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Biology

Zelltypspezifische Gene Expression Profiling in der Mausleber

Published: September 17, 2019 doi: 10.3791/60242

Summary

Die Übersetzung der Ribosomenaffinitätsreinigung (TRAP) ermöglicht eine schnelle und effiziente Isolierung der zelltypspezifischen mRNA. Hier zeigen wir eine Methode, die hydrodynamische Schwanzveneninjektion in einem Mausmodell der Leberrepopulation und TRAP kombiniert, um das Expressionsprofil von wiederbevölkerten Hepatozyten zu untersuchen.

Abstract

Die Wiederbesiedlung der Leber nach verletzungen ist ein entscheidendes Merkmal von Säugetieren, das sofortiges Organversagen und den Tod nach Exposition von Umweltgiften verhindert. Ein tieferes Verständnis der Veränderungen in der Genexpression, die während der Repopulation auftreten, könnte helfen, therapeutische Ziele zu identifizieren, um die Wiederherstellung der Leberfunktion bei der Einstellung von Verletzungen zu fördern. Nichtsdestotrotz werden Methoden, um speziell die wiederbevölkerten Hepatozyten zu isolieren, durch einen Mangel an Zellmarkern, begrenzte Zellzahlen und die Fragilität dieser Zellen gehemmt. Die Entwicklung der Übersetzung der Ribosomenaffinitätsreinigung (TRAP) Technologie in Verbindung mit dem Fah-/- Mausmodell, um die Repopulation bei der Einstellung von Leberverletzungen zu rekapitulieren, ermöglicht die Genexpression-Profilierung der Repopulation Hepatozyten. Mit TRAP wird zelltypspezifische sendemRNA schnell und effizient isoliert. Wir haben eine Methode entwickelt, die TRAP mit Affinitäts-basierter Isolierung der Übersetzung von mRNA aus Hepatozyten verwendet, die selektiv das grüne fluoreszierende Protein (GFP)-getaggtes ribosomales Protein (RP), GFP:RPL10A ausdrücken. TRAP umgeht den langen Zeitraum, der für die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung erforderlich ist, die das Genexpressionsprofil verändern könnte. Da nur die wiederbevölkerten Hepatozyten das GFP:RPL10A-Fusionsprotein ausdrücken, ist die isolierte mRNA frei von Verunreinigungen durch die umliegenden verletzten Hepatozyten und andere Zelltypen in der Leber. Die affinitätsgereinigte mRNA ist von hoher Qualität und ermöglicht eine nachgeschaltete PCR- oder High-Throughput-Sequenzierungs-basierte Analyse der Genexpression.

Introduction

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Als wichtigstes Stoffwechselorgan bei Wirbeltieren ist die Leber für Glukosehomöostase, Serumproteinsynthese, Gallensäuresekretion und xenobiotischen Stoffwechsel und Entgiftung verantwortlich. Die Leber besitzt eine außergewöhnliche Fähigkeit, das verletzte Parenchym bei Exposition gegenüber Toxinen zu regenerieren, um sofortiges Leberversagen zu verhindern1. Jedoch, Versagen der Regeneration kann bei der Einstellung von Acetaminophen oder Alkohol Überkonsum auftreten, die zu akutem Leberversagen führen kann2. Darüber hinaus können chronische Leberschäden durch virale Hepatitis-Infektion, Fettleber-Krankheit und Steatohepatitis Leberfibrose, Zirrhose und hepatozelluläres Karzinom3verursachen. Die einzige verfügbare heilende Behandlung für Lebererkrankungen im Endstadium ist die Transplantation, wird aber durch Organmangel begrenzt, wodurch eine effiziente Behandlung für alle Patienten verhindert wird4. Ein besseres Verständnis des Genesungsprozesses nach toxischen Leberverletzungen ist daher entscheidend für die Entwicklung von Behandlungen zur Stimulierung der Regeneration ausreichend, um die Funktion im erkrankten Organ zu retten.

Das am weitesten verbreitete Modellsystem zur Untersuchung der Leberregeneration ist die partielle Hepatektomie bei Nagetieren, bei der ein großer Teil der Leber reseciert wird, um die schnelle Hepatozytenexpansion zu stimulieren5. Jedoch, partielle Hepatectomie rekapituliert Hepatozyten-Expansion nach toxischen Leberverletzungen aufgrund des Mangels an Immunzellinfiltration und Hepatozytenzellnekrose oft bei der Einstellung von akuten Leberverletzungen beim Menschen beobachtet6. Ein geeigneteres System zur Modellierung dieser Form der Organerneuerung ist die Fah-/- Maus, der es an funktionellem Fumarylacetoacetathydrolase (FAH) fehlt, das für den richtigen Tyrosinstoffwechsel erforderlich ist und schwere Leberschäden entwickelt, die zum Tod führen7. Diese Mäuse können in einem gesunden Zustand auf unbestimmte Zeit durch die Behandlung mit dem Medikament Nitisinon im Trinkwasser gehalten werden. Alternativ kann der FAH-Ausdruck durch Transgenabgabe an eine Teilmenge von Hepatozyten wiederhergestellt werden, die sich ausdehnen wird, um die Leber bei Nitisinonentfernung wieder zu bevölkern8.

Um die Genexpressionsänderungen von wiederbevölkerten Hepatozyten zu profilieren, ist ein Werkzeug erforderlich, um replizierende Hepatozyten in der Fah-/- Maus ohne Kontamination durch die benachbarten verletzten Hepatozyten und andere Zelltypen gezielt zu isolieren. Leider ist die fluoreszenbasierte Zellsortierung (FACS) von Hepatozyten schwierig, da (1) die Fragilität der wiederbevölkerten Hepatozyten zu einer schlechten Erholung nach Leberperfusion führt, (2) die Replizieren von Hepatozyten sind sehr variabel in der Größe, was die Isolation einer reinen Population durch FACS schwierig ist, und (3) die Verfahrenszeit von der Leberperfusion bis zur RNA-Isolierung größer als 2 h ist, daher können Genexpressionsprofile erheblichen künstlichen Veränderungen unterzogen werden, bevor Proben erworben werden9.

Alternativ ermöglicht die Expression von Epitop-markierten Ribosomen speziell bei der Wiederbesiedlung von Hepatozyten die schnelle Isolierung der aktiv übersetzenden mRNA, die durch Ribosomen gebunden ist, indem sie unmittelbar nach der Organernte mit Bulk-Leber Gewebelysate. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Translating-Ribosome-Affinitätsreinigung (TRAP)10, gefolgt von RNA-Sequenzierung mit hohem Durchsatz (TRAP-seq), um mRNA gezielt zu isolieren und zu profilieren, um Hepatozyten im Fah-/- Maus9. Die Coexpression von grünem fluoreszierendem proteingetaggtem ribosomalem Protein (GFP:RPL10A) mit FAH ermöglicht die Affinitätsreinigung der Übersetzung von mRNA gebunden durch Polysomen, die GFP:RPL10A enthalten. Diese Methode vermeidet alle Zelldissoziationsschritte, wie Leberperfusion, um zerbrechliche wiederbevölkerende Hepatozyten zu isolieren. Stattdessen nutzt es die Lyse des gesamten Organgewebes und Antikörper, um die RNA schnell gezielt aus den Zielzellen zu extrahieren. Schließlich ermöglicht die Isolierung reichlich vorhandener, hochwertiger mRNA über TRAP-seq nachgeschaltete Anwendungen wie sequenziumierende Analysen, um die dynamische Veränderung der Genexpression während des Repopulation-Prozesses zu profilieren.

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Protocol

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Alle Methoden, die die Verwendung von Mäusen beinhalten, stehen im Einklang mit den Richtlinien des IACUC des Penn Office of Animal Welfare an der University of Pennsylvania.

1. Reagenz-Vorbereitung

  1. Cycloheximid
    1. Um 500 l mit 0,1 g/ml Cycloheximid herzustellen, 50 mg Cycloheximid in 500 l Methanol auszusetzen.
      ACHTUNG: Cycloheximid ist extrem umweltschädlich und kann angeborene Fehlbildungen verursachen. Alle Abfälle und Puffer, die Cycloheximid enthalten, sollten zur ordnungsgemäßen Entsorgung gesammelt werden.
      HINWEIS: Cycloheximid kann bis zu 1 Tag bei 4 °C gelagert werden. Cycloheximid hemmt die Übersetzung.
  2. Dithiothreitol (DTT)
    1. Um 1 ml 1 M DTT zu machen, 0,15 g DTT-Pulver in RNase-freiem Wasser aussetzen.
      ACHTUNG: DTT kann Reizungen der Haut, des Auges und der Atemwege verursachen.
      HINWEIS: DTT ist ein Reinigungsmittel. DTT kann bei -20 °C gelagert werden. Es wird empfohlen, 1 M DTT in Einweg-Aliquots von 50 l zu speichern.
  3. Deoxycholat (DOC)
    1. Um 10% DOC zu machen, 1 g DOC in einem 50 ml konischen Rohr aussetzen und RNase-freies Wasser bis zu 10 ml hinzufügen. Kräftig schütteln, bis sich das Pulver aufgelöst hat.
      HINWEIS: Die 10% DOC-Lösung ist leicht gelb und kann bis zu 1 Jahr bei Raumtemperatur (RT) gelagert werden. DOC wird für die Kernlyse verwendet.
  4. GFP-Antikörper
    1. Aliquot GFP Antikörper bei der ersten Verwendung. Fangen Sie die Aliquots eineinfrieren und bei -80 °C lagern.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, 50 g GFP-Antikörper in Einweg-Aliquoten zu speichern.
  5. B biotinyliertes Protein L
    1. Resuspend biotinyliertes Protein L in 1x phosphatgepufferter Saline (PBS), um die Endkonzentration von 1 g/l zu erreichen.
      HINWEIS: Die resuspendierte Lösung kann bis zu 6 Monate bei -20 °C gelagert werden.

2. Puffervorbereitung

  1. Bovine Serum albumin (BSA) Puffer
    1. Um 50 ml 3% BSA-Puffer zu machen, fügen Sie 1,5 g IgG- und proteasefreies BSA-Pulver in 40 ml PBS gefolgt von Wirbel hinzu. Nachdem die BSA aufgelöst wurde, fügen Sie PBS zu einem Endvolumen von 50 ml hinzu.
      HINWEIS: Der BSA-Puffer kann bis zu sechs Monate bei 4 °C gelagert werden.
  2. Sezierpuffer
    1. Um 50 ml Sezierpufferbestand herzustellen, kombinieren Sie 5 ml 10x Hanks symmetrische Salzlösung (HBSS), 125 l von 1 M 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinethanesulfonsäure (HEPES), 1.750 'L mit 1 m Glucose und 200 l von 1 M NaHCO3. RNasefreies Wasser zu einem Endvolumen von 50 ml hinzufügen.
      HINWEIS: Der Sezierpufferstock kann bis zu sechs Monate bei 4 °C gelagert werden.
    2. Unmittelbar vor der Anwendung 100 g/ml von 0,1 g/ml Cycloheximid hinzufügen und auf Eis halten.
  3. Hochsalzpuffer
    1. Um 50 ml Hochsalzpufferzulage zu machen, fügen Sie 1 ml 1 M HEPES, 8,75 ml 2 M KCl, 500 l von 1 M MgCl2und 500 l mit 100 % Nichtylphenylpolyethylenglykol(Materialtabelle)zu RNase-freiem Wasser hinzu.
      HINWEIS: Der Salzpufferstock kann bis zu sechs Monate bei 4 °C gelagert werden.
    2. Unmittelbar vor der Verwendung 0,5 l/ml von 1 M DTT und 1 l/ml mit 0,1 g/ml Cycloheximid hinzufügen. Den frischen Hochsalzpuffer auf Eis halten.
  4. Salzarmer Puffer
    1. Um 50 ml Salzpufferzulage zu machen, fügen Sie 1 ml 1 M HEPES, 3,75 ml 2 M KCl, 500 l von 1 M MgCl2und 500 l mit 100 % Nichtylphenylpolyethylenglykol zu 44,25 ml RNase-freiem Wasser hinzu.
      HINWEIS: Der salzarme Pufferbestand kann bis zu sechs Monate bei 4 °C gelagert werden.
    2. Vor der Verwendung werden 0,5 l/ml von 1 M DTT und 1 l/ml 0,1 g/ml Cycloheximid hinzugefügt. Den frischen salzarmen Puffer auf Eis halten.
  5. Gewebelysepuffer
    1. Um 50 ml Gewebelysepufferzulage zu bilden, kombinieren Sie 1 ml 1 M HEPES, 3,75 ml von 2 M KCl und 500 l von 1 M MgCl2. RNasefreies Wasser zu einem Finale von 50 ml hinzufügen.
      HINWEIS: Der Sezierpufferstock kann bis zu sechs Monate bei 4 °C gelagert werden.
    2. Fügen Sie 1 Tablette/10 ml EDTA-freier Protease-Inhibitor, 1 l/ml mit 0,1 g/ml Cycloheximid, 10 l/ml RNase-Inhibitoren jeweils unmittelbar vor der Anwendung hinzu. Den frischgewebelysepuffer auf Eis halten.

3. Konjugation von Antikörpern gegen magnetische Perlen

  1. Antikörper
    1. Berechnen Sie die Menge an GFP-Antikörpern, die für alle Proben erforderlich sind, und bereiten Sie sich auf eine zusätzliche Probe vor.
      HINWEIS: Für jede Probe werden 50 g jedes GFP-Antikörper benötigt.
    2. GFP-Antikörper auf Eis auftauen und mit maximaler Geschwindigkeit (>13.000 x g)10 min bei 4 °C drehen und Überstand in ein neues Mikrozentrifugenrohr übertragen.
      HINWEIS: Der Antikörpervorbereitungsschritt kann vor der Perlenvorbereitung durchgeführt und die aufgetauten Antikörper auf Eis gehalten werden. Alternativ kann dieser Teil während der Inkubation der magnetischen Perle und des biotinylierten Proteins L durchgeführt werden.
  2. Magnetische Perlen resuspendieren
    1. Magnetische Perlen (Materialtabelle) durch sanftes Pipettieren wieder aufsetzen.
    2. Verwenden Sie für jede Probe 150 l magnetische Perle. Berechnen Sie das Volumen der magnetischen Perle, die für alle Proben benötigt wird, und bereiten Sie ein zusätzliches vor. Übertragen Sie die resuspendierten Magnetperlen in ein 1,5 ml oder 2 ml Mikrozentrifugenrohr. Wenn für ein Experiment mehr als 1 ml erforderlich ist, teilen Sie den Gesamtbetrag in gleiche Volumina auf.
    3. Sammeln Sie Perlen auf einem magnetischen Ständer für >1 min und entfernen Sie den Überstand. Entfernen Sie das Mikrozentrifugenrohr aus dem magnetischen Ständer und fügen Sie 1 ml PBS hinzu, gefolgt von Pipetten nach oben und unten, um die Perlen zu waschen. Sammeln Sie Perlen auf einem magnetischen Ständer für >1 min und entfernen PBS.
  3. Herstellung von Protein-L-beschichteten Perlen
    1. Verwenden Sie für jede Probe 60 l biotinyliertes Protein L. Wenn Protein L zuvor resuspendiert und bei -20 °C gelagert wird, das Protein L auf Eis auftauen. Wenn Protein L vor der Verwendung resuspendiert wird, nehmen Sie die für alle Proben benötigte Menge und bereiten Sie eine zusätzliche vor.
    2. Fügen Sie das berechnete Volumen des biotinylierten Proteins L zu den resuspendierten und gewaschenen Magnetperlen hinzu. Fügen Sie 1x PBS hinzu, um das Endvolumen 1 ml zu machen, wenn Sie ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr oder 1,5 ml bei Verwendung eines 2 ml Mikrozentrifugenrohrs verwenden. Inkubieren Sie magnetisch Perlen mit biotinyliertem Protein L für 35 min bei RT auf einem Rohrrotator.
      HINWEIS: Antikörper können bei diesem Schritt hergestellt werden, während die Perlen mit biotinyliertem Protein L inkubieren.
    3. Sammeln Sie Protein L-beschichtete Perlen auf einem magnetischen Ständer für >1 min und entfernen Sie den Überstand. Entfernen Sie das Mikrozentrifugenrohr aus dem magnetischen Ständer und fügen Sie 1 ml 3% BSA-Puffer hinzu, gefolgt von einer sanften Pipettierung für mindestens 5 Mal, um das Protein L-beschichtete Perlen zu waschen.
    4. Sammeln Sie beschichtete Perlen auf einem magnetischen Ständer für >1 min und entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie die Waschschritte mit 3% BSA für weitere 4 Mal (insgesamt 5 Mal).
  4. Antikörperbindung
    1. Fügen Sie die berechnete Menge an GFP-Antikörpern in die Protein-L-beschichteten Perlen ein und brüten Sie 1 h bei 4 °C auf einem Rohrrotator.
      HINWEIS: Achten Sie nach der Antikörperinkubation besonders darauf, die Affinitätsmatrix nicht zu überwirbeln.
    2. Bereiten Sie während der Inkubation einen Salzpuffer vor, indem Sie das für alle Proben erforderliche Gesamtvolumen berechnen, und fügen Sie vor der Verwendung 0,5 l/ml von 1 M DTT und 1 l/ml 0,1 g/ml Cycloheximid zu einem Salzpufferstock hinzu.
      ANMERKUNG: Es sind 3 ml Salzpuffer zum Waschen jedes Rohres mit GFP-konjugierten Perlen und 200 l/Probe zur Resuspension der GFP-konjugierten Perlen erforderlich. Frischer Salzpuffer kann für ein paar Stunden auf Eis gehalten werden.
    3. Sammeln Sie die Affinitätsmatrix auf einem magnetischen Ständer für >1 min und entfernen Sie den Überstand. Fügen Sie 1 ml Salzpuffer und sanft Pipette nach oben und unten, um die Affinitätsmatrix zu waschen. Sammeln Sie die Affinitätsmatrix auf einem magnetischen Ständer für >1 min und entfernen Sie den Salzpuffer. Wiederholen Sie die Waschschritte mit salzarmem Puffer noch einmal 2 Mal (insgesamt 3 Mal).
    4. Setzen Sie die Perlen im Salzpuffer wieder aus, so dass jede Probe eine Affinitätsmatrix von 200 l hat.
      HINWEIS: Die Affinitätsmatrix kann bis zu 2 Wochen in 0,02% NaN3 bei 4 °C gelagert werden. Die Affinitätsmatrix sollte schnell im Salzpuffer 3-mal gewaschen und bei 4 °C mindestens 10 min sanft auf einem Rohrrotator resuspendiert werden, wenn die Affinitätsmatrix innerhalb von 1 Woche oder über Nacht hergestellt wird, wenn die Affinitätsmatrix über 1 Woche gelagert wird. Das Protokoll kann nach diesem Schritt angehalten werden.
      ACHTUNG: Natriumazid ist extrem umweltgiftig. Der Kontakt mit Säuren erzeugt giftiges Gas. Alle Abfälle sollten zur ordnungsgemäßen Entsorgung gesammelt werden.

4. Lebergewebe Lyse

  1. Puffervorbereitung und Geräteaufbau
    1. Berechnen Sie die Anzahl der benötigten Mikrozentrifugenrohre, etikettieren und kühlen Sie auf Eis.
      HINWEIS: In der Regel werden für jede Probe sieben 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen benötigt: 1 für die verbleibende sezierte Leber, 4 für 4 ml homogenisiertes Leberlysat und 2 für die Übertragung von Überresten.
    2. Bereiten Sie einen frischen Sezierpuffer vor, indem Sie das für alle Proben erforderliche Gesamtvolumen berechnen und 1 L/ml mit 0,1 g/ml Cycloheximid hinzufügen. Legen Sie den frischen Sezierpuffer auf Eis, um während des Experiments kalt zu bleiben.
      HINWEIS: Für jede Probe sind 10 ml Sezierpuffer erforderlich.
    3. Bereiten Sie einen frischen Lysepuffer vor, indem Sie das für alle Proben erforderliche Gesamtvolumen berechnen und 1 Tablette/10 ml EDTA-freier Proteaseinhibitor, 1 l/ml 0,1 g/ml Cycloheximid und jeweils 10 l/ml RNase-Inhibitoren hinzufügen. Halten Sie den Lysepuffer während des gesamten Experiments auf Eis.
      HINWEIS: Für jede Probe sind 4 ml Lysepuffer erforderlich.
    4. Richten Sie die Gewebemühle (Materialtabelle) so ein, dass die Polytetrafluorethylen (PTFE)-Glasröhren während der Homogenisierung von Leberstücken auf Eis gelegt werden können. 4 ml Kaltlysepuffer in die PTFE-Glasrohre geben.
  2. Wiederbevölkerung der Leberhomogenisierung
    1. Euthanisieren Sie eine 8-12 Wochen alte Fah-/- Maus, die mit dem TRAP-Vektor injiziert und für 1 bis 4 Wochen mit Anästhesie und Zervixdislokation gemäß den anerkannten Tierversuchsrichtlinien wieder aufgefüllt wurde.
    2. Legen Sie die Maus auf eine Sezierplatte und sprühen Sie den Bauch mit 70% Ethanol. Zeltdie haut und peritoneum tief im Bauch mit Zangen und verwenden Sie eine Schere, um einen Querschnitt zu machen. Weiter mit der Schere zu schneiden, um eine breite U-förmige Peritonealklappe zu machen, mit Sorgfalt, um nicht die Eingeweide zu schneiden. Drehen Sie die Peritonealklappe über das Brustbein, um die Leber freizulegen.
    3. Entfernen Sie vorsichtig die Leber mit feiner Schere und Zange und legen Sie das Gewebe schnell in kalten Dissektionspuffer zu spülen. Um gefrorenegewebe zu homogenisieren, bewegen Sie schnell die gewünschte Menge an Lebergewebe in PTFE-Glasröhren mit kalter Lysepuffer, ohne das Gewebe aufzutauen.
      HINWEIS: Das sezierte Gewebe kann blitzgefroren und bei -80 °C gelagert werden, nachdem es mit Einem Sezierpuffer gewaschen wurde. Das Protokoll kann nach diesem Schritt angehalten werden.
    4. Wiegen Sie die Leber auf einer Petrischale und isolieren Sie 200 x 500 mg Leberstücke und bewegen Sie sich in die PTFE-Glasröhren. Legen Sie das restliche Lebergewebe in ein vorgekühltes Mikrozentrifugenrohr und blitzen Sie ein.
    5. Homogenisieren Sie die Proben in einem motorgetriebenen Homogenisator ab 300 U/min, um Hepatozyten für mindestens 5 Striche von der Leberstruktur zu trennen. Senken Sie das Glasrohr jedes Mal, aber achten Sie darauf, dass der Stößel nicht über die Lösung steigen lässt, um eine Belüftung zu verhindern, die eine Proteindenaturierung verursachen könnte.
    6. Erhöhen Sie die Geschwindigkeit auf 900 U/min, um das Lebergewebe für mindestens 12 volle Schlaganfälle vollständig zu homogenisieren.
    7. Das Lysat in die beschrifteten und vorgekühlten Rohre mit nicht mehr als 1 ml Lysat pro 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen geben. Wenn 4 ml Lysepuffer verwendet wird, halten Sie 1 Röhre und Blitz einfrieren die restlichen 3 Röhren.
      HINWEIS: Die Lysate können bis zu 1 h auf Eis gehalten werden, während das nächste Tier seziert und frische Lysate zubereitet werden. Die homogenisierte Leber kann nach dem Lyseschritt eingefroren und bei -80 °C gelagert werden. Es könnte eine 50%ige Abnahme der isolierten RNA geben, wenn gefrorene Lysate verwendet werden. Das Protokoll kann nach diesem Schritt angehalten werden.
  3. Kernlyse
    1. Zentrifugieren Sie das Leberlysat bei 2.000 x g bei 4 °C für 10 min und übertragen Sie den Überstand auf ein neues, vorgekühltes Mikrozentrifugenrohr auf Eis.
    2. Fügen Sie 1/9 des Überstandvolumens von 10% Nonylphenyl-Polyethylenglycol hinzu, um die Endkonzentration 1% Nonylphenyl-Polyethylenglycol zu machen und durch sanfte invertierte Mikrozentrifugenrohre zu mischen.
    3. Drehen Sie die Mikrozentrifugenrohre schnell herunter und fügen Sie 1/9 des Probenvolumens von 10% DOC hinzu, um die Endkonzentration 1% DOC zu machen und durch sanftes Invertieren der Mikrozentrifugenrohre zu mischen. Drehen Sie die Mikrozentrifugenrohre schnell herunter und brüten sie 5 min auf Eis.
    4. Zentrifugieren Sie das Kernlysat bei 20.000 x g bei 4 °C für 10 min und übertragen Sie den Überstand auf ein neues, vorgekühltes Mikrozentrifugenrohr auf Eis.
      HINWEIS: Der mitochondriende Überstand kann für ein paar Stunden auf Eis gelegt werden, während die restlichen Proben gesammelt werden.

5. Immunitizipation

  1. Nehmen Sie für jede Röhre 1% des Gesamtvolumens des Überstandes als Präimmunitizipationskontrolle heraus, um die Zielanreicherung nach der Inkubation mit der Affinitätsmatrix zu vergleichen. Platzieren Sie die Vorimmunitierstitierstifizipationskontrollen über Nacht bei 4 °C, so wie die immunpräzipierten Proben verarbeitet werden.
  2. Fügen Sie jeder Probe 200 L Affinitätsmatrix hinzu. Achten Sie besonders darauf, die Perlen durch sanftes Pipettieren wieder auszusetzen, bevor Sie jeder Probe die Affinitätsmatrix hinzufügen. Inkubieren Sie die Lysate mit Affinitätsmatrix bei 4 °C über Nacht mit sanftem Mischen auf einem Rohrrotator.
    HINWEIS: Das Protokoll kann nach diesem Schritt bis zu einem Tag angehalten werden.

6. RNA-Isolation

  1. Puffervorbereitung und Geräteaufbau
    1. Legen Sie das Magnetgestell mindestens 30 min bei 4 °C, um es vorzukühlen und halten Sie das Rack während des gesamten Experiments auf Eis.
    2. Berechnen Sie die Anzahl der benötigten Mikrozentrifugenrohre und vorchillen Sie auf Eis oder bei 4 °C.
      HINWEIS: In der Regel benötigt jede Probe 1 Mikrozentrifugenröhrchen für die endgültige gereinigte RNA.
    3. Drehen Sie die Rohre aus Schritt 5.2 schnell herunter und sammeln Sie die Perlen, indem Sie sie mindestens 1 Min. auf das Magnetgestell legen. Sammeln oder entsorgen Sie den Überstand in zusätzlichen Mikrozentrifugenrohren.
      HINWEIS: Der gesammelte Überstand, der einen ungebundenen Bruch enthält, kann blitzgefroren und bei -80 °C gelagert werden, um mit dem gebundenen Bruch zur Transkriptionanreicherung nach der Reinigung zu vergleichen. Das Protokoll kann nach diesem Schritt angehalten werden.
    4. Bereiten Sie den Hochsalzpuffer vor, indem Sie dem Hochsalzpufferbestand 0,5 l/ml von 1 M DTT und 1 l/ml 0,1 g/ml Cycloheximid zueinem geben.
      HINWEIS: Für jede Probe sind 5 ml Hochsalzpuffer erforderlich.
  2. RNA-Isolierung
    1. Fügen Sie 1 ml frischen Hochsalzpuffer in jedes Rohr, gefolgt von einer sanften Pipettierung für mindestens 5 Mal, ohne Blasen einzuführen.
      HINWEIS: Unzureichendes Waschen könnte Hintergründe ungebundener Transkripte einführen, während die Einführung von Blasen den ABBAU der RNA beschleunigen könnte.
    2. Sammeln Sie Perlen auf einem magnetischen Ständer für >1 min und entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie die Waschschritte mit hohem Salzpuffer noch einmal 4 Mal (insgesamt 5 Mal).
    3. Entfernen Sie den verbleibenden Hochsalzpuffer und entfernen Sie Mikrozentrifugenrohre aus dem magnetischen Ständer und legen Sie sie 5 min bei RT zum Aufwärmen.
    4. Setzen Sie die Perlen in 100 l Lysepuffer (im RNA-Isolationskit enthalten) mit Deminatriethanol aus.
      HINWEIS: Jedes RNA-Isolations- und Reinigungskit, das das Denaturierungsguanidinthioyanat enthält, kann als Lysepuffer verwendet werden, um gebundene RNA aus der Affinitätsmatrix freizusetzen. Die RNA-Extraktion sollte bei RT verarbeitet werden, da Guanidinthiocyanat bei niedrigen Temperaturen kristallisieren kann.
    5. Wirbeln Sie die Perlen und puffer für mindestens 5 s bei der höchsten Geschwindigkeit, schnell nach unten drehen, um den Puffer auf der Seite des Mikrozentrifugenrohrs zu sammeln und die Perlen mit dem Puffer bei RT für 10 min zu inkubieren, um die perlengebundene RNA in den Lysepuffer freizusetzen.
    6. Sammeln Sie Perlen auf einem magnetischen Ständer für >1 min und sammeln Sie den Überstand, um sofort zur RNA-Reinigung gemäß dem RNA-Reinigungsprotokoll gemäß dem im Kit (Tabelle der Materialien) angegebenen Rna-Reinigungsprotokoll zu gehen.
      HINWEIS: Der Überstand, der die eluierte RNA im Lysepuffer enthält, kann auch bis zu 1 Monat vor der Aufräumarbeiten bei -80 °C gespeichert werden, indem er sich beim Auftauen auf RT erwärmt.
    7. Um eine maximale Qualität der isolierten RNA zu erreichen, führen Sie alle optionalen Schritte einschließlich der DNase-Verdauung und aller RNA-Elutionsschritte durch. Erhitzen Sie den Elutionspuffer des RNA-Isolationskits oder RNase-freies Wassers auf 60 °C für maximale RNA-Rückgewinnung.
      HINWEIS: Die isolierte RNA kann bei -20 °C für bis zu 1 Monat oder -80 °C für mehrere Jahre gelagert werden. Das Protokoll kann nach diesem Schritt angehalten werden.

7. Optionale RNA-Qualitätsanalyse (empfohlen)

  1. Bewerten Sie die RNA-Qualität mit einem Bioanalysator11 und die Menge mit einem Spektralphotometer12, um festzustellen, ob eine Wiederholung des Immunpräzipitationsprozesses erforderlich ist, um eine ausreichende und qualitativ hochwertige RNA zu erhalten.
    HINWEIS: Die optimale RNA-Qualität für die Sequenzierung mit hohem Durchsatz sollte den Protokollen folgen, die von Bibliotheksvorbereitungskits und Sequenzierungsplattformen festgelegt werden.

8. Nachgelagerte Anwendungen

HINWEIS: Die durch das TRAP-Protokoll isolierte Gesamt-RNA kann in einer Reihe von nachgeschalteten Standardanwendungen verwendet werden, einschließlich RNA-seq (TRAP-seq). Standard-Reverse-Transkription und quantitative PCR-Protokolle können auch nach TRAP verwendet werden.

  1. Führen Sie für TRAP-seq die RNA-seq-Bibliotheksvorbereitung nach den Standardmethoden13durch.
  2. Für RNA-seq bereiten Sie cDNA-Sequenzierungsbibliotheken mit kommerziellen RNA-Seq-Kits mit oligo d(T)-basierter Anreicherung polyadenylierter Poly(A)-Transkripte vor. Wenn die rna-Gesamtqualität niedriger ist als für die Poly(A)-Anreicherung empfohlen, verwenden Sie rRNA-Erschöpfungsmodule. Erwarten Sie jedoch, dass nach der Sequenzierung mehr rRNA-Ausrichtung angezeigt wird.

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Representative Results

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Um die Genexpression in wiederbevölkerten Hepatozyten der Fah-/- Maus, Gfp:Rpl10a-Fusion und Fah-Transgenes zu profilieren, werden sie innerhalb eines transposonhaltigen Plasmids8 (TRAP-Vektor) hydrodynamische Injektion (Abbildung 1A). Die Entfernung von Nitisinon induziert eine giftige Leberverletzung, die einen Selektionsdruck für Hepatozyten schafft, die STABIL FAH ausdrücken, um das verletzte Parenchym9wieder zu bevölkern. Die Immunfluoreszenzfärbung bestätigt die Koexpression von FAH und dem GFP:RPL10A-Fusionsprotein bei repopulierenden Hepatozyten nach zwei Wochen Leberrepopulation (Abbildung 1B).

Im folgenden repräsentativen Experiment wurde TRAP-seq mit ruhe- und wiederbevölkernden Maushepatozyten durchgeführt. Zuerst wurden transgene RosaLSL-GFP-L10A-Mäuse 7 Tage vor dem Opfer mit AAV8-TBG-Cre injiziert, um GFP:RPL10A-Expression in allen Hepatozytenzuinduzieren. Wir verarbeiteten auch eine Leberprobe, die von einer Wild-Typ-Maus als negative Kontrolle gesammelt wurde, um sicherzustellen, dass die Isolierung der Übersetzung von mRNA spezifisch war, was bedeutet, dass RNA nur von Mäusen extrahiert werden konnte, die GFP:RPL10A exzessizieren. Die Konzentration der isolierten RNA korrelierte mit der Anzahl der Zellen, die das Fusionsprotein exprimieren, wobei die ruhende Probe den höchsten Ertrag seit allen Hepatozyten ausdrückt GFP:RPL10A nach AAV8-TBG-Cre-Injektion (Abbildung 2A). Umgekehrt war kaum rna in Wildtyp-Kontrollen nachweisbar, die nicht über das GFP:RPL10A-Transgen verfügten, was darauf hindeutet, dass das TRAP-Verfahren sehr spezifisch ist und einen niedrigen Hintergrund hat. Als TRAP auf Lebergewebe angewendet wurde, das mit GFP:RPL10A-transduced Hepatozyten wieder belebt wurde, wurde reichlich, qualitativ hochwertige RNA erhalten (Abbildung 2B). Im Gegensatz dazu wurde keine RNA-Spur über Bioanalyzer für die negative Kontrollprobe nachgewiesen.

Die nachgeschaltete Genexpressionsanalyse kann über Reverse Transkription und quantitative PCR oder RNA-seq auf TRAP-isolierter RNA durchgeführt werden. Gsta1 kodiert Glutathion S-Transferase, die eine wichtige Rolle für den Stoffwechsel von Glutathion spielt, das wichtigste entgiftende Peptid, um die Leber vor oxidativen Stressschäden zu schützen15. Die Gsta1-Expression wird durch mehr als das 10-fache bei der Wiederbesiedlung von Hepatozyten im Vergleich zu stillen Hepatozyten induziert, während kein Schwellenwert (Ct) mit TRAP-isolierter RNA von der Wild-Typ-Maus aufgrund des Mangels an Eingangs-RNA nachgewiesen wurde (Abbildung 3 A). Beachten Sie, dass die RNA-Qualität die Genexpressionsanalyse stark beeinflussen kann. Bei RNA-Seq-Experimenten sollte die Beurteilung der RNA-Qualität gemäß den Empfehlungen des Bibliotheksvorbereitungskits und der Sequenzierungsplattform durchgeführt werden (Abbildung 3B). Ein Bioanalysator wird häufig verwendet, um die RNA-Integritätsnummer (RIN) zu bestimmen, wobei eine hohe RIN mit einer höheren Rate von mRNA-Ausrichtungen zum Genom korreliert(Abbildung 3B, links), während eine niedrigere RIN zu einer höheren Rate von ribosomalen Lesevorgängen führt, was auf mRNA-Abbau (Abbildung 3B, rechts). Abbildung 3 C,D zeigt, dass TRAP-seq die Differentialgenexpression in ruhenden und wiederbevölkerten Hepatozyten identifizieren kann. Zum Beispiel wird die Alb-Expression gehemmt und die Afp-Expression wird während der Leberrepopulation hochreguliert, was darauf hindeutet, dass die replizierenden Hepatozyten einen weniger differenzierten Zustand annehmen, um die Stoffwechselfunktionen der Leber während der Wiederbesiedlung9,16.

Figure 1
Abbildung 1: Implementierung von TRAP mit Fah-/- zur Profilierung der Genexpressionsänderung von wiederbevölkerten Hepatozyten. (A) Schematisch zum Ausdruck des GFP:RPL10A-Fusionsproteins mit FAH im Dornröschen-Transposonsystem gefolgt von injektionin dieFah-/- Maus. Grüne Sechsecke weisen auf wiederbevölkerte Hepatozyten mit stabilem Ausdruck von FAH und GFP:RPL10A hin, während schwarze Sechsecke verletzte, sterbende Hepatozyten darstellen. (B) Repräsentative Immunfluoreszenzfärbung zeigt die Koexpression des GFP-markierten ribosomalen Proteins L10A (grün) und FAH (rot) in den wiederbevölkerten Hepatozyten. Maßstabsleiste = 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: TRAP ermöglicht die zelltypspezifische Isolierung hochwertiger RNA. (A) Die Ausbeute der RNA korreliert positiv mit der Anzahl der Hepatozyten, die GFP:RPL10A exzessiieren. Die geringe Ausbeute von RNA aus einer Wild-Typ-Maus demonstriert die Spezifität von TRAP aus Quellen ohne die Expression von GFP:RPL10A. (B) Bioanalyzer-Spuren der gesamten RNA, die aus repopulating lebers exemittiert wird, die GFP:RPL10A exdrücken, und von Wildlebern zeigen die Spezifität von TRAP. Die gesamte RNA, die aus wildem Lebergewebe ohne das GFP:RPL10A-Transgen isoliert wurde, zeigt, dass minimale RNA gesammelt wurde, während transgenexzessierendes Gewebe reichlich hochwertige RNA liefert. Beachten Sie, dass ribosomale RNA-Peaks nach erfolgreichem TRAP10vorhanden sind. FU, Fluoreszenzeinheit. RIN, RNA-Integritätsnummer. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: TRAP-isolierte RNA kann für die nachgeschaltete Genexpressionsanalyse verwendet werden. (A) Repräsentative Reverse-Transkription und quantitative PCR-Ergebnisse von Gsta1 in ruhenden und wiederbevölkerten Hepatozyten. Es wurde kein Ct-Wert mit RNA festgestellt, die von Wildtieren isoliert wurde. (B) Ausrichtungsanalyse isolierter RNA nach Hochdurchsatzsequenzierung, was zeigt, wie wichtig es ist, die RNA-Integrität nach der Isolierung zu bestimmen. Hochwertige RNA führt zu einem höheren Anteil an mRNA-Lesevorgängen (grün), während minderwertige RNA zu einem viel höheren Prozentsatz an Ribosom-Lesevorgängen (rot) führt, da die meisten mRNA abgebaut werden. RIN, RNA-Integritätsnummer. (C,D) Integrative Genomics Viewer (IGV) Spuren von RNA-seq liest von mRNA Affinität-gereinigt von ruhe- und wiederbevölkernden Hepatozyten an der (C) Alb und (D) Afp loci. Beachten Sie, dass die Leseverzerrung 3' typisch für eine Poly(A)-Auswahlpipeline ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

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TRAP-seq ist eine Technik zur zelltypspezifischen Isolierung der Übersetzung von mRNA über epitopgetaggte Ribosomen und stellt eine Alternative zu FACS-Ansätzen dar, da sie Beschränkungen wie den Zeitbedarf von FACS9umgeht. Stattdessen ermöglicht TRAP eine schnelle und effiziente Isolierung von RNA direkt aus Schüttgewebe n. Chr. und hilft, Veränderungen in der Genexpression zu vermeiden. TRAP-seq eignet sich besonders gut für den Einsatz in der wiederbevölkernden Fah-/- Mausleber, da die Hepatozytenexpansion nach Entfernung von Nitisinon zellautonom ist und die Genexpressionsprofilierung der Teilmenge von Hepatozyten mit integrierter transgenes. Der TRAP-Vektor kann auch mit genaktivierenden oder -silencierenden Molekülen17,einschließlich cDNA, Kurzhaar-RNA und Guide-RNA, koexprimiert werden, um die Auswirkungen der Aktivierung oder Hemmung eines bestimmten Gens auf die globale Genexpression zu untersuchen. Alternativ bietet die transgene Maus RosaLSL-GFP-L10A die Möglichkeit, die Genexpression in jeder Zelle mit Cre-Rekombinantase-Aktivität zu profilieren. Da GFP:RPL10A spezifisch in allen Zellen exprimiert werden kann, die Cre exprimieren, könnte die Rolle anderer Zelltypen in der Leber während leberverletzungen und Repopulation untersucht werden. Zum Beispiel könnte die Kreuzung der CK19-Cre-Maus mit der trap transgenen Maus verwendet werden, um GFP:RPL10A in Cholangiocyten auszudrücken, gefolgt von TRAP-seq, um die Veränderung der Genexpression im Gallenepithel während des Repopulation-Prozesses zu untersuchen.

Um eine genaue Profilierung der Genexpression zu gewährleisten, ist es wichtig, alle Puffer und die Affinitätsmatrix vor der Gewebesektion vorzubereiten. Alle Schritte sollten auf Eis mit kalten Puffern durchgeführt werden, sofern nicht anders angegeben, um polysome Stabilisierung10 zu gewährleisten und DEN RNA-Abbau zu verhindern. Alle Puffer sollten mit RNase-freien Reagenzien hergestellt werden und das TRAP-seq-Protokoll sollte in einer RNase-freien Umgebung durchgeführt werden, um den RNA-Abbau und die geringe Ausbeute immunpräzipierter RNA zu verhindern. Die Affinitätsmatrix kann bis zu 2 Wochen vor gebrauchensweise mit sanfter Resuspension an einem Rohrrotator über Nacht vorbereitet werden. Besondere Vorsicht ist geboten, um die Matrix nicht energisch zu schütteln, um eine Störung der antikörperkonjugierten, proteinl-beschichteten Magnetperlen zu verhindern. Die Methoden zur Herstellung der Affinitätsmatrix umfassen die Konjugation von magnetischen Perlen mit dem biotinylierten Protein L, gefolgt von einer Inkubation mit Anti-GFP-Antikörpern. Allerdings können kommerziell erhältliche Protein-A/G-Magnetperlen ersetzt werden; wenn verwendet, überspringen Sie den ursprünglichen Konjugationsschritt und fahren Sie direkt mit der Antikörperbindung fort. Darüber hinaus sind alternative Epitop-Tags vermutlich mit dem obigen Protokoll mit entsprechender Modifikation möglich.

Es gibt verschiedene Punkte, an denen der RNA-Isolations- und Reinigungsschritt angehalten werden kann (siehe Protokoll oben). Sobald jedoch Leberproben geerntet wurden, wird die Fortsetzung der Immunpräzipitation empfohlen, da der Ertrag isolierter RNA bei einem Einfrieren bei diesem Schrittum50 % sinken könnte. Gewebe sollten schnell mit einem Dissektionspuffer abspült werden, der Cycloheximid enthält, um die mRNA-Translation zu hemmen. Unzureichende Gewebelyse könnte auch zu einer niedrigen RNA-Ausbeute beitragen. Es ist wichtig, Gewebe auf Eis zu homogenisieren, bis keine Gewebebrocken mit dem motorischen Homogenisator sichtbar sind, während eine minimale Belüftung10gewährleistet ist. Darüber hinaus ist eine ausreichende Sanitätswäsche mit hohem Salzpuffer entscheidend, um die Entfernung der unspezifischen Bindung von ribosomalen Proteinen an die Affinitätsmatrix zu gewährleisten. Einschließlich einer wilden Art Negativkontrolle hilft, die Spezifität der Immunpräzipitation und die Effizienz der Waschschritte zu beurteilen. Darüber hinaus erhöht die Verwendung eines kommerziellen RNA-Reinigungskits, das eine RNase-freie DNase-Behandlung enthält, die RNA-Reinheit.

Darüber hinaus wird empfohlen, die Expression und Häufigkeit des GFP:RPL10A-Fusionsproteins zu überprüfen und die Menge an Gewebe zu bewerten, die erforderlich ist, um ausreichend RNA für die nachgelagerte Analyse zu erhalten. Gewebeabschnitte oder Lysate können für immunbasierte Nachweismethoden verwendet werden, um die Expression von GFP:RPL10A zu validieren. Die Menge der isolierten RNA kann variieren: (1) die Anzahl der Zellen, die GFP:RPL10A exexzessieren, (2) die Expressionsebene des Transgens und (3) die Größe und Ploidie der Zellen, die das Transgen exexeiten. Ein Pilotversuch mit der Hälfte und der doppelten Menge der empfohlenen Gewebemenge könnte nützlich sein, um das optimale Eingangslysat für TRAP-seq zu bestimmen. In unseren Händen konnten wir 150 ng RNA mit nur 1-2% Hepatozyten erhalten, die GFP:RPL10A aus 200 mg der wiederbevölkerten Fah-/- Leber exzessikulieren, was 2 x 105 polyploiden Hepatozyten mit transgener Expression9entspricht.

Die TRAP-seq-Methodik isoliert ribosomegebundene mRNA, um den übersetzenden mRNA-Pool einer Zelle zu profilieren. Die resultierenden Sequenzierungslesungen entsprechen daher dem "Translatome" und nicht dem Transkriptom. Beachten Sie, dass das Übersetzen von Ribosom-Footprints nicht erfasst wird, da TRAP auf nativen und nicht auf vernetzten Komplexen durchgeführt wird. Wenn Footprinting-Analysen gewünscht werden, sollte das obige Protokoll mit relevanter Vernetzung modifiziert werden, gefolgt von Immunprecipitation -Methoden (CLIP)18. Eine weitere Einschränkung von TRAP ist die Anforderung einer ausreichenden Anzahl von Zellen, die das GFP:RPL10A-Fusionsprotein exdrücken. Für Experimente, bei denen der Zelltyp gering ist, kann die Kombination mehrerer biologischer Proben erforderlich sein, um genügend RNA zu isolieren, um RNA-seq19zu ermöglichen. Darüber hinaus erfordert TRAP-seq das Vorhandensein von GFP:RPL10A in der Zellart des Interesses. Dies könnte eine Herausforderung darstellen, wenn es kein spezifisches Übermittlungssystem für die Zellen gibt oder wenn ein zelltypspezifischer Promotor zur Steuerung des Cre-Ausdrucks nicht verfügbar ist.

Die jüngste Entwicklung der einzelligen RNA-Seq-Technologie (scRNA-seq) ermöglichte eine direkte Sequenzierung, gefolgt von der Silico-Identifikation verschiedener Zelltypen, wodurch eine Sequenzierung ohne Sortierung für bestimmte Zellarten von Interessen ermöglicht wurde20 ,21,22. ScRNA-seq erfordert jedoch immer noch die Trennung der Zellen vom Organ. Im Falle des Fah-/- Repopulation-Modells ist die Leberperfusion und Hepatozytenisolation aufgrund der Fragilität sowohl der verletzten als auch der sich wiederholenden Hepatozyten äußerst schwierig und ineffizient. Tatsächlich konnten wir noch nicht genügend Hepatozyten von Fahisolieren-/- Mäuse, die nach hydrodynamischer Injektion von Fahplasmiden wieder bevölkert werden. Darüber hinaus könnten sich in der Zeit, die zur Verarbeitung von Geweben benötigt wird, die Genexpressionsniveaus ändern. Protokolle für Leberperfusion dauern bis zu 30 min warmer Ischämiezeit. Zukünftige Methoden zur Optimierung der Leberperfusion, um die Verarbeitungszeit zu verringern und die Isolationseffizienz zu erhöhen, könnten die ScRNA-seq-Integration in das Fah-/- Mausmodellsystem und möglicherweise in andere Verletzungs- und Wiederbesiedlungsmodelle ermöglichen. Dies würde auch die Untersuchung aller Leberzelltypen ermöglichen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Integration von TRAP-seq mit der Fah-/- Maus eine spezifische Isolations- und Genexpressionsprofilierung von replizierenden Hepatozyten ermöglicht, um therapeutische Ziele zu identifizieren, die die Leberwiederbesiedlung fördern könnten. Diese Methode kann implementiert werden, um andere Zelltypen in der Leber und anderen Organsystemen zur krankheitsspezifischen Identifizierung von Genexpressionsänderungen zu untersuchen, um potenzielle Wirkstoffziele oder Biomarker zu identifizieren. Eine analoge Technik kann verwendet werden, um Kerne aus der Wiederbesiedlung von Hepatozyten mittels Affinitätsreinigung zu sammeln und dann eine epigenetische Analyse dieser spezifischen Zellen durchzuführen16.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch folgende Stipendien unterstützt: F31-DK113666 (AWW), K01-DK102868 (AMZ), K08-DK106478 (KJW) und P30-DK050306 (Pilotzuschuss an KJW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL Tissue Grinder, Potter-Elv, Coated DWK Life Sciences (Wheaton) 358007
Absolutely RNA Miniprep Kit Agilent 400800
Anti-GFP antibodies Memorial Sloan-Kettering Antibody & Bioresource Core GFP Ab #19C8 and GFP Ab #19F7
Bovine Serum Albumin, IgG-Free, Protease-Free Jackson ImmunoResearch 001-000-162
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Roche 11836170001
Cycloheximide Millipore Sigma C7698
Deoxycholic acid, DOC Millipore Sigma D2510
D-Glucose, Dextrose Fisher Scientific D16
DL-Dithiothreitol Millipore Sigma D9779
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 Thermo Fisher Scientific 65602
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid Fisher Scientific FB0875712
HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red Thermo Fisher Scientific 14065-056
HEPES, 1 M Solution, pH 7.3, Molecular Biology Grade, Ultrapure, Thermo Scientific Thermo Fisher Scientific AAJ16924AE
Magnesium chloride, MgCl2  Millipore Sigma M8266
Methanol Fisher Scientific A452
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific VV-83061-00
NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module New England BioLabs E7490S
NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina New England BioLabs E7530S
Nonylphenyl polyethylene glycol, NP-40. IGEPAL CA-630 Millipore Sigma I8896
Nuclease-Free Water, not DEPC-Treated Ambion AM9932
Overhead Stirrer DWK Life Sciences (Wheaton) 903475
PBS Buffer (10x), pH 7.4 Ambion AM9625
Pierce Recombinant Protein L, Biotinylated Thermo Fisher Scientific 29997
Potassium chloride, KCl Millipore Sigma P4504
RNA 6000 Pico Kit & Reagents Agilent 5067-1513
RNaseZap RNase Decontamination Solution Invitrogen AM9780
RNasin Ribonuclease Inhibitors Promega N2515
Sodium azide, NaN3 Millipore Sigma S2002
Sodium bicarbonate, NaHCO3 Millipore Sigma S6297
SUPERase·In RNase Inhibitor Invitrogen AM2694

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References

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Zelltypspezifische Gene Expression Profiling in der Mausleber
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Wang, A. W., Zahm, A. M., Wangensteen, K. J. Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver. J. Vis. Exp. (151), e60242, doi:10.3791/60242 (2019).More

Wang, A. W., Zahm, A. M., Wangensteen, K. J. Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver. J. Vis. Exp. (151), e60242, doi:10.3791/60242 (2019).

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