יצירת פרופיל אוביקוויפין ואוביקוויב-שינויים עצמאיים וזיהוי של שינויים משמעותיים

Summary

פרוטוקול זה מטרתו להקים אוביקוויב (וכדומה) ו אוביקוויב-אוהב (Ubls) הפרוטאמים ספציפיים כדי לזהות שינויים של סוג זה של שינויים לאחר העברה (לאחר ההעברה), הקשורים במצב ספציפי כגון טיפול או פנוטיפים.

Abstract

אוביקוויב (רוב) והשינויים התלויים שלאחר ההעברה של חלבונים לשחק תפקידים ביולוגיים בסיסיים בתוך התא על ידי שליטה ביציבות החלבון, פעילות, אינטראקציות, ולוקליזציה תאיים. הם מאפשרים לתאים להגיב לאותות ולהסתגל לשינויים בסביבתו. שינויים במנגנונים אלה עלולים לגרום למצבים פתולוגיים חמורים כגון מחלות ניווניות וסרטן. מטרת הטכניקה המתוארת כאן היא להקים פרופילים התלויים בפרופילי מדים והכל, במהירות ובדייקנות, מקווי תאים מתורבתים. השוואת פרופילים שונים המתקבלים מתנאים שונים מאפשרת זיהוי של שינויים ספציפיים, כגון אלה הנגרמת על ידי טיפול למשל. התמרה ויראלית מתווכת תא מבוצעת כדי ליצור קווי תאים יציבים המבטא שני תגים (6His ודגל) גירסה של משנה (אוביקוויב או ubl כגון SUMO1 או Nedd8). תגים אלה מאפשרים טיהור של אוביקוויב ולכן של חלבונים אוביקווילביים מן התאים. הדבר נעשה באמצעות תהליך טיהור דו-שלבים: הראשון מבוצע בתנאים מסוימים תוך שימוש בתגית השישית, והשני בתנאים מקוריים המשתמשים בתג ' דגל '. זה מוביל לבידוד מאוד ספציפי וטהור של חלבונים שהשתנו אשר מזוהים לאחר מכן למחצה כימות על ידי כרומטוגרפיה נוזלית ואחריו באמצעות ספקטרומטריה מאסיבית המסה (LC-MS/MS) טכנולוגיה. ניתוח לאינפורמטיקה קלה של נתוני MS באמצעות תוכנת Excel מאפשר הקמת פרופילי PTM על ידי ביטול אותות רקע. פרופילים אלה מושווים בין כל תנאי כדי לזהות שינויים ספציפיים אשר לאחר מכן ילמדו באופן ספציפי יותר, החל באימות שלהם על ידי טכניקות ביוכימיה סטנדרטית.

Introduction

השיטה המוצעת כאן מוקדש לחקר הגברת המתווכת על ידי בני משפחה אוביקוויב מתאי יונקים מתורבתים כדי לזהות שינויים פוטנציאליים הקשורים בתנאי ספציפי (טיפול, בידול, וכו '). פטין מייצג את השלב האחרון של רגולציה של החלבונים ' פונקציות¹. אכן, לאחר שיוצרו על ידי מכונות הטרנסלטיות, רוב אם לא כל החלבונים עוברים סוגים שונים של פטין כי לווסת את פעילותם, אינטראקציות מולקולריות, ו תאיים מיקום¹. בין שפע של לפטין הם אלה בתיווך על ידי משפחת אוביקוויב של חלבונים, אוביקוויב עצמו ואת כל אוביקוויב-אוהב, יש את הפוטנציאל לווסת את כל החלבונים תאיים או חלקי cytoplasmic². בגלל שהם עצמם חלבונים, הם יכולים להיות מצויידים אחד לשני, יצירת רשתות הומוגנית והטרוגנית של טופולוגיות שונות, כל אחד משויך פונקציות רגולטוריות ספציפיות². כלים נחוצים כדי לנסות לפענח ולהבין זה מכונות מורכבות. גישות רבות פותחו ברחבי העולם, בעלי יתרונות וחסרונות משלהם, וכאן אנו מציעים אחד עם ביצועים גבוהים המתאימים לתאים מתורבתים.

היתרון העיקרי של שיטה זו הוא הדיוק שלה. אכן, הטוהר של חלבונים מבודדים שונה הוא משופר מאוד על ידי שימוש קומבינטורית של שני התגים (6his ודגל) ואת שני הליך ההליך ולכן זה הרבה יותר סלקטיבי מאשר תג אחד פיוז ' ן ו/ubl^3,4. הנוכחות של התגית 6His מאפשר צעד ראשון של טיהור במצב מלאה לחלוטין ובכך הימנעות כל שיתוף טיהור של חלבונים המכילים אוביקוויב כריכה האיגוד או מחייב חלבונים אחרים של הכריכה. זוהי בעיה טכנית נתקל מספר גישות אחרות המבוססות על טיהור אהדה של פרוטמס אובימבחנות באמצעות נוגדנים ספציפיים⁵ או מרכיבים כריכה אוביקוויב (צינוריות)⁶. חשוב מכך, טכניקה זו אינה מוטה לטובת טיהור של סוג מסוים של אוביקווינציה, כפי שהוא יכול להיות במקרה של גישות אחרות, שכן הן מונו והן סוגים שונים של polyubiquitinations זוהו⁷. כתוצאה מכך, לאחר שנמצא, שינוי של אוביקווינציה יהיה צריך ללמוד בפרטים נוספים על ידי גישות ביוכימיות סטנדרטיות כדי לזהות את הסוג המדויק של אוביקווינציה המעורבים.

לבסוף, יתרון טכני נוסף של פרוטוקול זה הוא השימוש של וירוסים, כי בקלות ובמהירות יוצר ביטוי יציב קווי התא עם רמה סבירה של ביטויים של משנה מתויג מבלי להפריע התנהגות סלולרית נורמלית.

ואילו תפקיד חשוב אחד של אוביקווינציה היא למקד חלבונים עבור השפלה פרוטאספאל, ידוע כיום כי יש לו תכונות רגולטוריות רבות אחרות עבור חלבונים ביותר תאיים או באופן חלקי תאיים¹. מספר הפונקציות הללו מוגבר עוד יותר על-ידי קיומם של אוביקווינים רבים כמו חלבונים, ויוצרים משפחה של חלבונים המסדירים כמעט כל מנגנוני תא¹. שינויים שלהם יכול להיות השפעה דרסטית על ביולוגיה התא יכול להוביל או להשתתף במצבים פתולוגיים⁸, כגון סרטן⁹. מכאן, כלים נחוצים כדי לחקור את הנוף העצום הזה ולזהות את השינויים הקשורים במצב פתולוגי שיכול לשמש כמטרות טיפוליות מספר.

פרוטוקול זה מוקדש תאים בתרבות מאז הם צריכים להיות מתותמרים כדי לבטא אקסוגני מתויג ועוד/Ubl. לאחר שנוצר, אלה קווי תא יציבה ניתן להשתמש כדי ליצור פרופילים Ubl מהתרבות ב 2D או 3D או שתלי xenografts ובכך להאריך את האופק של מודלים ניסיוניים שונים, כי ניתן להחיל על לימוד לימודי פרופילים.

Protocol

1. הדור של קווי תאים יציבים המבטא 6His-דגל-Ubl

הערה: שיתוף משותף של תאים HEK-293T עם pCCL-6HF-Ubl, pVSVG ו דלתא עוזר.

1. יום 0: התאים 293T הזרע בצלחת 6-הבאר כדי להשיג 50-70% המפגש היום אחרי.
2. יום 1: שיתוף 50-70% תאים confluent עם שילוב של 1 μg של pCCL-6HF-Ubl או pCCL-GFP, 1 μg של pVSVG ו-1 μg של דלתא-עוזר וקטורים, באמצעות מגיב העברה ופרוטוקול עבור ייצור וירוס. לאחר 6 שעות של העברה, לשנות את המדיום לאחד טרי המתאים לתאים להיות התמרה. הזרע את התאים להיות מותמרים ב 6 צלחת הבאר כדי לקבל 10-20% המפגש היום לאחר (היום של התחלת התמרה).
3. יום 2:24 h לאחר החצייה, לשחזר את המדיום המכיל חלקיקים לסנן ומסננים באמצעות 0.45 יקרומטר מסננים. במקרה הצורך, הוסיפו מדיום טרי בנקודה זו כדי ליצור קבוצה נוספת של הווירוסים. החלף את מדיום התאים שיש לסנן (10-20% זרימה) על-ידי האחד המכיל את הווירוסים.
   הערה: המדיום האנטי-ויראלי ניתן לשמור ב-+ 4 ° c למשך מספר ימים לפני התמרה או מאוחסנת ב-80 ° c במשך חודשים.
4. דגירה את התאים עם הווירוסים בין 24 h כדי 72 h באינקובטור רגיל (37 ° צ', 5% CO₂), ולאחר מכן לשנות את המדיום עבור תקן טרי אחד. במידת האפשר, בדוק את הביטוי GFP בעזרת מיקרוסקופ פלורסנט הפוך כדי להעריך את יעילות התמרה: אחוז הביטוי של תאים ורמת ביטוי יחסית לכל תא. אם לא מזוהה זריחה, המתן ל2-3 ימים נוספים כביטוי עשוי להימשך זמן רב יותר בהתאם לסוג התאים שיש להתמרה.
5. אם שליטה GFP הוא חיובי, לגדל את כל התאים עד שיהיה מספיק כדי לבצע שליטה ביטוי של 6HF-Ubl על ידי מimmunofluorescence כתמי המערבי באמצעות נוגדן נגד הדגל.

2. טיהור כפול של חלבונים ששונו

הערה: מאגר 1:6 M Guanidinium-HCl, 0.1 M Na₂hpo₄/נה₂PO₄, pH 8.0, 0.5% טריטון X-100.
מאגר 2:50 mM נה₂הפו₄, 150 מ"מ הנאל, 1% Tween20, 5% גליצרול, pH 8.0.
מאגר 3:100 mM NH₄hco₃, pH 8.0.

1. פירוק התא: לאחר מוכן, לשטוף מנות התרבות לפחות פעם אחת עם מלוחים באגירה פוספט (PBS) בטמפרטורת החדר (RT) ולהמשיך לפירוק תאים או, לחילופין, הקפאת פלאש בנוזל N₂ ולאחסן ב-80 ° c. לפירוק, להוסיף 2 מ ל של מאגר 1 לכל 15 ס מ צלחת ב RT. השתמש במגרד התא כדי לשחזר את כל lysates ב 50 mL צנטריפוגה צינורות (הכרך הסופי על 20 מ ל).
2. Sonicate lysates שלוש פעמים עבור 30 s מופרדים על ידי 1 דקות הפסקה.
3. צנטריפוגה את sonicated lysates ב 15,000 x g עבור 15 דקות.
4. העבר את הסופרנטאנט לצינור חדש באמצעות מסננת תאים (40 μm).
5. קביעת הריכוז של דגימות והתאמה, במידת הצורך, כדי להשיג את אותה כמות של חלבונים וכלי אותו נפח. השתמש כמות כוללת של חלבון בין 50 ו 100 mg (10 מנות עם קוטר 15 ס מ עבור מיאפאקה -2 תאים).
6. הוסף Ni^{2 +}-נ. ת. ע חרוזים, באמצעות 2 μl של חרוזים ל 1 מ"ג של חלבון.
7. לסובב ב 30 סל ד במהלך 2.5 h ב RT.
8. גלולה את החרוזים ב 500 x g עבור 5 דקות.
9. לשטוף את החרוזים עם 1 מ ל של מאגר 1, העברת דגימות לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL, ואז להעביר את הצינורות על הקרח. בצע את כל השלבים הבאים בקרח או ב -4 ° c.
10. שטוף פעמיים עם 1 מ ל של מאגר קר קרח 2 המכיל 10 מילימטר.
11. כדי להוסיף חלבונים כבולים, הוסף 600 μL של מאגר 2 המכיל 250 מילימטר ומסתובב עבור 2 h ב 4 ° c.
12. גלולה את החרוזים על ידי צנטריפוגה ב 500 x g עבור 1 דקות. להעביר את supernatants לחדש, טרום מקורר, 1.5 מנורות mL ולהוסיף 50 μl של אנטי דגל M2 הנוגדן חרוזים מצוקדים.
13. לסובב ב 30 סל ד עבור 2.5 h ב 4 ° c, ולאחר מכן לשטוף 2 פעמים עם 500 μL של מאגר 2, אז 2 פעמים עם 500 μL של מאגר 3.
14. עבור האחרון להתחמק, להוסיף 100 μL של מאגר 3 המכיל פפטיד דגל ב 0.1 μg/μL ולסובב ב 4 ° צ' עבור 1.5 h.
15. צנטריפוגה ב 500 x g עבור 1 דקות ולהעביר את סופרנטנים כדי צינורות חדשים מקורר מראש.
16. קח 10% (10 μL) כדי לטעון על SDS-PAGE ולבצע כתמים כסף של ג'ל כדי לשלוט על איכות הטיהור. אם טיהור נראה טוב, לנתח את 90% משמאל LC-MS/MS.

3. עיבוד נתונים בספקטרומטר מסה כדי ליצור פרופילים של מערכות מידע וכד לזיהוי הבדלים משמעותיים ביניהם

הערה: תוצאות מניתוח MS מכילות מידע רב כולל את המספר הכולל של פפטידים, כמו גם את ערכי אזור השיא (ממוצע של ראש 3 פפטיד אזור¹⁰) עבור כל חלבון מזוהה בכל דגימות. ניתן לעבד נתונים אלה באמצעות מספרי ספירת הפפטיד או ערכי אזור השיא, או שניהם. עבור חישוב עם אזורי שיא, מכיוון שערכים אלה נמצאים בדרך כלל בטווח של 10⁶, יש צורך לחלק אותם לפי סדר זה לפני החלת נוסחאות זהות להלן. התוצאות שהתקבלו עם שתי מתודולוגיות של ספירה צריך להראות מתאם חזק כפי שהוא בדרך כלל. עבור כל חלבון מזוהה, השתמש בנוסחאות הבאות כאשר:
בדיקת פפטידים v1 במדגם שאינו מטופל (g., ועוד-סם)
v2 ערכי פפטידים ב Gemcitabine התייחסו למדגם אוביקוויב (למשל, ועוד תרופה)
k1 מערכי פפטידים בבקרה שאינה מטופלת gfp (למשל, gfp-תרופה)
k2 ערכי פפטידים ב Gemcitabine שליטה במדגם gfp (g., gfp + תרופה).

1. נורמליזציה: נרמול ערכים בין תאים המתייחסים לתרופות לתאים שאינם מטופלים עבור אוביקוויב ו-GFP באמצעות הנוסחאות הבאות. V = V מנורמל ומנורמל k = K.
   V1 = v1. (∑ v1 + ∑ v2)/(2. ∑ v1); V2 = v2. (∑ v1 + ∑ v2)/(2. ∑ v2)
   K1 = K1. (∑ k1 + ∑ k2)/(2. ∑ k1); K2 = k2. (∑ k1 + ∑ k2)/(2. ∑ k2)
2. הסרת רקע: שימוש בנוסחאות הבאות, להחסיר ערכים במדגם שליטה (GFP) מהערכים במדגם אוביקוויב להשיג ערכים ספציפיים (V ' 1 ו-V ' 2) עבור כל חלבון מזוהה בשני התנאים.
   V ' 1 = V1-K1 אם V1-K1 ≥ 0; V ' 1 = 0 אם V1-K1 < 0
   V ' 2 = V2-K2 אם V2-K2 ≥ 0; V ' 2 = 0 אם V2-K2 < 0
3. וריאציה (Var) של אוביקווינציה. כדי לקבל ציון (בין-100 + 100) עבור וריאציות חיוביות ושליליות של פטין הנגרמת על ידי תרופה, השתמש בנוסחה הבאה שבה ההפרש בין ערכים ספציפיים של דגימות מטופלים ולא מטופלים מחולקים לפי הסכום של כל הערכים, כולל אלה ב שליטה (כדי להפוך חלבונים מזוהים גם בקרת GFP), ולהתרבות על ידי 100.
   Var = (ו-2-V ' 1)/(V1 + K1 + V2 + K2) * 100; -100 < Var < 100;
   וריאציות להלן-50 (דיכוי PTM) או מעל 50 (אינדוקציה PTM) נחשבים בדרך כלל משמעותיים.
4. ביטחון (Conf). השתמש בנוסחה הבאה כדי לקבל ערך ביטחון בין 0 ל-100%,:
   Conf = (V1 + V2)²/(1 + V1 + V2 + K1 + K2)²) * 100-100/(1 + V ' 1 + v ' 2); = 0 אם < 0
   ערכים מעל 50 נחשבים בדרך כלל להיות בטוחים.
5. כדי לקבל התפלגות נחמדה יותר של ערכי אינדוקציה/דיכוי ולשקול הן וריאציה ופרמטרים ביטחון, להכפיל את ערכי Var ו- Conf באמצעות הנוסחה הבאה שבה V Var ו-C Conf
   = SI (V2 > 0;((V2 * C2) ^ 2)/(10 ^ 6);-((V2 * C2) ^ 2)/(10 ^ 6))
   הערה: ככל שערכי אזור השיא בדרך כלל מדויקים יותר מספירת פפטיד, ניתן להשתמש בתוכנה ספציפית המוקדשת לפרשנות של נתונים מסוג זה, כגון פרסאוס (https://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus), בעקבות המלצות לשימוש.

Representative Results

התמרה של תאי היונקים התרבותיים ליצירת תאים מבוססי GFP ו-6HF.
כדי לייצר וירוסים שישמשו מאוחר יותר כדי לשנות את MiaPaCa-2 תאים, 70% confluent HEK-293T תאים הם שיתוף עם כמות שווה של שלושה וקטורים, pCCL-6HF-אוביקוויב או GFP/דלתא-עוזר/pvSvG. לאחר 24 שעות של ייצור, המדיום המכיל חלקיקי הנגיף הוא התאושש ומסונן. זה אפשרי בשלב זה כדי לשלוט על היעילות של התרגום על ידי בדיקת הזריחה הירוקה של GFP המבטא תאים 293T על מיקרוסקופ הפוך. זה צריך להיות ליד 100% של תאים. התאים של MiaPaCa-2 מודדיתיים עם סופר ויראלי במשך 1 עד 3 ימים. היעילות של התמרה ויראלית מבוקרת לראשונה על ידי התבוננות בזריחה GFP של תאים GFP התמרה (איור 1פאנל עליון) . רמת הביטוי GFP עשויה להשתנות מתא אחד לאחר, אך 100% מהם צריכים להיות פלורסנט. לאחר שליטה זו מתבצעת, הביטוי של דגל-אוביקוויין יהיה חייב להיות נשלט גם. פעולה זו מתבצעת על-ידי כתמים immunofluorescence באמצעות נוגדן נגד הדגל (בדרך כלל M2מונבטיים ) (איור 1פאנל תחתון). זה יראה את אחוז התאים שעברו התמרה, אשר צריך להיות 100% כדי להבטיח ביטוי יציב על פני מעברים עתידיים של תרבות התא. על מנת לשלוט ברמת הביטוי של דגל אקסוגני-אוביקוויב, ליסטטים מתאי התמרה מנתחים על ידי SDS-PAGE ואחריו כתם מערבי עם נוגדן נגד דגל (איור 1B). שני קווי התא יכולים להיות קפואים.

שני צעדים לטיהור ובקרה ע י העמוד וצביעת הכסף
ברגע יציבה ביטוי קווי התא כבר מאומת, הן GFP ו 6HF-התאים מוגבר עד מספיק חומר מושגת על מנת להמשיך עם טיהור שני שלבים. מומלץ לשמור גיבוי של קווי תאים אלה כמו מלאי קפוא בחנקן נוזלי כדי להיות מסוגל להפשיר אותם בעת הצורך. 36 h לפני העיבוד, מחצית התאים (מחצית GFP וחצי 6HF-אוביקוויטין) מטופלים עם 10 μM של Gemcitabine. כאשר מוכן, חלבונים אוביקוויניים מטוהרים מ 6HF-אוביקוויב ומתאי בקרה של GFP, באמצעות פרוטוקול טיהור שנישלבים(איור 2א). 10% מהיורקציה הסופית משמשת לשליטה בכמות ובשלמות של חומר מטוהר על ידי SDS-PAGE ו כתמים כסף של ג'ל (איור 2ב). מולקולרית סמנים משקל להקות ניתן להשתמש כדי להעריך את כמות החלבונים אוביקוויטילים מטוהרים. לחילופין, כמות ידועה של BSA או כל חלבון אחר ניתן לטעון בקו של ג'ל כדי לסייע לכמת את החלבונים מטוהרים. לאחר שאימות זה נעשה, הנותרים 90% מדגימות מנותח על-ידי כרומטוגרפיה נוזלית מצמידים בעזרת ספקטרומטר מסה משולב כדי לאפשר זיהוי וכימות למחצה של חלבונים מטוהרים.

זיהוי חלבונים אוביקווילים ברקע (דגימות GFP) חיסור
נתונים מ-LC-MS/MS ניתוח של דגימות לתת את שמות וכימות (השיא באזורים ומספר פפטידים נצפתה) של כל חלבון מזוהה ב-GFP ו 6HF-ורוב דגימות. החלבונים בעל הקוונפיקציה הגבוהה ביותר במדגם אוביקוויב לעומת המדגם GFP הם הסבירות ביותר להיות אלה באמת אוביקוויל והחלת הנוסחאות המתוארות בשיטות לעיל מאפשר סיווג שלהם על ידי מתן ציון ביטחון מ -0 עד 100% . חלבונים המזוהים עם תוצאה מעל 50% נחשבים לאלה המכילים אוביקווילים (איור 3א).

שלב זה אשר ביסודו של דבר מסיר את החלבונים ברקע (GFP) מדגימות אוביקוויב הובילו לזיהוי של 364 חלבונים באופן משמעותי אוביקווילי (איור 3ב)⁷. הערה כאן החלבונים המזוהים עם הציונים הגבוהים ביותר מוכרים בעיקר כמטרות עיקריות של אוביקווינציה אשר מוכיחה את היעילות של שיטת טיהור זו.

לאחר מכן ניתן לבצע ניתוח העשרה של מערכת גנים (gsea) של חלבונים אוביקוויריים אלה כדי להדגיש את התהליכים הביולוגיים בהם הם מעורבים (איור 3ג), הפונקציות המולקולריות שלהם, התא התאי שלהם, או כל סיווג אחר של. אונטולוגיה של הגנים מעניין להשוות את הפרוטזום הזה אוביקוויל עם מלוא הדרך של התא כאשר הדבר אפשרי. אכן, ניתוח זה מגלה את התרומה האמיתית של חלבונים אוביקוויתיים אלה בתהליכים ספציפיים כגון תרגום או פרוטפוליזיס למשל (איור 3ג).

המטרה העיקרית של סוג זה של ניסוי הוא לזהות שינויים בתוך הפרוטדום אוביקווילי המושרה על ידי טיפול למשל, כאן gemcitabine. על ידי השוואת אוביקוויבידום (פרוטאום ספציפי אוביקוויל) בתאים מטופלים ולא מטופלים באמצעות הנוסחה הספציפית תשואות ערך מ-100 (דיכוי של אוביקווינציה) כדי + 100 (אינדוקציה של אוביקווינציה). בהתחשב רק בערכים שלהלן-50 או מעל + 50 כמשמעותי, סך של 73 המושרה אוביקוויט ו -29 אוביקוויט מודחקים זוהו (איור 4א). GSEA ניתוח של שינויים אלה של אוביקווינציה חשף enrichments ספציפיים בתהליכי תיקון DNA או מחזור התא, וריאציות חשובות תרגום ו-RNA תהליכים מטבולית (איור 4ב). תוצאה זו היא הגיונית מאוד מאז gemcitabine הוא אנלוגי בסיס שחוסם סינתזה DNA ומעוררת נזקי DNA.

כדי ללכת רחוק יותר, זה גם מעניין להשתמש במסדי נתונים של האינטראקציה חלבונים כדי לחקור ולאמת רשתות אינטראקציה פוטנציאליים שנוצרו על ידי המושרה gemcitabine שינויים של אוביקווינציה (איור 5). זה הוביל לזיהוי של רשתות אינטראקציה תפקודית מושפע מאוד על ידי מוגברת או ירידה אוביקווינציה של חלבונים מעורבים.

לבסוף, בין היתר אוביקווינציה שונה, כמה יכול להיות כרוך חלבונים של האינטרסים הגבוהים ביותר, בשל הפונקציות הידועות שלהם או הפוטנציאל על פי ספרות. מכאן, צעד חשוב אחד הוא לאמת כי מה שנצפה על ידי ספקטרומטר מסה הוא אמיתי ואמין. PCNA היה אחד מן החלבון הגדול ביותר-אוביקוויל על טיפול gemcitabine שזוהו על ידי ניתוח ספקטרומטר המסה (איור 4א). כדי לוודא gemcitabine אכן מעורר את אוביקווינציה של PCNA, MiaPaCa-2 תאים המבטא 6HF-ורוב ו-GFP הם גדלו, מטופלים או לא, ובכפוף לטיהור של Ni-נ. ת. בתנאים או נגד הדגל immunoprecipitation ואחריו דגל הימנעות פפטיד בתנאים מקוריים, נפתרה על SDS PAGE ואחריו הכתם המערבי עם הנוגדן המתאים. התוצאה המוצגת באיור 6 מאושר כי באמת pcna הוא אוביקוויל מאוד בתגובה לטיפול gemcitabine בתאים MiaPaCa-2.

איור 1: הקמת קווי תאים יציבים המבטא 6His-דגל-Ubl. (א) שליטה של ביטוי gfp ב-gfp התמרה תאים (הפאנל העליון) ו של 6His-דגל-אוביקוויב על ידי immunofluorescence באמצעות אנטי דגל (M2) נוגדן כמו העיקרי ו אלקסה-567 אנטי עכבר נוגדן משני. DAPI שימש להכתים גרעינים. סרגל קנה מידה: 50 μm. (ב) שליטה של 6His-דגל-אוביקוויב ביטוי בתא lysates על ידי אבן החשופה המערבי באמצעות נוגדן נגד הדגל (לחילופין, אנטי-6his ניתן להשתמש) בצד שמאל, אנטי אוביקוויב נוגדן, מצד ימין, כדי להשוות את הביטוי של 6His-דגל-אוביקווימין (6HIS-אוביq) עם אוביסוגמין אנדוגאין (אנדו. אוביקיו). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: שני צעדים לטיהור של חלבונים אוביקוויניים. (א) ייצוג סכמטי של הנוהל. (ב) 10% של הימנעות הסופי היה נתון SDS עמוד ואחריו כתמים כסף של ג'ל כדי להעריך את כמות וטוהר (לעומת gfp) של חלבונים מבודדים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: זיהוי חלבונים אוביקוויביים (המותאמים לבונואצ'י ואח '). ⁷). (A) הסכום היחסי של ספציפי (מדגם אוביקוויב) ולא ספציפי (מדגם gfp) של כל חלבון מזוהה הותווה בתפקוד של הציונים שלהם בטוחים. כפי שמוצג, את היחס של החלבונים שאינם ספציפיים על החלבון אוביקוויל הופך חשוב מדי מתחת לציון של 50. מכאן, רק חלבונים המזוהים עם ציון מעולה 50 נחשבים משמעותיים. (ב) הטבלה המציגה את 20 החלבונים הטובים ביותר אוביקווילים בין 364-סה כ זוהו. (ג) למחיצות של חלבונים אוביקוויניים וחלבונים מוחלטים של התאים MiaPaCa-2 בתוך תהליכים ביולוגיים (ערכים > 1.5% נחשבו רק). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: Gemcitabine המושרה שינויים של פרופילי PTM (מותאם בונאצ'י ואח '. ⁷). (א) רישום של 20 החלבונים עם הגבוה ביותר (סה כ 73) או ירד (סה כ 29) אוביקווינציה על טיפול gemcitabine (Conf: ביטחון; תעשיה: אינדוקציה; נציג: דיכוי. (ב) למחיצות של Gemcitabine המושרה אוביקווינציה שונה בתוך תהליכים ביולוגיים והשוואה עם לא מטופלים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: interactomes פונקציונלי של gemcitabine המושרה אוביקוויצינציה שונה. אינטראקציות פוטנציאליות בין כל החלבונים עם המושרה gemcitabine שינוי של אוביקווינציה מזוהים באמצעות חלבון-חלבון האינטראקציות מסד נתונים (STRING: string-db.org). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: האימותים הביוכימיים של gemcitabine מעניין המושרה שינויים של אוביקווינציה. על מנת לאמת את אוביקווינציה מוגברת של PCNA לאחר טיפול gemcitabine, lysates של תאים ביטוי 6HF-אוביקוויטין, מטופלים או לא עם gemcitabine, היו חשופים ניקל משוך-מטה (Ni-נ. ת. ע) ואחריו בכתם מערבי anti-PCNA. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

פיתחנו מתודולוגיה חזקה ואמינה כדי ליצור פרופילים של חלבונים ששונו על ידי בני המשפחה אוביקוויב הראשי. אכן, יש לנו הוחל בהצלחה פרוטוקול זה כדי ליצור פרופילים של לפטין על ידי אוביקוויב, וגם על ידי סומו ו Nedd8, כדי לזהות שינויים הקשורים לטיפול⁷, בתגובה על הביטוי או הסתרה של גן מסוים (נתונים לא מוצגים) ובתאים שרכשו פנוטיפים עמידים לתרופות כימותרפיות מגוונות.

ישנם רק כמה צעדים קריטיים במהלך ההליך מניפולטור צריך להיות זהיר עם. לאחר ליטוף של חרוזים (Ni-נ. ת. ע או נגד הדגל מצמידים), חשוב להשעות אותם ביסודיות, במיוחד את החרוזים נגד דגל מאז הם מושעה במאגר מבוסס הגליצרול צמיג, ולחתוך קצת את סוף הקצה כדי להגדיל את הסעיף. יש לעקוב אחר אמצעי זהירות נוסף לפיפטה באיטיות כדי להימנע מערימות של חרוזים. צעדים קריטיים נוספים הם הימנעות עם שנדאזול ולאחר מכן עם פפטיד דגל. מזרק נקי המילטון חייב לשמש כדי לשחזר את הסופרנטנט לאחר הימנעות כדי להימנע, ככל האפשר ליטוף של החרוזים שעליהם חלבונים לא ספציפיים להישאר.

בהתאם לסוג התא ולכמות החומר הסופי הנדרש לספקטרומטר מסה, החומר ההתחלתי עשוי להיות מוגבר או מופחת בהתאם. לאחר מכן, ההתאמה החשובה היחידה שוכנת נפח של חרוזי ניקל כפי שהוא צריך להיות של 2 μL עבור 1 מ"ג של חלבונים ב lysate ליפוסט. זה עלול לקרות כי כמות החלבונים מטוהרים נמוך מדי. רמת הביטוי של מתויג ורוב/Ubl צריך להיות נשלט, אם זה נמוך מדי, תאים יכולים להיות מחדש התמרה באמצעות וירוסים אותו. לחילופין, ניתן להגדיל את כמות חומרי ההתחלה. לפעמים, כמות חומר מטוהר לא ספציפי ב GFP או תאים הורים הוא גבוה מדי. פתרון אחד כדי להתגבר על בעיה זו הוא להגדיל את עוצמת הקול ואת מספר שוטף הן ני-נ. ת. ע ודגל שלבי טיהור. ניתן גם להגביר את ריכוז הסרפיאזול בשטף עם מאגר גואנידין, עד 20 מ"מ. הפוך, אין צורך להגדיל את הריכוז של פפטיד הדגל בשלב הסופי האחרון כפי שהוא לא יגדיל את הימנעות. חשוב יותר להשתמש פפטיד טרי כמו לאורך זמן, גם אם מאוחסן ב-20 ° c, היעילות של הפפטיד עלול לרדת.

המגבלה העיקרית של פרוטוקול זה היא כי הוא מתאים רק עבור תאים מתורבתים כי הם צריכים להיות התמרה כדי לבטא את Ubl הרצוי מתויג. מכאן, כל מחקר על רקמות או דגימות הגידול צריך להתבצע באמצעות גישות חלופיות כגון פפטידים diGly enrichments לאחר טריפסין העיכול¹¹, immunoprecipitation עם נוגדנים ספציפיים על רוב/ubl של ריבית⁵, או שימוש של . שפופרות⁶ כל השיטות החלופיות הללו מתאימות גם ליישום שלהם בתאים מתורבתים. יש להם את היתרון של שימוש במכונות ובעלי השימוש האנדוגניים. עם זאת, קיימים מספר חסרונות. Immunoprecipitations קשה לביצוע עם רקע נמוך, כמו צינורות הגישות, חלבונים אינטראקציה עם חלבונים שהשתנו, ואפילו את השינוי עצמו, לא ניתן לחסל, אף על פי שיפורים מעשיים הושגו באמצעות תנאים מחמירים יותר. העשרה פפטידים DiGly הוא מאוד חזק, אבל יכול להתאים סוג שונה של לפטין. לדוגמה, העשרה דיקטילי מתוך טריפסין מעוחלת, תזהה בעיקר חלבונים אוביקטילים אך גם מאלה שאינם מNedd8, כפי שהוא מותיר את אותה חתימה diGly באותה מידה כאוביקוויצין עושה¹¹.

הגבלה נוספת של פרוטוקול זה היא כי הנוכחות של התגית 6His דגל עשוי לשנות את הפונקציה הרגילה של ועוד/Ubl ואת הביטוי overexpression עצמו יכול לשנות את המכונות. זה יכול למשל לעכב את הדור של רשתות polyubiquitin ולטובת מונוביוטיות. עם זאת, מאז מונו שרשראות multi ו polyubiquitin שזוהו באמצעות פרוטוקול זה, נראה כי זה לא המקרה⁷. הנוכחות של התג ב-N-טרמינוס גם מונעת היווצרות של אוביסטנציה לינארית, שם אוביקוויב moieties מקושרים יחד דרך מתיונין N-טרמינל של אוביקוויטין. עם זאת, אף על פי 6HF-udiquitin לא יכול להיות אוביקוויט על השאריות הראשונות שלה, זה עדיין יש את היכולת לסיים את סוג זה של שרשרת.

כמו כן, בעוד שזהו יתרון משמעותי לשימוש בווירוסים המאפשרים יצירת שורות תאים יציבים בשבועיים אחד או שבועיים, ייתכן שלא כל התאים היו מבטאים את המבנה הרצוי. זו עשויה להיות לא בעיה אמיתית עבור הליך טיהור כל עוד מספיק תאים לבטא את האקסוגניים ועוד/ubl, אבל הבעיה עשויה לבוא עם תרבות לטווח ארוך כמו על כמה מעברים יכול להיות וריאציה שבטיים עם העשרה בתאים עם פחות או לא ביטוי. זה חיסרון, עם זאת, יכול להיות עקף בקלות באמצעות וירוסים מכיל או גן בחירת התנגדות או חלבון פלורסנט אשר יכול לשמש בזרימה cy, לנסות לבחור רק תאים חיוביים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma-Aldrich	A2220-5ML	binds all Flag tagged proteins
anti-Flag M2 antibody	Sigma-Aldrich	F3165	to detect 6His-Flag tagged expression of ub/ubl
Cell strainer 40 µm	Falcon	352350	to remove floating pellet from guanidine lysed cells
Flag peptide	Sigma-Aldrich	F3290	elute flag tagged proteins from anti-flag beads
Guanidine hydrochloride	Sigma-Aldrich	50933	chaotropic agent used to denature all proteins in cell lysate
Imidazole	Sigma-Aldrich	I5513	eluates 6His bond proteins from Ni-NTA beads
Lipofectamine 3000	ThermoFisher	L3000015	to transfect HEK-293T cells to produce lentiviruses
Lobind tubes	Sigma-Aldrich	Z666491	avoids absorption of precious material
Membrane Filter, 0.45 µm	Millipore	HAWP04700F1	to filter the lentiviral supernantant
Ni-NTA	Qiagen	30210	purification of the 6His tag