Een native Western Blot-methode voor het analyseren van endogene interferon regulatoire factor 5 door dimerisatie in de CAL-1 plasmacytoïde dendritische cellijn wordt beschreven. Dit protocol kan ook worden toegepast op andere cellijnen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Inheemse polyacrylamidegel elektroforese immunoblot analyse van endogene IRF5 Dimerization
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Interferon regulerend factor 5 (IRF5) is een belangrijke transcriptiefactor voor het reguleren van de immuunrespons. Het is stroomafwaarts van de tol-achtige receptor myeloïde differentiatie primaire reactie Gene 88 (TLR-MyD88) signalering traject. IRF5 activering omvat fosforylering, dimerization, en daaropvolgende translocatie van het cytoplasma in de Nucleus, die op zijn beurt induceert de genexpressie van verschillende pro-inflammatoire cytokines. Een detectie test voor IRF5 activatie is essentieel voor het bestuderen van IRF5 functies en de bijbehorende trajecten. Dit artikel beschrijft een robuuste assay voor het detecteren van endogene IRF5 activering in de CAL-1 Human plasmacytoid dendritische Cell (pDC) regel. Het protocol bestaat uit een gemodificeerde nondenaturerende elektroforese test die IRF5 kan onderscheiden in zijn monomeer en dimeer vormen, waardoor een betaalbare en gevoelige aanpak wordt geboden om IRF5 activatie te analyseren.
Inleiding
Interferon Regulatory factor 5 (IRF5) is een belangrijke transcriptie regulator die een prominente rol speelt bij het reguleren van de immuunrespons, met name bij de afgifte van pro-inflammatoire cytokinen en type I-interferonen (IFNs)1,2 ,3. Misregulatie van IRF5 is een bijdragende factor in talrijke auto-immuunziekten, zoals blijkt uit verschillende polymorfismen in de IRF5 Locus die geassocieerd zijn met systemische lupus erythematosus, multiple sclerose, reumatoïde artritis, etc.4, 5,....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Opmerking: Het hier beschreven protocol gebruikt CAL-1 pDC-cellijn behandeld met resiquimod (R848), een agonist voor TLR7/8. Dit protocol is toegepast op andere menselijke en muriene celtypen, met inbegrip van RAW 264,7 (Murine macrofaag lijn), thp-1 (humane monocytische cellijn), bjab (menselijke b cellijn), Ramos (humane b cellijn), en mutz-3 (humane dendritische cellijn)23.
1. stimulatie van CAL-1-cellen
- Houd CAL-1 celculturen in een T75 kolf bij 37 °C en 5% CO2 onder steriele condities met 20 − 25 ml rpmi 1640 medium met 5% foetaal runderserum (FBS), 25 mm Hepes en 1x mercapt....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De immunoblot (IB) met een anti-IRF5 antilichaam werd uitgevoerd op CAL-1 cellen ongeprikkeld of gestimuleerd met 1 μg/mL R848 voor 2 uur (Figuur 1). Er zijn cellysaten voorbereid en de oorspronkelijke pagina is uitgevoerd. In ongestimuleerde CAL-1-cellen werd IRF5 gedetecteerd als een enkele band op de oorspronkelijke pagina, overeenkomend met zijn monomerische vorm. Bij de behandeling van CAL-1-cellen met R848 voor 2 uur daalde het niveau van IRF5 monomeer met een gelijktijdige toename van.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het protocol beschreven hier is een gemodificeerde inheemse pagina die zowel monomere en dimeer vormen van endogene IRF5 onderscheidt. Er zijn weinig studies die melden van de detectie van endogene IRF5 activering met behulp van de gespecialiseerde Imaging flow cytometrie techniek23,27,28,30. Dit protocol maakt gebruik van een veelgebruikte techniek en gebruikte reagentia en hulpmiddelen om de .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Het werk werd gesteund door de financiering van de Croucher Foundation en de Startup fondsen van de City University. We danken alle leden van het Chow Laboratory voor hulp bij het experiment en het kritisch lezen van het manuscript.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 2-Mercaptoethanol | Life Technologies, HK | 21985023 | |
| 300 W/250 V voeding 230 V AC | Life Technologies, HK | PS0301 | |
| Anti-IRF5-antilichaam | Bethyl Laboratories, VS | A303-385 | |
| BIOSAN schuddende schudden (koude ruimte veilig) | EcoLife, HK | MR-12 | |
| EDTA-buffer, pH 8, 0,5 M 4x 100 mL | Life Technologies | 15575020 | |
| Glycerol 500 mL | Life Technologies | 15514011 | |
| Glycine | Life Technologies, HK | 15527013 | |
| Geit anti-muis IgG DyLight 800 geconjugeerd antilichaam | LAB-A-PORTER/Rockland, HK | 610-145-002-0.5 | |
| Geit anti-konijn IgG DyLight 800 geconjugeerd antilichaam | LAB-A-PORTER/Rockland, HK | 611-145-002-0.5 | |
| Halt proteaseremmercocktail (100x) | Thermo Fisher Scientific, HK | 78430 | |
| HEPES | Life Technologies, HK | 15630080 | |
| LI-COR Odyssey blokkerende buffer (TBS) | Gene Company, HK | 927-50000 | |
| Mini Tank blot-modulecombo; Overdrachtsmodule, accessoires | Life Technologies, HK | NW2000 | |
| NativePAGE 3-12% gels, 10 well kit | Life Technologies, HK | BN1001BOX | |
| NativePAGE Running Buffer 20x | Life Technologies, HK | BN2001 | |
| NativePAGE Sample Buffer 4x | Life Technologies, HK | BN2003 | |
| NP-40-alternatief, Nonylfenylpolyethyleenglycol | Tin Hang/Calbiochem, HK | #492016-100ML | |
| PBS 7,4 | Life Technologies, HK | 10010023 | |
| Polyvinylideendifluoride (PVDF)-membraan | Bio-gene/Merck Millipore, HK | IPFL00010 | |
| Eiwittestkit II (BSA) | Bio-Rad, HK | 5000002 | |
| R848 | Invivogen, HK | tlrl-r848 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies, HK | 61870127 | |
| Natriumchloride | ThermoFisher | BP358-1 | |
| Natriumdeoxycholaat ≥97% (titratie) | Tin Hang/Sigma, HK | D6750-100G | |
| Tris | Life Technologies, HK | 15504020 | |
| TWEEN 20 | Tin Hang/Sigma, HK | #P9416-100ML |
Referenties
- Takaoka, A., et al. Integral role of IRF-5 in the gene induction programme activated by Toll-like receptors. Nature. 434 (7030), 243-249 (2005).
- Ren, J., Chen, X., Chen, Z. J. IKKbeta is an IRF5 kinase that....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
Meer artikelen verkennen
