هذا الهدف من هذا البروتوكول هو إنتاج axolotls الوهمي مع الأطراف الأمامية haploid المستمدة من الأنسجة المانحة Cas9 المغيرة باستخدام تقنيات تطعيم الأنسجة الجنينية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
جيل من الأناكسولوت الشيميري مع أطراف هابلويد متحولة من خلال التطعيم الجنيني
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وهناك مجموعة متزايدة من التقنيات الوراثية والموارد تمكن الباحثين من استكشاف الأصول الجزيئية لقدرة بعض أنواع السلمندر، مثل الأكسولوت، على تجديد أطرافها بأكملها كبالغين. هنا ، نحدد التقنيات المستخدمة لتوليد الأكسولوتات الشيميرية مع الأطراف الأمامية haploid Cas9 المغيرة التي يمكن استخدامها لاستكشاف وظيفة الجينات ودقة تجديد الأطراف. نحن نجمع بين العديد من التقنيات الجنينية والجينية ، بما في ذلك توليد haploid عن طريق التنشيط في المختبر ، وCRISPR / Cas9 mutagenesis ، وتطعيم الأنسجة في بروتوكول واحد لإنتاج نظام فريد للفحص الوراثي haploid في كائن نموذجي للتجديد. تقلل هذه الاستراتيجية من عدد الحيوانات والمساحة والوقت اللازم للتحليل الوظيفي للجينات في تجديد الأطراف. وهذا يسمح أيضا بالتحقيق في وظائف تجديد محددة من الجينات التي قد تكون مطلوبة لعمليات أساسية أخرى، مثل تكوين الأعضاء، ومورفولوجيا الأنسجة، وغيرها من العمليات الجنينية الأساسية. الطريقة الموصوفة هنا هي منصة فريدة لإجراء الفحص الوراثي haploid في نظام نموذج الفقاريات.
المقدمة
تاريخيا، كان تطعيم الأنسجة الجنينية في البرمائيات تقنية هامة لاستكشاف الآليات الأساسية لبيولوجيا النمو والتجدد. يمتلك الأكسولوتل، وهو نوع من السلمندر، قدرة مثيرة للإعجاب على تجديد الأنسجة والهياكل المعقدة مثل الأطراف والأعضاء بعد الإصابة أو البتر. وبالمثل، فإنها يمكن أن تتلقى، دون رفض، ترقيع الأنسجة من أفراد آخرين في مراحل الجنين، والأحداث، والكبار1،2،3. مناطق الأجنة التي تنتج هياكل كاملة مثل الأطراف والذيول والعينين والرؤوس ، والأنسجة الأكثر تحديدًا ، مثل neuroectoderm والسوميتس ، يمكن تطعيمها بين الأجنة لإنتاج الحيوانات الشيمية1،
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على الإجراءات التجريبية المستخدمة في هذا البروتوكول من قبل لجنة رعاية الحيوانات المؤسسية واستخدامها في جامعة ييل (IACUC، 2017-10557) وكانت متفقة مع جميع السياسات والمبادئ التوجيهية الاتحادية التي تحكم استخدام الحيوانات الفقارية. أجريت جميع التجارب على الحيوانات على Ambystoma mexicanum (axolotls) في مرافق في جامعة ييل.
1. جيل الأجنة الديلويد
- الحصول على GFP + الأجنة diploid لتكون بمثابة المضيفين الكسب غير المشروع من خلال التزاوج الطبيعي باستخدام واحد أو اثنين من الآباء gfp 24.
- جمع البيض الديبلويد وضعت حديثا ووضعها في منخل معدني.
- شطف البيض جيدا مع محلول هولترر....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يمكن تمييز الأجنة الهابلويد النامية من الأجنة الدوبلويد من خلال "متلازمة haploid" النمط الظاهري29. في مرحلة الكسب غير المشروع ، تعرض الأجنة الهابلويد انحناءً انحنٍ على طول المحور الأمامي الخلفي والضميمة غير المكتملة لقابس الصفار(الشكل 3A). يمكن استخدام المجهر الفلوري لضمان خلو الأجنة الهابلويدية من التعبير عن GFP المشتق من الناحية الأبوية(الشكل 3B).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هناك عدد قليل من الخطوات الحاسمة في بروتوكولنا لتوليد الكيميرا haploid-diploid أن فني التشغيل يجب أن تنظر في نتائج التطعيم متسقة.
السبب الأكثر احتمالاً لفشل جيل haploid يرجع إلى ظروف التنشيط السيئة في المختبر. يجب استخدام الكميات المناسبة من الحيوانات المنوية المتحركة لتنشيط البيض. لإطالة الحركة، يجب الحفاظ على عينات الحيوانات المنوية دائما عند 4 درجة مئوية. قبل تطبيق أي عينة من الحيوانات المنوية على البويضات، تحقق من صلاحية الحيوانات المنوية باستخدام مجهر مقلوب. لا ينبغي أبدا استخدام الحيوانا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
شكر وتقدير
نود أن نشكر (كاثرين روبرتس) على رعايتها لمستعمرة (أكسولوتل) تم توفير التمويل لهذا العمل من قبل صندوق أبحاث الطب التجديدي للابتكارات في ولاية كونيتيكت (15RMA-YALE-09 و 15-RMB-YALE-01) ومعهد يونيس كينيدي شرايفر الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية (ما بعد الدكتوراه الفردية زمالة F32HD086942).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| # 55 Dumont Fallps | Fine Science | Tools 11295-1 | استخدم فقط مادة Dumostar (يمكن تعقيمها) |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2942-20ML | 20 مل |
| مضاد حيوي مضاد للفطريات 100x | Thermo Fisher | 15240062 | |
| Ciprofloxacin | Sigma Aldrich | 17850-5G-F | |
| Ficoll 400 (polysucrose 400) | bioworld | 40600032-3 | Ficoll 400 |
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1914-250MG | |
| حاضنة التدفئة / التبريد | RevSci | RS-IF-233 | |
| موجهة الغدد التناسلية المشيمية البشرية | Merk | Chorulon | |
| Megascript T7 طقم النسخ | Thermo Fisher | AM1334 | 40 تفاعلا |
| Miroscope Cooling Stage | Brook Industries | مخصص | مخصص |
| NLS Cas9 بروتين | PNAbio | CP01-200 | 4 قوارير من 50 & ميكرو ؛ ز بروتين لكل |
| Plasmocin | Invivogen | ant-mpt-1 | مستوى العلاج |
| <قوي>وصفات< / قوي> | |||
| 1.0x محلول مارك المعدل (MMR) | 0.1 م كلوريد الصوديوم ، 2 ملي كلوريد كلوريد ، 1 ملي ملي MgSO4< / sub> ، 2 ملي CaCl 2< / sub> ، 0.1 ملي EDTA ، 5 ملي هيبس (درجة الحموضة 7.8) ، الرقم الهيدروجيني 7.4 | ||
| محلول هولتفريتر | 40٪ 20 ملي كلوريد الصوديوم ، 0.2 ملي كلوريد الصوديوم ، 0.8 ملي مولار هيدروكلوريد الصوديوم < الفرعي >3< / > ، 0.2 ملي كلوريد المكالسيوم < الفرعي >2< / > ، 4 ملي مولار MgSO4< / sub> ، الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 |
المراجع
- Kragl, M., et al. Cells keep a memory of their tissue origin during axolotl limb regeneration. Nature. 460 (7251), 60-65 (2009).
- Maden, M., Goodwin, B. C. Experiments on developing limb buds of the axolotl Ambystoma mexicanum. <....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
