Summary
Vi beskriver ett protokoll för cell-typ specifikt uttryck för den genetiskt kodade FRET-baserade sensorn ATeam 1,03Yemk i organotypic slice kulturer av musen framhjärnan. Dessutom visar vi hur man använder denna sensor för dynamisk avbildning av cellulära ATP nivåer i nervceller och astrocyter.
Abstract
Neuronal aktivitet i centralanervsystemet (CNS) framkallar en hög efterfrågan på cellulär energi från nedbrytningen av adenosintrifosfat (ATP). En stor del av ATP behövs för att ominstallera Jon gradienter över plasmamembran bryts ned av elektrisk signalering av nervceller. Det finns bevis för att astrocyter-samtidigt inte generera snabba elektriska signaler själva-genomgår ökad produktion av ATP som svar på neuronala aktivitet och stödja aktiva nervceller genom att ge energimetaboliter till dem. Den senaste utvecklingen av genetiskt kodade sensorer för olika metaboliter nu möjliggör studiet av sådana metaboliska interaktioner mellan nervceller och astrocyter. Här beskriver vi ett protokoll för cell-typ specifikt uttryck för ATP-känsliga Fluorescence resonans energiöverföring-(FRET-) sensor ATeam 1,03Yemk i organotypic vävnad slice kulturer av musen hippocampus och cortex med Adeno-associerade virala vektorer (AAV). Vidare, vi visar hur denna sensor kan användas för dynamisk mätning av förändringar i cellulära ATP nivåer i nervceller och astrocyter på ökningar av extracellulära kalium och efter induktion av kemisk ischemi (dvs., en hämning av cellulära energimetabolism).
Introduction
Excitatoriska elektrisk aktivitet av nervceller är till stor del baserat på flödet av katjoner såsom natrium (na+) och kalium (K+) över deras plasmamembran. Underhåll av elektrokemiska gradienter av dessa två joner krävs därför för signalering. Detta åstadkoms genom cellulära na+/k+-ATPAS (nka), en ubiquitously uttryckt elektrogena transmembranpump, som extruderar 3 na+ ut ur cellen i utbyte mot 2 K+ från extracellulära rymden, som kräver konsumtion av en molekyl av ATP per transport cykel1. Förutom NKA, det finns flera andra ATP-konsumerar Jon transportörer inklusive plasmamembranet ca2 +-ATPas, vilket är viktigt för intracellulära ca2 + homeostas och dess export efter aktivitetsinducerad tillströmning2. I presynaptiska blåsor, en vacuolar-typ H+-ATPas (v-ATPas) skapar protongradienten som krävs för signalsubstansen upptag i detta fack3.
Medan aktiviteten hos nervceller kräver därför en betydande mängd ATP4, de uppvisar inte en betydande kapacitet för lagring av energi. Istället, de verkar förlita sig på metaboliska interaktioner med angränsande astrocyter, de stora glykogen butikerna i hjärnan5. Det har föreslagits att astrocytic glykogen verkligen spelar en viktig roll för att stödja neuronala energibehov; och ett nyckel fenomen i detta föreslagna neuro-metabolisk koppling mellan de två celltyperna är kapaciteten hos astrocyter att öka deras ATP produktion som svar på neuronala aktivitet6,7,8. Denna hypotes, känd som astrocyte-neuron laktat Shuttle (anls), är fortfarande under debatt, eftersom annat arbete har gett belägg för att nervceller också kan öka sin egen frekvens av glykolys som svar på stimulering9,10, vilket återspeglar nödvändigheten av ytterligare metoder och metoder för att studera neuro-glia interaktion.
Utredning av cellulär energimetabolism och ATP nivåer i nervceller och astrocyter för att belysa neuro-glia metaboliska interaktioner har länge hämmats av avsaknaden av lämpliga sonder för detektion av förändringar i metabolitkoncentrationer i levande celler i hjärnvävnad. Det senaste decenniet har dock gett en ökning av utvecklingen av nya verktyg och nya genetiskt kodade fluorescerande prober för olika metaboliter, inklusive sensorer för ATP, laktat, pyruvat och andra11,12. Med hjälp av dessa verktyg, är det nu möjligt att direkt ta itu med frågor som rör cellulära ATP konsumtion och förändringar i cellulära energi nivåer på enstaka cellnivå och i en cell-typ specifikt sätt i intakt hjärnvävnad13.
I det nuvarande arbetet, beskriver vi ett förfarande för att visualisera cytosoliska ATP dynamik på nervceller och astrocyter av odlade organotypic hjärn skivor. Vi visar hur man använder Adeno-associerade virala vektorer (AAV) för cell-typ specifikt uttryck för den genetiskt kodade ATP-nanosensor ATeam 1,03Yemk (14) i nervceller och astrocyter av skivor av mushjärna som kan upprätthållas i cellkulturen i flera veckor15. Ett förfarande för hur man tar bort den gliaceller ärr som täcker odlade vävnad skivor beskrivs, vilket förbättrar optisk tillgänglighet och avbildning av celler i organotypic vävnad lagren under. Slutligen visar vi hur ATeam 1,03Yemk kan användas för att utföra FRET-baserad avbildning av förändringar i cellulära ATP nivåer i denna beredning. Denna metod är värd de stora fördelarna att det inte kräver kirurgiska hjärnan förfaranden, ger höga nivåer av uttryck av sensorn och celltyp specificitet i odlade hjärn skivor, minska invasivitet eller stress i cellerna jämfört med andra metoder, som transfektion av elektroporation eller transduktion med andra virala vektorer10,16,17. Dessutom kan detta protokoll tillämpas på andra FRET baserade nanosensorer, bland dem varianter av ATeam 1,03 som ger lägre bindning affinitet för ATP14.
Protocol
Denna studie genomfördes i strikt överensstämmelse med de institutionella riktlinjerna från Heinrich Heine University Düsseldorf och Europeiska gemenskapens rådsdirektiv (2010/63/EU). Alla experiment som använder organotypic hjärna segmenterar kulturer kommunicerades till och godkändes av djur välfärds kontoret på djuromsorg och bruk lättheten av den Heinrich Heine universitetar Düsseldorf (institutionellt agera numrerar: O50/05). I enlighet med rekommendationerna från Europeiska kommissionen18, dödades djur upp till 10 dagar av halshuggning.
1. beredning av Organotypic Brain slice kulturer (OTCs)
- Dagen före eller minst 30 min före ingreppet
- Förbered petriskål (under sterila förhållanden). Ta bort locket på 6 väl plattan och placera 800-850 μL av OTC-medium i varje brunn. Förvara plattan i inkubatorn (37 ° c, 5% CO2/95% O2) tills det behövs.
- Förbered tvätt Petriskålarna (under sterila förhållanden). Tillsätt 3 mL HBSS till varje 30 mm petriskål. Totalt krävs 5 rätter per förfarande. Placera dem i inkubatorn (37 ° c, 5% CO2/95% O2) i minst 30 min – över natten tills det behövs.
- Förbered ACSF (tabell 1). Förvara saltlösning utan glukos vid 4 ° c till nästa dag.
| Salines och media-formulering | ||||
| Namn | Förkortning | Sammansättning | Koncentration [mM] | Kommentarer |
| Artificiell cerebrospinalvätska lösning | ACSF | Nacl | 125 | Bubblade med 5% CO2/95% O2, pH 7,4 |
| KCl | 2,5 | Tillsätt alltid glukos precis före användning. | ||
| CaCl2 | 2 | Förvara inte mer än en dag med glukos | ||
| MgCl2 | 1 | ~ 310 mOsm/L | ||
| Nä2Po4 | 1,25 | |||
| NaHCO3 | 26 | |||
| Glukos | 20 | |||
| Experimentell ACSF | E-ACSF | Nacl | 136 | Bubblade med 5% CO2/95% O2, pH 7,4 |
| KCl | 3 | Tillsätt alltid glukos precis före användning. | ||
| CaCl2 | 2 | Förvara inte mer än en dag med glukos | ||
| MgCl2 | 1 | ~ 320 mOsm/L | ||
| Nä2Po4 | 1,25 | |||
| NaHCO3 | 24 | |||
| Glukos | 5 | |||
| Laktat | 1 | |||
| Kemisk ischemia lösning | Cis | Nacl | 136 | Bubblade med 5% CO2/95% O2, pH 7,4 |
| KCl | 3 | ~ 318 mOsm/L | ||
| CaCl2 | 2 | |||
| MgCl2 | 1 | |||
| Nä2Po4 | 1,25 | |||
| NaHCO3 | 24 | |||
| 2, 2-deoxyglukos | 2 | |||
| NaN3 | 5 | |||
| 8 mM kalium ACSF | 8 mM K+ acsf | Nacl | 128 | Bubblade med 5% CO2/95% O2, pH 7,4 |
| KCl | 8 | ~ 320 mOsm/L | ||
| CaCl2 | 2 | |||
| MgCl2 | 1 | |||
| Nä2Po4 | 1,25 | |||
| NaHCO3 | 24 | |||
| Glukos | 5 | |||
| Laktat | 1 | |||
| Hepes-buffrad ACSF | H-ACSF | Nacl | 125 | Justerad till pH 7,4 med NaOH |
| KCl | 3 | Tillsätt alltid glukos direkt före användning | ||
| CaCl2 | 2 | Förvara inte mer än en dag med glukos | ||
| MgSO4 | 2 | ~ 310 mOsm/L (justerad med sackaros) | ||
| Nä2Po4 | 125 | |||
| Hepes | 25 | |||
| Glukos | 10 | |||
| Hanks balanserade saltlösning | SPRINKLER | Sigma (katalognummer H9394). | ||
| Dulbecco ' s fosfat-buffrad saltlösning | DPBS | Gibco (katalognummer 14287-080) | ||
| Organotypic kultur medium | OTC-medium | värmeinaktiverat Horse serum | 20 | 34 ° c, 5% CO2, pH 7,4, under odlingstillstånd |
| Mem | 79% | ~ 320 mOsm/L | ||
| L-glutamin | 1 | |||
| Insulin | 0,01 mg/mL | |||
| Nacl | 14,5 | |||
| MgSO4 | 2 | |||
| CaCl2 | 1,44 | |||
| Askorbinsyra | 0,00125% | |||
| D-glukos | 13 |
Tabell 1: lösningens sammansättning.
- På dagen för beredning, tillsätt glukos till ACSF, placera den på is och börja bubblar med 95% O2/5% Co2 i minst 30 min för att resultera i ett pH på 7,4.
- Dissektion och skivning
- Offra musen (BalbC, båda könen) vid postnatal dag 6 till 8 genom snabb halshuggning och placera huvudet i ett glas petriskål som innehåller iskalla ACSF.
- Exponera skallen genom att skära huden från ryggen tills den bakre spetsen av näsans ben. Sedan försiktigt skära skallen från foramen magnum med hjälp av en kirurgisk sax och exponera hjärnan.
Anmärkning: Kontrollera att förfarandet överensstämmer med institutionens riktlinjer. - Ta bort hjärnan och placera den på ett filtermembran i en iskall petriskål fylld med ACSF.
- Separera halvkloten och utföra en parasagittal skära i en vinkel på 45 °. Fix en halvklotet på vibratome vävnad skede med superlim. Omedelbart överföra vävnads blocket till vibratome badet innehåller iskalla ACSF (bubblade med 5% CO2/95% O2). Slutligen anpassa vävnaden. Håll den andra halvklotet i iskalla ACSF tills skivning.
- Justera vibratome för att skära skivor vid 250-400 μm. skivning på 250 μm kommer att ge cirka 12 skivor per djur (400 μm: ~ 7 skivor).
- Efter styckning segmentet (figur 1A), identifiera Hippocampus bildandet baserat på dess typiska morfologiska utseende (figur 1) och isolera den med hjälp av Hypodermiska nålar (23 gauge, 1 "), hålla den del av hjärnbarken intill hippocampus.
Anmärkning: Bevara neocortex medan odling hjälper till att bevara integriteten i hippocampus. Emellertid, Hippocampus kan isoleras och odlas utan cortex om det behövs. - Placera segmentet på ett nät i värmde, ACSF (34 ° c, bubblade med 5% CO2/95% O2) tills alla skivor samlas in.
- Överför skivorna till laminärt flödes skåpet för att fortsätta under sterila förhållanden.
Figur 1: representativa överföringsbilder av akuta och organotypiska preparat av hjärn skiva. Jämförelse av en akut isolerad parasagittal hjärn skiva (a) och en parasagittal organotypic hjärn skiva upprätthålls i kulturen i 12 dagar (B) med hjälp av wide-fältet translumination mikroskopi. DG = dentate gyrus; CA1/3 = CA1/CA3-regionen Hippocampus; E-CTX = entorhinal cortex; CTX = (neo-) cortex. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
2. odling av skivorna
- Överför försiktigt skivorna från ACSF till en av de förvärmda Petriskålarna fyllda med steril Hank saltlösning med hjälp av en inverterad steril glas Pastinpipett.
Anmärkning: Sterilisering av vävnaden uppnås genom utspädning (steg 3,2). Överför så lite ACSF som möjligt till petriskål. - Byt pipetten och överför skivorna till den andra petriskål. Upprepa processen 5 gånger totalt. Överför så lite HBSS som möjligt till följande petriskålar.
- Placera försiktigt en skiva i taget högst upp på kultur insatsen. Upprepa processen för varje segment. Undvik turbulenser i pipetten och vänta tills segmentet har nedförsbackar till spetsen på Pastinpipetten. Man kan placera upp till 4 skivor på ett enda membran.
- Ta försiktigt bort eventuella överskott Hank lösning från toppen av insatsen med hjälp av en fin spets.
- Behåll kulturerna (figur 2) i en inkubator vid gränssnittet mellan gas (carbogen, 95% O2 /5% Co2) och vätskan vid 37 ° c till experimentets dag. Byt ut mediet var 2-3 dag.
Figur 2: principen om FRET-baserade ATP Imaging i odlade organotypic hjärn skivor med hjälp av den genetiskt kodade sensorn ATeam 1,03Yemk. Schematisk representation av protokollet som presenteras i detta arbete. Kortfattat, parasagittal organotypic skivor, odlade för 1-3 dagar, är sensorik med en Adeno-associerad viral vektor som innehåller antingen, den astrocyt-specifika hgfap-eller neuron-specifika HSYN-promotor och sekvensen för uttrycket av ATEAM 1,03yemk. Utspädda alikvoter av dessa vektorer (1:2-1:4) appliceras direkt på toppen av ett segment, som upprätthålls under odlingsförhållanden under minst 6 dagar. Förändringar i intracellulära ATP-nivåer kan sedan visualiseras i celler som uttrycker sensorn genom spännande det på 434 nm och genom att förvärva fluorescensutsläpp samtidigt på 527 (acceptor) och 475 (givare) nm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
3. uttryck för ATP-sensorer med en Aadeno-associerad viral vektor (figur 2)
Anmärkning: Se till att uppfylla alla krav för hantering av genetiskt modifierade organismer!
- För att hantera viral Vector, alikvot Adeno-associerade virala vektorer (AAV2/5) vid 1-2 μl för att undvika upprepad frysning och upptinning. Förvara alikvoter vid-80 ° c.
- Placera en kolv som innehåller 10% blekmedel på den sterila bänken för att kassera allt använt restmaterial som var i kontakt med vektorn.
- För transduktion, Bered en utspädning av 1 μL av vektorn med 2-3 μL DPBS. Stamlösningarna uppvisar normalt en fysisk titer i storleksordningen 1012 virala genomer per ml (VG/ml).
- Överför ett skär som innehåller en kultiverad skiva i den sterila huven.
- Utan att vidröra vävnaden, applicera 0,5 μL av den utspädda vektorn direkt till toppen av varje skiva.
Anmärkning: Bättre uttryck i de djupare lagren av vävnaden erhålls genom att transducing odlade skivor vid 1-3 dagar in vitro (DIV). Transduktion av äldre kulturer kan resultera i ett dominerande uttryck av celler i det omgivande glialärr eller ett lågt uttryck i nervceller, respektive. - Slutligen, placera skivorna tillbaka i inkubatorn och underhålla dem i minst 6 fler dagar. Ändra inte mediet på transduktionens dag.
4. avlägsnande av Glialärr (figur 3)
- Strax innan ett experiment, överför en insats som innehåller odlade skivor i den sterila huven och placera den i en 30 mm maträtt, som innehåller 1 mL ULT medium eller MEM.
- Placera skålen under stereoskop och fokusera på ytan av segmentet.
- Använd två sterila Hypodermiska nålar (23 G, 1 ") för att göra en kort tvär skuren höger på de smala kanterna av en vald skiva (figur 3). Detta förfarande kommer att frigöra spänningen i ytan som skapats av gliaceller ärr orsakar det att dra tillbaka, därigenom exponera de underliggande lagren (se figur 5).
Anmärkning: Det första vävnads skiktet (glialärr) bildas huvudsakligen av reaktiva astrocyter. I wide-fält Imaging, detta täta vävnad skikt kommer att resultera i ytterligare spridning av ljuset, vilket resulterar i suddiga bilder. Ta bort ärret är således fördelaktigt att få bättre synlighet av de djupare lagren, som innehåller rätt organotypic vävnad. Således, vara noga med att utföra denna klippa exklusivt vid kanten och i det övre skiktet av segmentet beredning bara och inte skada vävnaden under. Vi har inte observerat skillnader mellan data som erhållits i OTCs med gliaceller ärr med dem från ärr-fria OTCs (data som inte visas). - Ta bort det förberedda segmentet från skäret. För detta ändamål, Använd en steril skalpell och punktskatter det genom att göra raka parallella nedskärningar i membranet, bildar en kvadrat eller en triangel med segmentet i centrum, medan du håller kanterna på membranet med pincett. Om insatsen är värd för ytterligare skivor, överför den tillbaka till den ursprungliga plattan och in i inkubatorn. Ytspänningen på mediet kommer att förhindra dess läckage på ytan av membranet.
Figur 3: Schematisk illustration av det mekaniska avlägsnandet av glialärr. Figuren visar en Hippocampus slice kultur som täcks av en gliaceller ärr (Blueish ellipsoid). Med en gång klippning spetsarna på två sprutor nål på minsta pol av kulturen och vid kanten av gliaceller ärr (blå streckad linje), kommer ärret vända åt sidan. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
5. FRET-baserade ATP Imaging (figur 4)
- Före experimentet, Förbered E-ACSF och bubbla den med 95% O2/5% Co2 för minst 30 min för att få ett pH på 7,4. Slå på fluorescerande ljuskälla (Xenon-lampa) på monochromatorn (figur 4). Starta perfusion strax innan du tar ut slice från inkubatorn.
Anmärkning: Håll saltlösning bubblade med 95% O2 och 5% Co2 under hela experimentet. - Överför segmentet till en experimentell kammare som ständigt är parfymera med färsk carbogenated E-ACSF med hjälp av en Peristaltisk pump (figur 4). Sedan kan du åtgärda segmentet med ett rutnät. Placera kammaren på Mikroskop stadiet och Anslut per fusions systemet. Gas-bevis laboratorium slangar rekommenderas för perfusion.
Anmärkning: Experiment kan utföras vid rumstemperatur eller nära fysiologisk temperatur, beroende på experimentell design. Kontrollera stabiliteten och tillförlitligheten i per fusions flödet för att undvika förändringar i fokus som orsakas av förflyttning av vävnaden och/eller förändringar i skjuvning stress. Standard perfusion hastigheter för slice arbete, som används av oss och många andra laboratorier, är 1,5-2,5 mL/min.
Bild 4: konfiguration av bandet Imaging setup. (A) Schematisk illustration av de olika komponenterna och deras rumsliga arrangemang som krävs för bandet Imaging setup. Arrangemanget består av en monokromator med en Xenon lampa som ljuskälla, en upprätt fast-Stage Mikroskop (1), en bild-splitter system (2), en digital CCD eller CMOS-kamera för Time-lapse inspelning (3), och ett experimentellt bad anpassad för stabil konstant perfusion (4). Badet perfusion realiseras av en Peristaltisk pump med justerbar flödeshastighet. (B) bild av försöks arbetsytan. BANDET Imaging setup är monterad på en vibrationsdämpade bord som bär en x/y-Translational skede, där det experimentella badet är inbäddad. Nummer: se (a). CSchematisk bild av ljus vägen från monochromatorn till digitalkameran. Indikerat är placera av de olika filtrerar och den Dichroic avspegla. Nummer: se (a). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Ta det odlade segmentet i fokus med hjälp av transmissions ljus. Identifiera det område där experiment ska utföras (exempel: CA1 regionen i hippocampus). Innan du påbörjar bild experiment ska du vänta i minst 15 minuter så att skivorna kan anpassas till saltlösning. För konfiguration av experimentella inställningar, se figur 4.
- Slå på kameran och bildhanteringsprogrammet. Välj sedan rätt filterkub.
- Excitera givaren fluorescerande protein (eCFP) vid 435/17 nm (~ 435 nm). Ställ in exponeringstiden mellan 40 och 90 MS.
Anmärkning: Stark exponering av skivor till fluorescerande ljus kan resultera i fototoxiska effekter. - Excitation vid 435 nm resulterar i utsläpp vid både 475 nm (eCFP; donator) och 527 nm (Venus; acceptor). Dela fluorescensutsläppet vid 500 Nm med en utsläpps bild splitter och Använd bandpassfilter på 483/32 och 542/27 för att ytterligare isolera givare och acceptorfluorescens. Starkt uttryck kan resultera i mättnad av detektorerna. I detta fall kan du använda en neutral densitet filter för att minska intensiteten av excitation.
- Välj en intresse region (ROI) tydligen saknar cellulär fluorescens för bakgrund subtraktion. Skapa sedan ROIs avgränsande cell kroppar.
- Ange frekvensen för bild anskaffning och den totala inspelningstiden. För långa experiment (> 30 min) rekommenderas en förvärvsfrekvens på 0,2-0,5 Hz för att förhindra fototoxicitet.
- Starta inspelningen. Det rekommenderas att registrera minst 5 minuter under baslinje förhållanden för att säkerställa stabiliteten i preparatet.
Anmärkning: Justera cellens fokus under inspelningen om det behövs. - För att inducera förändringar i intracellulära ATP, överföra perfusion röret från standard ACSF till en saltlösning som innehåller metaboliska hämmare (t. ex. CIS, se tabell 1 och nedan). Alternativt, Använd en saltlösning med förhöjd kalium koncentration att efterlikna frisättning av kalium från aktiva nervceller.
Anmärkning: Ansökan av Bath perfusion är en relativt långsam process, som globalt verkar på hela preparatet. Ta del av den tid då den nya lösningen faktiskt började komma in i experiment badet. Beroende på avståndet mellan kammaren och saltvatten behållaren, samt på hastigheten av perfusion, måste en fördröjningstid övervägas.
6. högupplöst dokumentation av cellulär ATeam Fluorescence
- Direkt efter inspelningarna, överför inspelnings kammaren som innehåller segment kulturen till det konfokala laser skannings mikroskopet.
Anmärkning: Var särskilt försiktig. På grund av potentiell foto skada, utför detta steg först efter experiment. I dokumentationssyfte kan man utbyta E-ACSF med H-ACSF. Därför krävs inte nödvändigtvis ett per fusions system. - Ta z-stackar vid den högsta z-upplösningen möjligt vid den givna optiska konfigurationen.
- Tillämpa en deconvolution algoritm för att öka bildupplösningen.
Representative Results
AAV vektorer är ett pålitligt verktyg för att selektivt uttrycka främmande gener i celler inom levande vävnad16. Direkt applicering av AAVs som innehåller sekvens kassetten för ATeam 1,03Yemk och en specifik promotor resulterar i ett högt uttryck av sensorn i den valda celltypen. Vid DIV 14 (~ 10 dagar efter en transduktion), neuroner uttrycker ATeam under mänskliga synapsin promotorn finns på hög densitet i neocortex av odlade vävnad skivor på djup av upp till 50 μm under slice ytan (figur 5a). Jämförbara resultat kan uppnås i hippocampus (figur 5B).
Figur 5: visualisering av nervceller som uttrycker ATeam 1,03Yemk i odlade parasagittal organotypic hjärn skivor. Bilder till vänster motsvarar utökade fokus projektioner av 43 optiska sektioner (1,05 μm vardera) av kortikal vävnad (a) och (B) av 70 optiska sektioner (0,6 μm vardera) av hippocampus vävnad. Bilder till höger representerar volymvyn för samma projektion. Cellerna är färgkodade enligt deras djup i förhållande till segment ytan, vilket indikeras av färgskalan till höger. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
För mätning av ATP nivåer i astrocyter, ATEAM 1,03yemk uttrycks under kontroll av den mänskliga gliaceller hjärn sura protein (gfap) promotor. Detta resulterar i en effektiv transduktion av celler i både neocortex och Hippocampus odlade vävnads skivor (figur 6). Särskilt kan två olika morfologiska fenotyper särskiljas, beroende på djupet i förhållande till ytan av segmentet preparat. I det första ytliga skiktet, celler kännetecknas av tjocka primära processer som huvudsakligen arrangeras parallellt med ytan. Dessa celler uppvisar starkt överlappande domäner, skapa en tät meshwork av tydligen reaktiva astrocyter (figur 6). I djupare skikt (30-60 μm från ytan), sensorik astrocyter uppvisar fina cellulära processer som bildar till stor del sfäriska domäner och deras morfologi liknar den av astrocyter på plats som rapporterats tidigare19,20,21 (figur 6). För att få bättre transduktion av djupare skikt astrocyter samt bättre optisk tillgång till dessa djupare skikt, kan gliaceller ärrvävnad avlägsnas som beskrivs i steg 4.
Figur 6: visualisering av astrocyter uttrycker ATeam 1,03Yemk i odlade parasagittal organotypic hjärn skivor. Bilden till vänster motsvarar en utökad fokusprojektion på 191 optiska sektioner (0,45 μm vardera). För illustration ändamål var gliaceller ärr uteslutas från projektion av astrocyter. Bilder till höger representerar volymvyn av samma projektion före och efter avlägsnande av glialärr. Cellerna är färgkodade enligt deras djup i förhållande till segment ytan, vilket indikeras av Färgskalorna till höger. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Framgångsrikt uttryck för ATeam 1,03Yemk möjliggör dynamisk mätning av förändringar i ATP-nivåer i nervceller eller astrocyter, beroende på arrangören används (se ovan). Experiment utfördes i ett experiment bad ständigt parfymera med E-ACSF (bubblade med 95% O2/5% Co2). I organotypic skivor uttrycker ATeam 1,03Yemk i hippocampus nervceller, områden av intresse (Rois) valdes innan inspelningen, som representerar Somata av pyramidala celler (figur 7A). Dessutom valdes en region för bakgrunds subtraktion (figur 7a). Utsläppen av Venus och eCFP-fluorescensen samlades sedan in för var och en av dessa ROIs separat och avbildas som fluorescensutsläppsnivå över tiden (figur 7B). Efter att ha inspelat fluorescensen under kontrollförhållanden i flera minuter för att säkerställa en stabil baslinje hämmade cellulär metabolism genom att exponera segment preparatet för en glukos fri saltlösning, till vilken 5 mM natriumazid (NaN3) lades till en minut (figur 7B). Denna manipulation inducerade motsatta förändringar i utsläppsintensiteten av bandet paret (figur 7B, vänster paneler), med en minskning av Venus (527 nm) och en ökning av ecfp (475 nm) utsläpp. Beräkna bandet förhållandet genom att dividera fluorescensutsläpp av Venus med eCFP (FVenus/fecfp) resulterade i signaler som återspeglar de relativa förändringarna i intracellulära ATP nivåer, den så kallade "ATEAM FRET ratio" (figur 7B, höger panel). I alla inspelade nervceller (n = 70 celler i N = 5 skivor), NaN3 orsakade en reversibel minskning av ATEAM FRET förhållandet, indikerar en reversibel minskning av INTRACELLULÄRA ATP nivåer vid hämning av cellulär metabolism.
Figur 7: demonstration av tidsfördröjning ATeam FRET ratio Imaging. (A) övre vänster: Wide-fältfluorescens bild av pyramidala skiktet och stratum radiatum i CA1 regionen av en odlade organotypic Hippocampus slice uttrycker ATEAM 1,03yemk i nervceller. Överst till höger: förstorad vy av boxed sektion som anges till vänster. Vita linjer avgränsa regioner av intresse (ROIs) 1-3 representerar cell kroppar av CA1 pyramidala neuroner som valts för analys i (B). BG representerar ROI som valts för bakgrundskorrigering. Nederst: pseudo-färgade bilder som representerar fluorescensutsläpp av Venus (grön), eCFP (lila) och förhållandet mellan Venus och eCFP. B) tidsfördröjd inspelning i rois 1-3, som representerar neuronala cell kroppar (se A). Spår till vänster visar normaliserade fluorescensutsläpp av Venus (grön) och eCFP (magenta). Spår till höger visar motsvarande ATeam FRET ratio. Observera att perfusion med 5 mM NaN3 i avsaknad av extracellulära glukos i 1 minut (grå stapel) inducerar en reversibel minskning av ATEAM FRET förhållandet, vilket indikerar en minskning av INTRACELLULÄR ATP koncentration. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
För att säkerställa stabiliteten i preparatet och sensorn under långsiktiga experiment förhållanden, skivor uttrycker ATeam i nervceller eller astrocyter var ständigt parfymera med ACSF under längre perioder (> 50 min, n = 12 celler vardera, N = 3 OTCs från 3 hjärnor). Under dessa förhållanden, den ATeam FRET förhållandet inte ändras (figur 8). Exponera förberedelserna för CIS innehållande metaboliska hämmare ("kemisk ischemia", se tabell 1), däremot, resulterade återigen i den förväntade minskningen av ATEAM FRET förhållandet som observerats ovan.
Figur 8: baslinje experiment som sysselsätter ATeam. Långsiktig ATeam FRET ratio Imaging i 14 olika celler under baslinjen villkor i nervceller (topp) och astrocyter (botten). Data togs under jämförbara förhållanden som andra experimentella data. I slutet av varje mätning, var kemisk ischemi framkallas av perfusion med CIS som anges av pilen. Obs: baseline ATeam FRET nyckeltal är stabila över tiden under baslinjen villkor. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Nästa, Vi analyserade svaren från nervceller och astrocyter uttrycker ATeam 1,03Yemk till en ökning av den extracellulära kaliumkoncentrationen. Efter att ha etablerat en stabil baslinje, var neuroner perfunderade med en saltlösning där kaliumkoncentrationen ökades från 3 till 8 mm i 3 minuter (figur 9a). Denna manipulation gjorde dock inte resultera i en detekterbar förändring i ATeam FRET förhållandet (n = 56 celler i N = 5 skivor). För att säkerställa att sensorn reagerade på en förändring i ATP-nivåer, var skivor sedan igen utsätts för en varaktig period av kemisk ischemi framkallade genom att ersätta E-acsf av CIS. Kemisk ischemi resulterade i en snabb minskning av ATEAM FRET förhållandet till en ny, stabil nivå, vilket indikerar nominell utarmning av ATP efter 2-3 min (figur 9a).
Figur 9: representativa experiment som illustrerar förändringar i ATP-nivåerna i nervceller och astrocyter. (A,B): bilder till vänster visar ATEAM fluorescens från nervceller och astrocyter ligger i hippocampus CA1 regionen organotypic skivor. Spår till höger representerar tidsfördröjning inspelningar av ATeam FRET förhållandet erhålls från en ROI placerad över en enda cell kropp. I båda experiment, skivor var först utsattes för en ökning av den extracellulära kaliumkoncentrationen i 3 minuter (se bar), följt av en slutlig exponering för kemisk ischemia. Observera att medan neuroner inte svarar på höjden av extracellulära kalium (a), astrocyter reagerar med en ökning av ATP (B). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Samma experimentella protokoll utfördes med skivor, där ATeam 1,03Yemk uttrycktes i astrocyter. I motsats till vad som observerades i nervceller, astrocyter reagerat på ökningen av extracellulära kalium genom en reversibel ökning av ATeam bandet förhållandet, vilket tyder på en ökning av intracellulära ATP nivåer (n = 70 celler i N = 5 skivor) (figur 9B). Efterföljande exponering för kemisk ischemi resulterade, som väntat, i en stor droppe i ATEAM FRET förhållandet, indikativt för nominell utarmning av intracellulära ATP (figur 9B).
Discussion
Här visar vi ett förfarande för den cell-typ specifika uttryck av ATeam 1,03Yemk, en FRET-baserade, genetiskt kodade nanosensor14, för mätning av förändringar i ATP nivåer i astrocyter eller nervceller i organotypic vävnad slice kulturer av mushjärna15. I exemplariska inspelningar, visar vi att en ökning av den extracellulära kaliumkoncentrationen inte resulterar i en förändring i ATP-koncentrationer i nervceller, medan astrocytic ATP nivåer stiger som svar på denna manipulation. Dessutom, våra resultat visar att vid hämning av cellulär metabolism, ATeam 1,03Yemk FRET förhållandet snabbt sjunker i båda celltyper, indikerar en snabb minskning av INTRACELLULÄRA ATP.
Uttryck för ATeam 1,03Yemk i organotypic slice kulturer kräver underhåll av vävnaden i kulturen under kontrollerade betingelser under minst 7-10 dagar. Alternativt kan ATEAM 1,03yemk också användas för mätning av ATP i akut isolerade hjärnvävnad skivor och i optiska nerver av möss13,15. Mätningar i akut isolerad vävnad, dock nödvändiggör generering av transgena djur eller en stereotaktisk tillämpning av virusvektorer i hjärnan, med djurförsök och strikt djuromsorg protokoll. I detta avseende, ATEAM 1,03yemk uttryck i organotypic vävnad slice kulturer representerar ett användbart och värdefullt alternativ22,23. Under många år nu, organotypic vävnad slice kulturer fungera som ett etablerat modellsystem för att studera neurala egenskaper, anslutning och utveckling24,25,26. De upprätthåller inte bara den allmänna vävnads arkitekturen och lamineringen (figur 1), utan också värd för förmåns egenskaperna hos cellkulturer som överlägsen tillgänglighet och direkt kontroll av Försöksförhållanden. Organotypic vävnad slice kulturer är också rutinmässigt används för att uttrycka främmande gener med hjälp av virala vektorer27. Flera typer av virala vektorer har rapporterats att leverera transgener till hjärnvävnad16,28. Adenovirala vektorer inducerar högt uttryck i gliaceller celler, men inte Hippocampus nervceller16, och kan generera gliaceller reaktivitet17. Adeno-associerade virala vektorer som används här framstår som ett bra alternativ15, och deras effektivitet har också visats i vivo29.
Medan främst används för studier av neuronala egenskaper, nyligen genomförda studier har fastställt att organotypic vävnad slice kulturer kan också användas för analys av astrocyter. Odlade skivor är oftast omfattas av ett skikt av reaktiva astrocyter19,30 (figur 5), men astrocyter uppvisar en mer infödd, icke-reaktiv morfologi och cytoarchitecture i djupare skikt19,30 (figur 5). I den nuvarande studien beskriver vi ett förfarande för mekanisk borttagning av den yttre glialärr, vilket resulterar i en bättre experimentell och optisk tillgänglighet av inhemska astrocyter inom rätt organotypic vävnad skikt. Dessutom förbättrar dess avlägsnande uttrycket effektivitet i djupare skikt av organotypic skivor; om glialärr inte avlägsnas, kan transduktion av AAVs tenderar att begränsas till de ytliga cellagren.
Flera yttre mekaniska faktorer måste beaktas när man utför experiment i vävnad skivor. En variation i Bad perfusion hastighet kan inducera rörelser hela preparatet och/eller inducera förändringar i fokus, vilket resulterar i konstgjorda övergående förändringar av sensorn signalen. Dessutom, både astrocyter och nervceller har rapporterats att reagera på mekanisk deformation såsom införts genom höga perfusion priser32,33. I våra händer, med hjälp av en pålitlig Peristaltisk pump, tillsammans med att upprätthålla små och stabila volymer av saltlösning mellan vävnaden och målet (menisken) resulterar i en stabil bandet-signal under baslinjen förhållanden vid perfusion hastighet som används här (1.5-2.5 mL/min; Figur 8).
I den nuvarande studien, visar vi också att FRET-baserad avbildning med ATeam 1,03Yemk kan användas för att övervaka ATP nivåer i nervceller och astrocyter. Ett alternativt sätt som infördes tidigare för mätning av cellulära ATP är den så kallade Luciferin-luciferase assay34,35,36,37. Detta tillvägagångssätt är dock baserat på avbildning av bioluminescens och ger bara en ganska låg tidsmässiga och rumsliga upplösning delvis på grund av höga bakgrundsljud nivåer. En annan metod som rutinmässigt använts under de senaste åren var avbildning av förändringar i den intracellulära magnesium koncentrationen med hjälp av Jon känsliga fluorofore magnesium Green38,39,40. Detta tillvägagångssätt avser iakttagelsen att en konsumtion av ATP resulterar i frisläppandet av dess Co-Factor magnesium. Avbildning med magnesium grönt ger därmed endast en sekundär uppskattning av förändringar i ATP-nivåer. Dessutom är magnesium grön också känslig för förändringar i intracellulära kalcium, införa en annan svårighet när tolka resultat som erhållits med denna metod.
Den senaste utvecklingen av genetiskt kodade nanosensorer för direkt avbildning av cellulära metaboliter, därför representerade ett stort steg framåt11,12. Flera olika sensorer genererades som kan användas för mätning av intracellulära ATP36,41,42,43. Bland dessa är den ratiometriska fluorescerande ATP indikatorn "drottning"41 samt PercevalHR, som känner av ATP: ADP ratio42. Medan den sistnämnda sonden är ett värdefullt verktyg för att studera cellernas energistatus krävs samtidig mätning av förändringar i pH42.
ATeam är en nanosensor där flera varianter finns, vilka bland annat skiljer sig åt i deras bindningsaffinitet för ATP-14. In vitro, ATEAM 1,03yemk uppvisar en Kd på 1,2 mm vid 37 ° c, som är nära cellulära ATP nivåer bestäms i olika neuronala celltyper, allt från hypotalamus och lillhjärnan34 till Hippocampus37,44,45. I kyvetten mätningar, sänka temperaturen med 10 ° c resulterade i en signifikant minskning av bindningsaffinitet av ATEAM 1,03yemk till ATP, vilket tyder på att det kanske inte är idealisk för cellulära Imaging vid rumstemperatur14. Vår tidigare studie15, emellertid, visade att beteendet och svaret av ATEAM 1,03yemk uttrycks i nervceller och astrocyter till olika manipulationer är liknande på nära fysiologiska och vid rumstemperatur, vilket indikerar att sensorn tillåter tillförlitlig bestämning av intracellulära ATP nivåer under båda förhållanden. Dessutom, våra tidigare experiment riktat pH-känslighet ATeam 1,03Yemk uttrycks inuti celler15, visar att det är okänsligt för förändringar i intracellulära pH med ca 0,1-0,2 pH-enheter. Om Kd i den låga mm-serien är ett bekymmer, alternativa ATEAM varianter kan användas14, bland dem röd-skiftade varianter av ATEAM ("go-ateam")43.
Våra experiment med ATeam 1,03yemk visar att en ökning av den extracellulära kaliumkoncentrationen med några mm endast (från 3 till 8 mm) resulterar i en övergående ökning av ATEAM 1,03yemk förhållandet i astrocyter i organotypic slice kultur. Denna observation bekräftar tidigare studier15,46 och visar tydligt att astrocyter svara på frisättning av kalium genom aktiva nervceller med en ökning av deras ATP produktion, mest sannolikt som en följd av en stimulering av na+/k+-ATPas och na+/HCO3- cotransporter, respektive47,48. I motsats till detta, nervceller visade inte ett svar, som är i linje med tidigare arbete samt15. Båda celltyperna, dock, snabbt och starkt reagerade på hämning av cellulär glykolys och mitokondriell andning som visas före15. Under förhållanden av kemisk ischemia, ATeam FRET nyckeltal föll till en ny stabil nivå, vilket indikerar en nominell utarmning av cellulära ATP. Det senare resultatet tyder på att både nervceller samt astrocyter uppvisar en relevant konsumtion av ATP även under steady-state villkor utan ytterligare stimulering av synaptisk aktivering eller tillämpning av signalsubstanser. Sammantaget drar vi slutsatsen att FRET-baserad avbildning med genetiskt kodade nanosensorer, bland dem ATeam 1,03Yemk, kommer att ge en värdefull strategi för att belysa de cellulära processer som är ansvariga för förändringar i intracellulära ATP nivåer och cellulära ATP konsumtion under olika förhållanden.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande intressen. Författarna fick ekonomiskt stöd som möjliggör Open Access-publicering av Nikon Mikroskop Solutions, Düsseldorf, Tyskland, som producerar instrument som används i video artikeln. Företaget var varken involverat i utformningen av de experiment som presenteras här, inte heller i deras utförande, inte heller i datahanteringen eller i manuskriptet.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Claudia Roderigo och Simone Durry för expert teknisk assistans. Vi tackar Dr. Niklas J. Gerkau och M.Sc. Joel Nelson för hjälp med att förbereda de organotypiska segment kulturerna. Forskning i författarens laboratorium finansierades av den tyska forskningsföreningen (DFG; FÖR 2795: ro 2327/13-1 och SPP 1757: ro 2327/8-2 till CRR; och SPP 1757: unga glia start finansiering till RL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-deoxyglucose | Alfa Aesar | L07338 | Non-metabolizable glucose analog |
| 36-IMA-410-019 Argon laser | Melles Griot | 488 nm wavelength argon | |
| Ascorbic acid | Carl Roth | 3525.1 | Antioxidant, Vitamin C |
| band pass filters 483/32 | AHF Analysentechnik AG | Splitter compatible emmision filter | |
| band pass filters 542/27 | AHF Analysentechnik AG | Splitter compatible emmision filter | |
| Beamsplitter T 455 LP | AHF Analysentechnik AG | Excitation dichroic mirror | |
| Beamsplitter T 505 LPXR | AHF Analysentechnik AG | Splitter dichroic | |
| Confocal laser scannig microscope C1 | Nikon Microscope Solutions | Modular confocal microscope system C1 | |
| Data processing Origin Pro 9.0.0 (64-bit) | OriginLab corporation | Scientific graphing and data analysis software | |
| D-glucose monohydrate | Caelo | 2580-1kg | |
| DPBS | GIBCO/Life | 14190250 | Dulbecco's phosphate-buffered saline |
| Eclipse E 600FN upright microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse FN1 upright microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
| Experimental chamber | custom build | Perfusion chamber for live-cell imaging | |
| EZ-C1 Silver Version 3.91 | Nikon Microscope Solutions | Imaging software for confocal microscope | |
| Hanks' Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H9394 | With Phenol Red for pH monitoring |
| HERAcell 150 | Thermo Scientific | CO2 incubator HERAcell ® 150 with decontamination routine | |
| HERAsafe KS/KSP | Thermo Scientific | Safety Cabinet | |
| Horse serum | GIBCO/Life | 26050088 | Heat inactivated |
| Huygens Professional | SVI Imaging | Deconvolution software | |
| Image J 1.52i | Wayne Rasban national Institute of Health | Image processing Software available in the public domain | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | Insulin from bovine pancreas |
| IP serie peristaltic pump | Ismatec | High-precisionmulti-channel pump | |
| Layout software, Illustrator CS6 | Adobe | Vector graphics editor | |
| L-glutamine | GIBCO/Life | 25030024 | |
| Microm HM 650 V | Thermo Scientific | Vibration microtome. Thermo scientific discontinued the production of the device in the meantime. Any other slicer or tissue chopper siutable for slicing living tissue is fine, too. | |
| Microscope stage | custom build | ||
| Microsoft Excel 16 | Microsoft | Spreadsheet software for basic data processing | |
| Millicell culture insert | Merck Millipore | PICM0RG50 | Hydrophilized PTFE, pore size 0.4 μm |
| Minimum Essential Medium Eagle | Sigma-Aldrich | M7278 | Synthetic cell culture media |
| Monochromator Polychrome V | Thermo Scientific/FEI | Ultra fast switching monochromator | |
| NaN3 (Sodium Azide) | Sigma-Aldrich | S-8032 | Mitochondrial inhibitor (complex IV inhibitor). CAUTION: Azide is toxic. Be aware not to accidentally ingest or inhale it, and prevent ist absoption through the skin. |
| Nikon Fluor 40x / 0.80 W DIC M ∞/0 WD 2.0 | Nikon Microscope Solutions | Water Immersion Microscope Objective | |
| NIS Elements 4.50 advanced Research | Nikon Microscope Solutions | Imaging software. Upgraded version for FRET imaging | |
| ORCA-Flash4.0 | Hamamatsu Photonics | Digital CMOS camera | |
| Perfusion tubing | Pro Liquid GmbH | Tygon tubing, 1.52 x 322 mm (Wd: 0.85) | |
| Photoshop CS 6 Version 13.0 | Adobe | Image processing software | |
| Sodium L-lactate | Sigma-Aldrich | 71718-10G | |
| ssAAV-2/2-hSyn1-ATeam1.03YEMK-WPRE-hGHp(A) | ETH Zürich | v244 | Single-stranded AAV vector that induces the expression of ATeam1.03YEMK under the control of the human synapsin 1 promoter fragment hSyn1. |
| ssAAV-5/2-hGFAP-hHBbI/E-ATeam1.03YEMK-WPRE-bGHp(A) | ETH Zürich | v307 | Single-stranded AAV vector that induces the expression of ATeam1.03YEMK under the control of the human glial fibrillary acidic protein promoter fragment ABC1D. |
| WVIEW GEMINI optic system | Hamamatsu Photonics | Emission Image Splitter |
References
- Sweadner, K. J. Isozymes of the Na+/K+-ATPase. Biochimica et Biophysica Acta. 988, 185-220 (1989).
- Clapham, D. E. Calcium signaling. Cell. 131, 1047-1058 (2007).
- Cotter, K., Stransky, L., McGuire, C., Forgac, M. Recent Insights into the Structure, Regulation, and Function of the V-ATPases. Trends in Biochemical Sciences. 40, 611-622 (2015).
- Harris, J. J., Jolivet, R., Attwell, D. Synaptic energy use and supply. Neuron. 75, 762-777 (2012).
- Brown, A. M., Ransom, B. R. Astrocyte glycogen and brain energy metabolism. Glia. 55, 1263-1271 (2007).
- Hertz, L., et al. Roles of astrocytic Na+,K+-ATPase and glycogenolysis for K+ homeostasis in mammalian brain. Journal of Neuroscience Research. 93, 1019-1030 (2015).
- Allaman, I., Belanger, M., Magistretti, P. J. Astrocyte-neuron metabolic relationships: For better and for worse. Trends in Neurosciences. 34, 76-87 (2011).
- Barros, L. F., Deitmer, J. W. Glucose and lactate supply to the synapse. Brain Research Reviews. 63, 149-159 (2010).
- Diaz-Garcia, C. M., et al. Neuronal Stimulation Triggers Neuronal Glycolysis and Not Lactate Uptake. Cell Metabolism. 26, 361-374 (2017).
- Diaz-Garcia, C. M., et al. Quantitative in vivo imaging of neuronal glucose concentrations with a genetically encoded fluorescence lifetime sensor. Journal of Neuroscience Research. 97, 946-960 (2019).
- Barros, L. F., et al. Current technical approaches to brain energy metabolism. Glia. 66, 1138-1159 (2018).
- Tantama, M., Hung, Y. P., Yellen, G. Optogenetic reporters: Fluorescent protein-based genetically encoded indicators of signaling and metabolism in the brain. Progress in Brain Research. 196, 235-263 (2012).
- Trevisiol, A., et al. Monitoring ATP dynamics in electrically active white matter tracts. eLife. 6, e24241 (2017).
- Imamura, H., et al. Visualization of ATP levels inside single living cells with fluorescence resonance energy transfer-based genetically encoded indicators. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 15651-15656 (2009).
- Lerchundi, R., et al. FRET-based imaging of intracellular ATP in organotypic brain slices. Journal of Neuroscience Research. , 1-13 (2018).
- Ehrengruber, M. U., et al. Gene transfer into neurons from hippocampal slices: comparison of recombinant Semliki Forest Virus, adenovirus, adeno-associated virus, lentivirus, and measles virus. Molecular and Cellular Neurosciences. 17, 855-871 (2001).
- Woo, J., et al. Functional Characterization of Resting and Adenovirus-Induced Reactive Astrocytes in Three-Dimensional Culture. Experimental Neurobiology. 26, 158-167 (2017).
- Close, B., et al. Recommendations for euthanasia of experimental animals: Part 2. DGXT of the European Commission. Laboratory Animals. 31, 1-32 (1997).
- Benediktsson, A. M., Schachtele, S. J., Green, S. H., Dailey, M. E. Ballistic labeling and dynamic imaging of astrocytes in organotypic hippocampal slice cultures. Journal of Neuroscience Methods. 141, 41-53 (2005).
- Lanjakornsiripan, D., et al. Layer-specific morphological and molecular differences in neocortical astrocytes and their dependence on neuronal layers. Nature Communications. 9, 1623 (2018).
- Bushong, E. A., Martone, M. E., Ellisman, M. H. Examination of the relationship between astrocyte morphology and laminar boundaries in the molecular layer of adult dentate gyrus. The Journal of Comparative Neurology. 462, 241-251 (2003).
- Frotscher, M., Zafirov, S., Heimrich, B. Development of identified neuronal types and of specific synaptic connections in slice cultures of rat hippocampus. Progress in Neurobiology. 45, vii-xxviii (1995).
- Galimberti, I., et al. Long-term rearrangements of hippocampal mossy fiber terminal connectivity in the adult regulated by experience. Neuron. 50, 749-763 (2006).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37, 173-182 (1991).
- Forster, E., Zhao, S., Frotscher, M. Laminating the hippocampus. Nature Reviews. Neuroscience. 7, 259-267 (2006).
- Holopainen, I. E. Organotypic Hippocampal Slice Cultures: A Model System to Study Basic Cellular and Molecular Mechanisms of Neuronal Cell Death, Neuroprotection, and Synaptic Plasticity. Neurochemical Research. 30, 1521-1528 (2005).
- Teschemacher, A. G., et al. Targeting specific neuronal populations using adeno- and lentiviral vectors: applications for imaging and studies of cell function. Experimental Physiology. 90, 61-69 (2005).
- Kantor, B., Bailey, R. M., Wimberly, K., Kalburgi, S. N., Gray, S. J. Methods for gene transfer to the central nervous system. Advances in Genetics. 87, 125-197 (2014).
- Mächler, P., et al. In Vivo Evidence for a Lactate Gradient from Astrocytes to Neurons. Cell Metabolism. 23, 94-102 (2016).
- Schreiner, A. E., Berlinger, E., Langer, J., Kafitz, K. W., Rose, C. R. Lesion-Induced Alterations in Astrocyte Glutamate Transporter Expression and Function in the Hippocampus. ISRN Neurology. 2013, 893605 (2013).
- Haber, M., Zhou, L., Murai, K. K. Cooperative astrocyte and dendritic spine dynamics at hippocampal excitatory synapses. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 26, 8881-8891 (2006).
- Neary, J. T., Kang, Y., Tran, M., Feld, J. Traumatic injury activates protein kinase B/Akt in cultured astrocytes: role of extracellular ATP and P2 purinergic receptors. Journal of Neurotrauma. 22, 491-500 (2005).
- Xia, J., et al. Neurons respond directly to mechanical deformation with pannexin-mediated ATP release and autostimulation of P2X7 receptors. The Journal of Physiology. 590, 2285-2304 (2012).
- Ainscow, E. K., Mirshamsi, S., Tang, T., Ashford, M. L., Rutter, G. A. Dynamic imaging of free cytosolic ATP concentration during fuel sensing by rat hypothalamic neurones: evidence for ATP-independent control of ATP-sensitive K+ channels. The Journal of Physiology. 544, 429-445 (2002).
- Arcuino, G., et al. Intercellular calcium signaling mediated by point-source burst release of ATP. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 9840-9845 (2002).
- Rajendran, M., Dane, E., Conley, J., Tantama, M. Imaging Adenosine Triphosphate (ATP). The Biological Bulletin. 231, 73-84 (2016).
- Rangaraju, V., Calloway, N., Ryan, T. A. Activity-driven local ATP synthesis is required for synaptic function. Cell. 156, 825-835 (2014).
- Chatton, J. Y., Pellerin, L., Magistretti, P. J. GABA uptake into astrocytes is not associated with significant metabolic cost: implications for brain imaging of inhibitory transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 12456-12461 (2003).
- Magistretti, P. J., Chatton, J. Y. Relationship between L-glutamate-regulated intracellular Na+ dynamics and ATP hydrolysis in astrocytes. Journal of Neural Transmission (Vienna). 112, 77-85 (2005).
- Langer, J., et al. Rapid sodium signaling couples glutamate uptake to breakdown of ATP in perivascular astrocyte endfeet. Glia. 65, 293-308 (2017).
- Yaginuma, H., et al. Diversity in ATP concentrations in a single bacterial cell population revealed by quantitative single-cell imaging. Scientific Reports. 4, 6522 (2014).
- Tantama, M., Martinez-Francois, J. R., Mongeon, R., Yellen, G. Imaging energy status in live cells with a fluorescent biosensor of the intracellular ATP-to-ADP ratio. Nature Communications. 4, 2550 (2013).
- Nakano, M., Imamura, H., Nagai, T., Noji, H. Ca2+ Regulation of Mitochondrial ATP Synthesis Visualized at the Single Cell Level. ACS Chemical Biology. 6, 709-715 (2011).
- Mollajew, R., Toloe, J., Mironov, S. L. Single KATP channel opening in response to stimulation of AMPA/kainate receptors is mediated by Na+ accumulation and submembrane ATP and ADP changes. The Journal of Physiology. 591, 2593-2609 (2013).
- Pathak, D., et al. The Role of Mitochondrially Derived ATP in Synaptic Vesicle Recycling. The Journal of Biological Chemistry. 290, 22325-22336 (2015).
- Karus, C., Mondragao, M. A., Ziemens, D., Rose, C. R. Astrocytes restrict discharge duration and neuronal sodium loads during recurrent network activity. Glia. 63, 936-957 (2015).
- Larsen, B. R., Stoica, A., MacAulay, N. Managing Brain Extracellular K+ during Neuronal Activity: The Physiological Role of the Na+/K+-ATPase Subunit Isoforms. Frontiers in Physiology. 7, 141 (2016).
- Ruminot, I., et al. NBCe1 mediates the acute stimulation of astrocytic glycolysis by extracellular K+. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 14264-14271 (2011).
