séparés, l'exposition globale peut être limitée en ce que ces cellules entrent habituellement dans la mitose rapidement (dans une minute ou deux) après le début de la formation image. On peut également limiter le temps que les cellules sont autorisées à être photographiés avant L'ONÉ. Notre laboratoire fixe généralement cette fois à 10 min, mais une limite plus conservatrice peut facilement être imposée par l'utilisateur. En outre, une mesure plus «invasive» que nous recommandons est le traitement avec dsRNA ciblée contre une composante de la SAC (comme Rod ou Mad2). Si un phénotype d'arrestation est dû à des dommages cellulaires non spécifiques (p. ex., la dynamique défectueuse des microtubules), un tel traitement est moins susceptible de supprimer l'arrestation que d'un effet de bonne foi du gène d'intérêt dans l'expérience originale.

Orientations futures

La méthode décrite ici peut être utilisée sur un microscope épifluorescent relativement simple pour imager rapidement les divisions cellulaires vivantes et peut être facilement adaptée à la conception et aux objectifs expérimentaux particuliers d'un chercheur. Plusieurs excellentes méthodes de culture, approches knockdown RNAi, transfection transitoire, et microscopie fluorescence ont été publiés pour S2 et d'autres cellules Drosophila 9,14,15, 16 Annonces , 17. Notre protocole offre quelques avantages. (1) L'utilisation d'une double lignée cellulaire stable (GFP:CID, mCherry: 'Tubulin) marque simultanément deux structures mitotiques clés, évite les tracas et les complications potentielles de la transfection transitoire, et assure que presque toutes les cellules exprimeront des marqueurs fluorescents comme candidats potentiels à l'imagerie. (2) L'adaptation à la mitose s'ajoute aux protocoles publiés examinant la dynamique cytosquelettique dans les cellules motiles et non-divisantes et s'étend à l'examen des événements mitotiques en temps réel. Bien que nous croyions que la nôtre est une technique puissante qui ajoute au répertoire des autres, il peut toujours y avoir des améliorations apportées. Un domaine particulier de la division cellulaire que nous avons trouvé difficile à image est la division centrosome. Cela se produit avant l'ONÉ Et il est difficile de déterminer quand un seul centrosome est prêt à se séparer en deux. L'utilisation de marqueurs de cycle cellulaire fluorescent (Cyclin A et Cyclin B) pourrait aider à résoudre ce problème, mais se fait au détriment des canaux qui pourraient être utilisés pour visualiser les composants de la division cellulaire. Notre meilleure stratégie pour tenter de visualiser la division centrosome est d'ajouter l'acquisition multipoint au programme d'imagerie (définir différents points dans le plan XY à l'image), mais cela peut entraîner des fichiers volumineux, et peut également exiger (selon le nombre de points) augmenter l'intervalle entre la collecte d'images, en diminuant la résolution temporelle du film résultant. Une autre solution pourrait être la synchronisation des cellules à un stade de cycle cellulaire souhaité à l'aide de médicaments qui ciblent les régulateurs du cycle cellulaire suivie s'ils ont suivi le lavage avant l'imagerie, bien que ces méthodes puissent ne pas être fiables dans les cellules S2 en particulier.

Le protocole présenté ici fournit une base pour de futures applications dans l'imagerie cellulaire vivante ainsi. Grâce à l'amélioration de la technologie d'imagerie et de logiciels, des adaptations vraiment à haut débit de ce protocole utilisant une capacité plus élevée, des plaques à plusieurs chambres pourraient être possibles. De telles innovations rendraient les écrans RNAi à grande échelle, tels que ceux déjà réalisés dans les préparations fixes12,18, plus traitables dans un format de cellule en direct. Les écrans de médicaments à petites molécules pourraient également être envisagés comme un moyen d'identifier de nouveaux composés ciblant les processus de division cellulaire. L'amélioration des fluorophores et des filtres optiques pourrait également mener à l'imagerie de composants mitotiques multiples (pas seulement les deux que nous décrivons), permettant l'imagerie de régulateurs mitotiques spécifiques et de leurs interactions avec l'ADN et/ou le fuseau. Par exemple, la génération de cellules avec des reporters fluorescents qui expriment après les dommages à l'ADN ou pendant l'apoptose serait des outils utiles pour identifier les nouveaux gènes impliqués dans ces processus. Des approches similaires pourraient être utilisées pour examiner la dynamique du cycle cellulaire à l'aide de cyclins étiquetés fluorescents19.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à déclarer.

Remerciements

Ces travaux ont été financés par les National Institutes of Health (R01 GM108756). Nous sommes reconnaissants à Gary Karpen (Université de Californie, Berkeley) pour nous fournir généreusement un gFP:CID S2 stock de lignée cellulaire à partir de laquelle notre GFP:CID / mCherry: Tubulin ligne a été générée10.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Hémacytomètre Bright-LineSigma-AldrichZ359629-1EApour comptage cellulaire
Logiciel d’imagerie cellSensOlympus
CELLSTAR Flacon de culture cellulaire, 50 mL, 25 CM2, PS, Filtre rouge Bouchon à vis, Transparent, Stérile, 10 PCS/BAGGreiner Bio-One690175
CELLSTAR Culture Plaque multipuits, 6 puits, PS, Transparent, TC, Couvercle avec anneaux de condensation, stérile, emballé individuellementGreiner Bio-One657160
Centrifugeuse 5804 ReppendorfCat. 022623508
Sulfate de cuivre(II) pentahydraté, minimum 98 %Sigma-AldrichC3036-250G
Corning Fetal Bovin SerumFisherScientific MT35015CV
Effectene Réactif de transfection 1 mLQiagen301425pour transfection transitoire
IX-83 Microscope épifluorescent inverséOlympus
LabTek Insert de lames chambréesApplied Scientific InstrumentsI-3016
Kit de transcription MEGAscript T7Thermo Fisher ScientificAM1334Pour la production d’ARNdb
MOXI Z Mini Kit de comptage de cellulesautomatisé ORFLOMXZ001pour le comptage de cellules
MS-2000 XY Plat-Top Plat, Automated Stage and ControllerApplied Scientific Instruments
Nunc Lab-Tek II, Verre de protection à chambre (pas de verre borosilicaté 1,5),Thermo Fisher Scientific8
Orca-Flash 4.0 LTCaméra Hammamatsu Photonics, K.K.C11440-42U
pMT/V5-His A Vecteur d’expression de la drosophileThermo Fisher ScientificV412020
Poly-L-LysineCultrex3438-100-01
Purificateur Logic+ Classe II, Type A2 Enceintes de biosécuritéLabconco302310000
Milieu pour insectes de SchneiderSigma-AldrichS0146-100ML
Spectra Tub Tubes à centrifugerVWR470224-998
Uner Counter BOD IncubateurSheldon manufacturing (VWR)89409-346
X-CITE 120 LEDExcelitasTechnologiesSource lumineuse LED
Z -Drift Compensator (ZDC)Olympusinfrared focus check
, , puits 155409 ,

Références

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