本实验方案的目标是利用胚胎组织移植技术，产生具有源自Cas9诱变供体组织的单倍体前肢的嵌合体墨西哥钝口螈。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
越来越多的遗传学技术与资源使研究人员能够探究某些蝾螈物种（如墨西哥钝口螈）在成体阶段再生完整肢体能力的分子基础。本文概述了用于构建嵌合型墨西哥钝口螈的技术，其单倍体前肢经 Cas9 诱导突变，可用于探索基因功能及肢体再生的保真度。我们将多种胚胎学与遗传学技术结合，包括体外激活产生单倍体、CRISPR/Cas9 诱变以及组织移植，整合为一套完整的实验流程，从而在再生研究的模式生物中建立一种独特的单倍体遗传筛选系统。该策略减少了肢体再生相关基因功能分析所需的动物数量、空间和时间。同时，该方法还允许研究那些可能在器官发生、组织形态发生及其他重要胚胎过程等必需生物学功能中发挥作用的基因在再生过程中的特异性功能。本文所述方法为在脊椎动物模式系统中开展单倍体遗传筛选提供了一个独特的平台。
引言
历史上，两栖动物胚胎组织移植技术对于探索发育生物学和再生的基本机制具有重要意义。墨西哥钝口螈（axolotl）是一种蝾螈物种，具有在损伤或截肢后再生组织以及肢体和器官等复杂结构的惊人能力。同样令人印象深刻的是，它们在胚胎期、幼体期乃至成体阶段均可接受来自其他个体的组织移植，且不会发生排斥反应1,2,3。在胚胎中，能够发育为完整结构（如肢体、尾部、眼睛和头部）以及更特化的组织（如神经外胚层和体节）的区域，可在不同胚胎之间进行移植，从而产生嵌合体动物1,2,4,5,6。近一个世纪以来，对这类嵌合体动物的研究为再生机制、组织分化、大小调控以及模式形成等关键问题提供了至关重要的见解1,7,8。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
本方案中使用的实验程序已获得耶鲁大学机构动物护理和使用委员会（IACUC，2017–10557）的批准，并符合所有关于脊椎动物使用方面的联邦政策和指南。所有动物实验均在耶鲁大学的设施内对Ambystoma mexicanum（墨西哥钝口螈，axolotl）进行。
1. 二倍体胚胎的制备
- 通过自然交配使用一个或两个gfp亲本获得GFP+二倍体胚胎，作为移植宿主24。
- 收集 freshly laid 的二倍体卵，并将其放入金属筛中。
- 用40% Holtfreter溶液（20 mM NaCl、0.2 mM KCl、0.8 mM NaHCO3、0.2 mM CaCl2、4 mM MgSO4，调pH至7.4）彻底冲洗卵。
- 将卵置于新鲜的40% Holtfreter溶液中，并在12 °C下保存。
注意：应在进行单倍体胚胎制备之前始终先获得二倍体胚胎。
2. 单倍体胚胎的生成
- 雌性配子供体准备
- 在进行体外激活前48小时，将一条性成熟的白色或白/红色荧光蛋白（RFP）雌性墨西哥钝口螈浸入含1 g/L HEPES缓冲的MS-222的4....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
单倍体胚胎可通过其“单倍体综合征”表型与二倍体胚胎相区分29在移植阶段，单倍体胚胎沿前后轴的弯曲程度降低，且卵黄栓封闭不完全。图3A). 可使用荧光显微镜确认单倍体胚胎中无父源性GFP表达图3B).
当移植物洁净时，GFP 表达应主要局限于臂丛神经，即来源于宿主脊髓的神经网络，如图2所示。点状的 GFP 表达也可见于某些单个细胞，这些细胞似乎是感觉神经元以及迁入发育中肢体的血液来源的宿主细胞。当使用 RFP+ 供体时，单倍体移植物肢体将普遍表达 RFP（图1B'）。在整.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
在我们的单倍体-二倍体嵌合体制备方案中，有几个关键步骤需要操作技术人员加以考虑，以获得稳定一致的嫁接结果。
单倍体产生的最可能失败原因是体外激活条件不佳。必须使用适量的活动精子来激活卵子。为延长精子活动力，精子样品应始终保存在 4 °C。在将任何精子样品施加于卵子之前，应使用倒置显微镜检查精子的活力。完全无活动力的精子绝不可使用，精子浓度应调整至 80,000 个活动细胞/mL。在激活步骤中使用过多精子也可能阻碍卵子的正常发育。精子坑（sperm pits）是卵子表面出现的小而深色的凹陷，是精子已穿透卵子的物理标志，通常在施加精子后 20 至 60 分钟内出现。含有十个或更多精子坑的卵子可能无法正常激活。
如果在水中产卵后15分钟内收集未受精卵，将其置于干燥的培养皿中，并在加精前用纸巾彻底吸干，即可激活卵子。或者，如视频所示，也可从经激素注射的雌鱼体内挤出卵子。我们发现，这种"干燥"处理的卵子结果更为稳定，尽管我们通常会同时使用这两种方法。
成功的移植需要.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢Katherine Roberts对墨西哥钝口螈种群的悉心照料。本研究工作得到了康涅狄格州创新再生医学研究基金（15RMA-YALE-09 和 15-RMB-YALE-01）以及尤妮斯·肯尼迪·施莱弗国立儿童健康与人类发育研究所（个体博士后奖学金F32HD086942）的资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| #55 达蒙特镊子 | 精细科学工具公司 | 11295-1 | 仅使用杜莫斯塔材料（可高压灭菌） |
| 两性霉素B | 西格玛-奥德里奇 | A2942-20ML | 20 mL |
| 抗生素-抗真菌素 100倍浓缩液 | 赛默飞世尔 | 15240062 | |
| 环丙沙星 | 西格玛-奥德里奇 | 17850-5G-F | |
| Ficoll 400（聚蔗糖400） | bioworld | 40600032-3 | Ficoll 400 |
| 庆大霉素 | 西格玛-奥德里奇 | G1914-250MG | |
| 加热/冷却培养箱 | RevSci | RS-IF-233 | |
| 人绒毛膜促性腺激素 | 默克 | Chorulon | |
| Megascript T7 转录试剂盒 | 赛默飞世尔 | AM1334 | 40次反应 |
| 显微镜冷却台 | Brook Industries | Custom | Custom |
| NLS Cas9 蛋白 | PNAbio | CP01-200 | 4小瓶，每瓶含50 µg蛋白 |
| Plasmocin | Invivogen | ant-mpt-1 | 治疗浓度 |
| 配方 | |||
| 1.0x 马克氏改良林格液（MMR） | 0.1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 0.1 mM EDTA, 5 mM HEPES (pH 7.8)，调pH至7.4 | ||
| 40% Holtfreter溶液 | 20 mM NaCl, 0.2 mM KCl, 0.8 mM NaHCO3, 0.2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4，调pH至7.4 |
参考文献
- Kragl, M., et al. Cells keep a memory of their tissue origin during axolotl limb regeneration. Nature. 460 (7251), 60-65 (2009).
- Maden, M., Goodwin, B. C. Experiments on developing limb buds of the axolotl Ambystoma mexicanum. <....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
