פרוטוקול זה מטרתו להקים אוביקוויב (וכדומה) ו אוביקוויב-אוהב (Ubls) הפרוטאמים ספציפיים כדי לזהות שינויים של סוג זה של שינויים לאחר העברה (לאחר ההעברה), הקשורים במצב ספציפי כגון טיפול או פנוטיפים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
יצירת פרופיל אוביקוויפין ואוביקוויב-שינויים עצמאיים וזיהוי של שינויים משמעותיים
במאמר זה
סיכום
תקציר
אוביקוויב (רוב) והשינויים התלויים שלאחר ההעברה של חלבונים לשחק תפקידים ביולוגיים בסיסיים בתוך התא על ידי שליטה ביציבות החלבון, פעילות, אינטראקציות, ולוקליזציה תאיים. הם מאפשרים לתאים להגיב לאותות ולהסתגל לשינויים בסביבתו. שינויים במנגנונים אלה עלולים לגרום למצבים פתולוגיים חמורים כגון מחלות ניווניות וסרטן. מטרת הטכניקה המתוארת כאן היא להקים פרופילים התלויים בפרופילי מדים והכל, במהירות ובדייקנות, מקווי תאים מתורבתים. השוואת פרופילים שונים המתקבלים מתנאים שונים מאפשרת זיהוי של שינויים ספציפיים, כגון אלה הנגרמת על ידי טיפול למשל. התמרה ויראלית מתווכת תא מבוצעת כדי ליצור קווי תאים יציבים המבטא שני תגים (6His ודגל) גירסה של משנה (אוביקוויב או ubl כגון SUMO1 או Nedd8). תגים אלה מאפשרים טיהור של אוביקוויב ולכן של חלבונים אוביקווילביים מן התאים. הדבר נעשה באמצעות תהליך טיהור דו-שלבים: הראשון מבוצע בתנאים מסוימים תוך שימוש בתגית השישית, והשני בתנאים מקוריים המשתמשים בתג ' דגל '. זה מוביל לבידוד מאוד ספציפי וטהור של חלבונים שהשתנו אשר מזוהים לאחר מכן למחצה כימות על ידי כרומטוגרפיה נוזלית ואחריו באמצעות ספקטרומטריה מאסיבית המסה (LC-MS/MS) טכנולוגיה. ניתוח לאינפורמטיקה קלה של נתוני MS באמצעות תוכנת Excel מאפשר הקמת פרופילי PTM על ידי ביטול אותות רקע. פרופילים אלה מושווים בין כל תנאי כדי לזהות שינויים ספציפיים אשר לאחר מכן ילמדו באופן ספציפי יותר, החל באימות שלהם על ידי טכניקות ביוכימיה סטנדרטית.
מבוא
השיטה המוצעת כאן מוקדש לחקר הגברת המתווכת על ידי בני משפחה אוביקוויב מתאי יונקים מתורבתים כדי לזהות שינויים פוטנציאליים הקשורים בתנאי ספציפי (טיפול, בידול, וכו '). פטין מייצג את השלב האחרון של רגולציה של החלבונים ' פונקציות1. אכן, לאחר שיוצרו על ידי מכונות הטרנסלטיות, רוב אם לא כל החלבונים עוברים סוגים שונים של פטין כי לווסת את פעילותם, אינטראקציות מולקולריות, ו תאיים מיקום1. בין שפע של לפטין הם אלה בתיווך על ידי משפחת אוביקוויב של חלבונים, אוביקוויב עצמו ואת כל אוביקוויב-אוהב, יש את הפוטנציאל לווסת את כל החלבונים תאיים או חלקי cytoplasmic2. בגלל שהם עצמם חלבונים, הם יכולים להיות מצויידים אחד לשני....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הדור של קווי תאים יציבים המבטא 6His-דגל-Ubl
הערה: שיתוף משותף של תאים HEK-293T עם pCCL-6HF-Ubl, pVSVG ו דלתא עוזר.
- יום 0: התאים 293T הזרע בצלחת 6-הבאר כדי להשיג 50-70% המפגש היום אחרי.
- יום 1: שיתוף 50-70% תאים confluent עם שילוב של 1 μg של pCCL-6HF-Ubl או pCCL-GFP, 1 μg של pVSVG ו-1 μg של דלתא-עוזר וקטורים, באמצעות מגיב העברה ופרוטוקול עבור ייצור וירוס. לאחר 6 שעות של העברה, לשנות את המדיום לאחד טרי המתאים לתאים להיות התמרה. הזרע את התאים להיות מותמרים ב 6 צלחת הבאר כדי לקבל 10-20% המפגש היום לאחר (היום של התחלת התמרה).
- יום 2:24 h לאחר החצייה, לשחזר את המדיום המכיל חלקיקים לסנן ומסננים באמצעות 0.45 יקרומטר מ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
התמרה של תאי היונקים התרבותיים ליצירת תאים מבוססי GFP ו-6HF.
כדי לייצר וירוסים שישמשו מאוחר יותר כדי לשנות את MiaPaCa-2 תאים, 70% confluent HEK-293T תאים הם שיתוף עם כמות שווה של שלושה וקטורים, pCCL-6HF-אוביקוויב או GFP/דלתא-עוזר/pvSvG. לאחר 24 שעות של ייצור, המדיום המכיל חלקיקי הנגיף הוא התאושש ומסונן. זה אפשרי בשלב זה כדי לשלוט על היעילות של התרגום על ידי בדיקת הזריחה הירוקה של GFP המבטא תאים 293T על מיקרוסקופ הפוך. זה צריך להיות ליד 100% של תאים. התאים של MiaPaCa-2 .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פיתחנו מתודולוגיה חזקה ואמינה כדי ליצור פרופילים של חלבונים ששונו על ידי בני המשפחה אוביקוויב הראשי. אכן, יש לנו הוחל בהצלחה פרוטוקול זה כדי ליצור פרופילים של לפטין על ידי אוביקוויב, וגם על ידי סומו ו Nedd8, כדי לזהות שינויים הקשורים לטיפול7, בתגובה על הביטוי או הסתרה של גן מסוים (נתונים לא מוצגים) ובתאים שרכשו פנוטיפים עמידים לתרופות כימותרפיות מגוונות.
ישנם רק כמה צעדים קריטיים במהלך ההליך מניפולטור צריך להיות זהיר עם. לאחר ליטוף של חרוזים (Ni-נ. ת. ע או נגד הדגל מצמי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
. למחברים אין מה לגלות
תודות
עבודה זו נתמכת על ידי La ligue contre סרטן ל hv ו-MS, ו-ARC (העמותה למזוג לה מחקר sur לסרטן) ל-PS, אינקה (מכון לאומי du סרטן) ו הסרטן אופולה paca כדי JI. מתקן הספקטרומטר המסה של מרסיי פרוטאומניקס (marseille-proteomique.univ-amu.fr) נתמך על ידי IBISA (תשתיות ביולוגיי סנטרה et Agronomie), Plateforme טכנוגיטק אקס-מרסיי, הCancéropôle PACA, ה-פרובנס-אלפ-קוט ד'אזור רמיון, מכון פקולי-קלמטס ומרכז דה רצ'רצ'ה אן Cancérologie דה מרסיי.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma-Aldrich | A2220-5ML | קושר את כל החלבונים המתויגים בדגל |
| נוגדן נגד Flag M2 | Sigma-Aldrich | F3165 | כדי לזהות ביטוי מתויג 6His-Flag של מסננת תאים ub/ubl |
| 40 ומיקרו; m | Falcon | 352350 | להסרת גלולה צפה מתאים ליז גואנידין |
| פפטיד דגל | סיגמא-אולדריץ' | F3290 | חלבונים מתויגים מחרוזים נגד דגל |
| גואנידין הידרוכלוריד | סיגמא-אולדריץ' | 50933 | חומר כאוטרופי המשמש לפירוק כל החלבונים בליזאט התא |
| אימידזול | סיגמא-אולדריץ' | I5513 | משחרר 6 חלבוני הקשר שלו מחרוזי Ni-NTA |
| Lipofectamine 3000 | ThermoFisher | L3000015 | להעביר תאי HEK-293T לייצור lentiviruses |
| צינורות Lobind | Sigma-Aldrich | Z666491 | נמנע מספיגה של חומר יקר |
| מסנן ממברנה, 0.45 ומיקרו; m | Millipore | HAWP04700F1 | לסנן את טיהור ה-lentiviral supernantant |
| Ni-NTA | Qiagen | 30210 | של תג 6His |
מקורות
- Prabakaran, S., Lippens, G., Steen, H., Gunawardena, J. Post-translational modification: Nature's escape from genetic imprisonment and the basis for dynamic information encoding. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. , (2012).
- Hochstrasser, M.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
