Ziel dieses Protokolls ist es, ein 3D-In-vitro-Modell zu etablieren, um die Differenzierung krebsassoziierter Fibroblasten (CAFs) in einer tumormassenähnlichen Umgebung zu untersuchen, die in verschiedenen Analysesystemen wie Immunfluoreszenz, Transkription behandelt werden kann. Analyse und Lebenszellbildung.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Ein 3D-Spheroid-Modell als physiologischeres System für krebsassoziierte Fibroblasten Differenzierung und Invasion In Vitro-Studien
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Definition des idealen Modells für eine In-vitro-Studie ist vor allem bei der Untersuchung physiologischer Prozesse wie der Zelldifferenzierung von entscheidender Bedeutung. Im Tumor stroma werden Wirtsfibroblasten von Krebszellen zur Differenzierung angeregt. So erwerben sie einen Phänotyp, der zur Tumormikroumgebung beiträgt und die Tumorprogression unterstützt. Mit Hilfe des Sphäroidmodells haben wir ein solches 3D-In-vitro-Modellsystem eingerichtet, in dem wir die Rolle von Laminin-332 und dessen Rezeptorintegrin 3-1 in diesem Differenzierungsprozess analysiert haben. Dieses Sphäroid-Modellsystem reproduziert nicht nur die Tumor-Mikroumgebungsbedingungen genauer, sondern ist auch ein sehr vielseitiges Modell, da es verschiedene nachgelagerte Studien ermöglicht, wie z. B. immunfluoreszierende Färbung ender intra- und extrazellulärer Marker sowie abgelagerte extrazelluläre Matrixproteine. Darüber hinaus können Transkriptionsanalysen durch qPCR, Durchflusszytometrie und zelluläre Invasion mit diesem Modell untersucht werden. Hier beschreiben wir ein Protokoll eines Sphäroidmodells zur Bewertung der Rolle des INtegrins von CAFs und seines ektopisch abgelagerten Ligands Laminin-332 bei der Differenzierung und bei der Unterstützung der Invasion von Bauchspeicheldrüsenkrebszellen.
Einleitung
Die Tumormikroumgebung ist eine sehr komplexe Nische und extrem wichtig für die Erhaltung und Progression der Tumorzellen1. Es wird nicht nur von den Krebszellen, sondern auch von stromalen Fibroblasten gebildet. Die Tumorzellen sind von einem Stroma umgeben, der spezifisch ist und sich von den Stroma normaler Gewebe2unterscheidet. Laminin-332 ist ein extrazelluläres Matrixprotein, das ektopisch im Stroma verschiedener Tumoren, wie z.B. des Pankreas-Adenokarzinoms3, exprimiert wird. Darüber hinaus verändern sich die biochemische Zusammensetzung des ECM und seine biophysikalischen Eigenschaften, wi....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
1. 3D-Sphäroide als In-vitro-Modell zur Fibroblasten-/CAF-Differenzierung unter Verwendung verschiedener TGF-1-Hemmverbindungen der Zell-Matrix-Wechselwirkung
- Mischen Sie 1 Teil von 6 mg/ml Methylcelluloselösung und 3 Teile der Zellkulturmedien, MEM ergänzt mit 1% hitzeinaktiviertem fetalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin/Streptomycin, um die Sphäroidbildungslösung zu erhalten.
- Resuspend frisch aufgetaut verewigte normale Fibroblasten (iNFs), verewigte CAF (iCAFs) oder Integrin 3-1 KO iCAF (Durchgang bis zu 25) in der Sphäroid-Formationslösung. Wenn Sie eine 96-Well-Platte vorbereiten, bereiten Sie einen Überschuss an Sphäroid-Bildungslösung, 1....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Die Ergebnisse dieses experimentellen Entwurfs werden in Martins Cavaco et al.13veröffentlicht, was für die weitere Lektüre der Schlussfolgerungen, die aus diesen Experimenten gezogen wurden, empfohlen wird.
Abbildung 1, ein repräsentatives Bild eines immunfluoreszierenden Sphäroids, zeigt die Immunfärbung der Integrin-Untereinheit 3 von sowohl verewigten normalen Fibroblaste.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Die Entwicklung eines geeigneten In-vitro-Modells zur Untersuchung der CAF-Differenzierung ist eine schwierige Aufgabe. Nach der Anwendung verschiedener Ansätze kamen wir zu dem Schluss, dass ein 3D-Sphäroidmodell das praktischere, physiologischere und klinisch relevantere Modell ist, bei dem das Zusammenspiel von Pankreaskarzinomzellen mit verewigten CAFs untersucht werden kann. Dieses Modell verhinderte eine spontane Differenzierung von Fibroblasten aufgrund artefakter Stressoren wie Steifigkeit des Zellkulturkunststof.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt. Dieses Material spiegelt nur die Ansichten des Autors wider, und die Europäische Union haftet nicht für jegliche Verwendung der darin enthaltenen Informationen.
Danksagungen
Wir würdigen Barbara Scheddings Hilfe bei der Vorbereitung des BM2 und lebein-1. Wir würdigen, dass er ihre Expertise in Sphäroid-Assays geteilt hat. Wir danken Sonja Schelhaas und Michael Schäfers für ihre Hilfe beim Umgang mit lentiviraler Transfektion unter S2-Bedingungen. Wir würdigen Sabine von Rüdens Unterstützung bei der Vorbereitung von CAFs aus Bauchspeicheldrüsenkrebsgewebe.
Die Zu diesem Ergebnis führten Forschungsarbeiten wurden aus dem People-Programm (Marie-Curie-Maßnahmen) des Siebten Rahmenprogramms der Europäischen Union RP7/2007-2013/ im Rahmen der REA-Zuschussvereinbarung n. (316610) an J.A.E. finanziert. Darüber hinaus w....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 4',6-Diamidino-2-phenylindol, Dihydrochlorid (DAPI) | SIGMA-ALDRICH | D9542-10 | |
| 6F12 anti-Laminin β 3 Untereinheiten Maus (monoklonal) | Hausgemachtes | ||
| A3IIF5 Anti-α 3 Integrin-Untereinheit Maus (monoklonal) | Mit freundlicher Verfügung gestellt von Prof. M. Hemler, Dana Faber-Cancer Institute, Boston | ||
| Aceton | SIGMA-ALDRICH | 32201 | |
| Albuminfraktion V - BSA | AppliChem | A1391 | |
| Alexa Fluor 488 Ziege (polyklonal) Anti-Maus | Invitrogen | A11029 | |
| Alexa Fluor 488 Ziege (polyklonal) Kaninchen | Invitrogen | A11034 | |
| Anti-Laminin & Gamma; 2 Untereinheiten Maus (monoklonal) | Santa Cruz | sc-28330 | |
| Anti-NG2 Kaninchen (polyklonal) Millipore, AB5320 | Millipore | AB5320 | |
| Anti-α-SMA-Cy3 Maus (monoklonal) | SIGMA-ALDRICH | C6198 | |
| AsPC-1 Zelllinie | ATCC | Mit freundlicher Verfügung von Prof. Jörg Haier's Lab | |
| Bench Zentrifuge | Fisher Scientific | 50-589-620 | Sprout |
| BM2 Anti-Laminin & Alpha; 3 Untereinheiten Maus (monoklonal) | Mit freundlicher Verfügung gestellt von Prof. Patricia Rousselle, CNRS, Lyon | ||
| Calciumchlorid (CaCl2) | Fluka | 21074 | |
| Zentrifuge | Thermo Scientific | Multifuge 1S-R | |
| Zentrifugenröhrchen 50 mL | Corning | 430290 | |
| Kollagenase B | Roche | 11088831001 | |
| Kollagen-I, Rattenschwanz | Gibco | A10483-01 | |
| Konfokalmikroskop | Zeiss | LSM 700 und 800 | |
| DMEM (hoher Glukosegehalt 4,5 g/L) | Lonza | BE12-604F | |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| Durchflusszytometer | BD Biosciences | FACSCaliburTM | |
| Gelifizierende Matrix | ThermoFisher Scientific | A1413202 | Matrigel, Geltrex |
| Ziege IgG, Isotyp | DAKO | X 0907 | |
| Pferdeserum | SIGMA-ALDRICH | 12449-C | |
| Humane primäre Pankreasfibroblasten | PELOBiotech | PB-H-6201 | |
| Inkubator | Heraeus | B6060 | |
| Laminin-332 | Biolamina | LN332 | |
| MEM | SIGMA-ALDRICH | M4655 | |
| Mikrotiterplatte, 96 Wells, U-Boden | Greiner Bio-One | 650101 | |
| Objektträger | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Maus IgG, Isotyp | SIGMA-ALDRICH | I8765 | |
| Mehrachsiger rotierender Mischer | CAT | RM5 80V | |
| PANC-I | ATCC | Mit freundlicher Genehmigung von Prof. Jörg Haier's Lab | |
| Paraformaldehyd | Riedel-de Haë n | 16005 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| QuantiTect Reverse Transkriptionskit | Qiagen | 205310 | |
| Ratten-IgG, Isotyp | Invitrogen | 10700 | |
| Reaktionsröhrchen, 1,5 mL | Greiner Bio-One | 616201 | |
| Real-time PCR Cycler | Qiagen | Rotor-Gen Q | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Rotor Gen SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 204074 | |
| RPMI | Lonza | BE12-702F | Glukose zu 4,5 g (0,2 μm Filter) und 1 % Natriumpyruvat hinzufügen |
| TritonX-100 | SIGMA-ALDRICH | X100RS | |
| V&oakute; rtex | Scientific Industries | Vortex-Genie 2 | |
| μ-Slide Angiogenesis, unbeschichtet | Ibidi | 81501 |
Referenzen
- Pietilä, M., Ivaska, J., Mani, S. A. Whom to blame for metastasis, the epithelial-mesenchymal transition or the tumor microenvironment? Cancer Letters. 380 (1), 359-368 (2016).
- Heldin, C. -H., Rubin, K., Pietras, K., Ostman, A. High inters....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
