Summary
La matriz extracelular descelularizada (dECM) puede proporcionar señales microambientales adecuadas para recapitular las funciones inherentes de los tejidos diana en una construcción diseñada. Este artículo aclara los protocolos para la descelularización del tejido pancreático, la evaluación del bioink dECM derivado del tejido pancreático y la generación de construcciones de tejido pancreático 3D utilizando una técnica de bioimpresión.
Abstract
El trasplante de islotes pancreáticos es un tratamiento prometedor para los pacientes que sufren de diabetes tipo 1 acompañado de hipoglucemia y complicaciones secundarias. Sin embargo, el trasplante de islotes todavía tiene varias limitaciones, como la baja viabilidad de los islotes trasplantados debido a la falta de injerto de islotes y entornos hostiles. Además, las células productoras de insulina diferenciadas de las células madre pluripotentes humanas tienen una capacidad limitada para secretar suficientes hormonas que pueden regular el nivel de glucosa en sangre; por lo tanto, se requiere encarecidamente mejorar la maduración mediante el cultivo de células con señales microambientales adecuadas. En este artículo, esclarecemos los protocolos para preparar un biocontenido de matriz extracelular descelularizada derivada del tejido pancreático (pdECM) para proporcionar un microambiente beneficioso que puede aumentar la sensibilidad a la glucosa de los islotes pancreáticos, seguido de describir los procesos para generar construcciones de tejido pancreático 3D utilizando una técnica de bioimpresión basada en microextrusión.
Introduction
Recientemente, el trasplante de islotes pancreáticos se ha considerado un tratamiento prometedor para pacientes con diabetes tipo 1. La relativa seguridad y mínima invasividad del procedimiento son grandes ventajas de este tratamiento1. Sin embargo, tiene varias limitaciones como la baja tasa de éxito de islotes de aislación y los efectos secundarios de los fármacos inmunosupresores. Además, el número de islotes injertados disminuye constantemente después del trasplante debido al ambiente hostil2. Se han aplicado varios materiales biocompatibles como alginato, colágeno, ácido poli(láctico-coglicólico) (PLGA) o polietilenglicol (PEG) al trasplante de islotes pancreáticos para superar estas dificultades.
La tecnología de impresión de células 3D está surgiendo en la ingeniería de tejidos debido a su gran potencial y alto rendimiento. No hace falta decir que los bioinks son conocidos como componentes importantes para proporcionar un microambiente adecuado y permitir la mejora de los procesos celulares en construcciones de tejido impreso. Un número sustancial de hidrogeles adelgazamiento de cizallamiento como la fibrina, el alginato y el colágeno se utilizan ampliamente como biotintas. Sin embargo, estos materiales muestran una falta de complejidad estructural, química, biológica y mecánica en comparación con la matriz extracelular (ECM) en el tejido nativo3. Las señales microambientales, como las interacciones entre los islotes y la ECM, son señales importantes para mejorar la función de los islotes. ECM descelularizado (dECM) puede recrear la composición específica del tejido de varios componentes de ECM, incluyendo colágeno, glicosaminoglicanos (GAGs), y glicoproteínas. Por ejemplo, los islotes primarios que conservan sus ECM periféricos (por ejemplo, colágeno, laminina y fibronectina de tipo I, III, IV, V y VI) presentan una baja apoptosis y una mejor sensibilidad a la insulina, lo que indica que las interacciones entre las células y matrices específicas del tejido son importantes para mejorar su capacidad de funcionar de manera similar al tejido original4.
En este artículo, aclaramos protocolos para preparar biotinta de matriz extracelular descelularizada derivada del tejido pancreático (pdECM) para proporcionar señales microambientales beneficiosas para aumentar la actividad y las funciones de los islotes pancreáticos, seguidos de los procesos para generar construcciones de tejido pancreático 3D utilizando una técnica de bioimpresión basada en microextrusión(Figura 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Se recogieron tejidos pancreáticos porcinos de un matadero local. Los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Asan Medical Center, Seúl, Corea.
1. Descelularización de tejidos
- Preparar las soluciones para la descelularización.
NOTA: 1 solución salina con fosfato (PBS) utilizada en todas las preparaciones de la solución se diluye añadiendo agua destilada a 10x PBS.- Para la solución 1% Triton-X 100, disolver 100 ml de solución 100% Triton-X 100 en 900 ml de 1x PBS utilizando una barra de agitación magnética con la agitación a 150 rpm para 6 h. Hacer 400 mL de solución 1% Tritón-X 100 con 40 ml de 10% Triton-X 100 solución y 360 mL de solución PBS preparado justo antes de su uso.
NOTA: La solución 10% Triton-X 100 se puede almacenar a temperatura ambiente hasta que sea necesario. - Para la solución de ácido peracético al 0,1%, diluir 8,5 ml de ácido peracético al 4,7% en 22,8 ml de etanol al 70% con 368,7 ml de agua destilada justo antes de su uso.
- Para la solución 1% Triton-X 100, disolver 100 ml de solución 100% Triton-X 100 en 900 ml de 1x PBS utilizando una barra de agitación magnética con la agitación a 150 rpm para 6 h. Hacer 400 mL de solución 1% Tritón-X 100 con 40 ml de 10% Triton-X 100 solución y 360 mL de solución PBS preparado justo antes de su uso.
- Retire los tejidos periféricos del páncreas y corte el tejido antes de la descelularización.
- Lave el páncreas porcino resecado con agua corriente del grifo y retire los tejidos periféricos con tijeras esterilizadas.
- Transfiera el páncreas en una bolsa de plástico con fórceps y congele a -80 oC durante 1 h para ayudar a cortar el páncreas de manera efectiva para el siguiente paso.
- Corta el páncreas congelado en trozos de 1 mm de espesor usando un rallador.
- Transfiera 50 g de tejido cortado en un recipiente de plástico de 500 ml.
NOTA: Aquí se recomienda un recipiente de plástico con tapa para proteger los tejidos de la contaminación y evitar la evaporación de la solución.
- Tratamiento con reactivos.
NOTA: Todo el proceso de descelularización debe llevarse a cabo a 4oC en un agitador orbital digital a 150 rpm. En todos los pasos de descelularización, se requiere desprendimiento físico con fórceps para evitar que las rodajas de páncreas se peguen. Lavar el recipiente con agua destilada es necesario para eliminar completamente los reactivos residuales en el recipiente.- Antes de cualquier tratamiento con reactivos, lave 50 g de páncreas en rodajas con 300 ml de agua destilada con una coctelera.
- Revuelva el tejido continuamente a 150 rpm hasta que el agua turbia desaparezca (después de aproximadamente 12 h). Sustituya el agua destilada cada 2 h.
NOTA: Se recomienda cambiar el agua destilada cada hora para la eficiencia de eliminar el agua turbia más rápidamente. - Deseche el agua y trate los 50 g de tejidos con 400 ml de 1% de Triton-X 100 en 1solución PBS durante 84 h. Refresque la solución cada 12 h.
NOTA: En este punto, la cantidad de tejido disminuirá porque los componentes celulares comienzan a ser eliminados. - Tratar con 400 ml de isopropanol (IPA) durante 2 h para eliminar la grasa restante del páncreas.
NOTA: Es normal que el tejido se vuelva resistente debido a la eliminación de grasa en este proceso. - Después de 2 h, retire el IPA y lave el tejido con 400 ml de 1pbS durante 24 h. Actualice el 1o PBS cada 12 h.
- Para esterilizar el tejido descelularizado, deseche la solución previa y trate con 400 ml de ácido peracético al 0,1% en etanol al 4% durante 2 h.
- Para eliminar el detergente residual, lave el tejido con 400 ml de 1pbS durante 6 h. Refresque la solución cada 2 h.
- Recoger los tejidos descelularizados en un tubo cónico de 50 ml con fórceps.
- Congele la muestra a -80 oC durante 1 h. Cubra el tubo cónico con una toallita sin pelusas en lugar de la tapa y fije con una banda de goma para una liofilización eficiente.
- Liofilizar el tejido descelularizado a -50 oC durante 4 d.
NOTA: Para el paso 1.3, 1 g de tejido no descelularizado también debe congelarse en las mismas condiciones.
2. Evaluación de tejidos descelularizados
NOTA: Para evaluar la cantidad residual de ADND, los glicosaminoglicanos (GAG) y el colágeno en el tejido descelularizado en comparación con el tejido nativo, se requieren al menos 1 g de cada uno de los tejidos no descelularizados (tejido nativo) y descelularizados para un lote de evaluación. La cantidad de ADND, GAGs y colágeno se puede calcular en función del peso seco del tejido.
- Preparar soluciones para ensayos bioquímicos.
- Preparar la solución de papaína para la digestión de la muestra.
NOTA: La cantidad de búfer a realizar se puede ajustar de acuerdo con el número de muestras.- Disolver 119 mg de 0,1 M de fosfato sódico (monobásico), 18,6 mg de 0,5 mM de Na2-EDTA y 8,8 mg de 5 mM de cisteína-HCl en 10 ml de agua autoclaveda.
- Ajuste el pH de la solución a 6,5 añadiendo una solución NaOH de 10 M.
- Añadir 125 ml de solución de calina de 10 mg/ml a la solución y vórtice anteriores, permitiendo que cada elemento se mezcle uniformemente.
- Preparar soluciones para el ensayo de dimetil-metileno azul (DMMB).
- Para hacer el tinte DMMB, disolver 8 mg de 1,9-dimetil-metileno de cloruro de zinc azul de cloruro de zinc doble sal, 1,52 g de glicina, y 1.185 g de NaCl en 500 mL de agua autoclaved. Ajuste el pH a 3 añadiendo una solución de HCl de 0,5 M mientras mide el cambio de pH utilizando un medidor de pH de sobremesa. A continuación, filtre esto a través de un filtro de vacío de 500 ml.
- Hacer 15 l de 10 mg/ml de sulfato de condroitina Una solución estándar.
- Preparar soluciones para el ensayo de hidroxiprolina.
- Para la solución de trabajo con cloramina, disolver 2,4 g de acetato de sodio, 1 g de ácido cítrico y 0,68 g de hidróxido de sodio en 24 ml de agua destilada y añadir 240 ml de ácido acético glacial, 10 ml de tolueno y 6 ml de IPA.
NOTA: Disuelva todos los polvos en solución con un mezclador de vórtice. La solución de trabajo con cloramina se puede almacenar a 4 oC durante un máximo de tres meses. - Para la solución de cloramina T, disolver 0,35 g de cloramina T en 20 ml de solución de trabajo de cloramina y añadir 2,5 ml de IPA. Vórtice para mezclar todos los componentes.
NOTA: Prepárese inmediatamente antes de usar. - Para la solución P-DAB, poner 3,75 g de P-DAB en 6,5 ml de ácido perclórico y 15 ml de IPA; envuélvelo en papel de aluminio.
NOTA: Prepárese inmediatamente antes de usar.
- Para la solución de trabajo con cloramina, disolver 2,4 g de acetato de sodio, 1 g de ácido cítrico y 0,68 g de hidróxido de sodio en 24 ml de agua destilada y añadir 240 ml de ácido acético glacial, 10 ml de tolueno y 6 ml de IPA.
- Preparar la solución de papaína para la digestión de la muestra.
- Añadir 1 ml de solución de papaína a 10 mg de tejido liofilizado en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y vórtice el tubo para digerir mejor la muestra.
- Colocar el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml en un bastidor de goma y digerir las muestras en un vaso de precipitados de 500 ml que contenga 300 ml de agua a 60 oC durante 16 h.
- Centrifugar a 9.500 x g durante 20 minutos, recoger el sobrenadante y transferirlo a un tubo nuevo.
- Cuantificar el ADN residual y las proteínas principales en el tejido descelularizado.
- Cargue 1 l de muestra digerida en el espectrómetro y mida la cantidad de ADN DS de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
NOTA: El experimentador debe atar su cabello hacia atrás y usar una máscara para evitar contaminar la muestra.
- Cargue 1 l de muestra digerida en el espectrómetro y mida la cantidad de ADN DS de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Realice un ensayo DMMB para cuantificar la cantidad de GAG que permanece en el tejido descelularizado.
- Mezclar 1 l de sulfato de condroitina S solución y 499 éL de 1x PBS para hacer estándares. Diluir el sulfato de condroitina Una solución con agua destilada a concentraciones de 0, 4, 8, 12, 16 y 20 g/ml.
- Cargue triplicados de 50 ml de cada concentración de las muestras estándar y digeridas en una placa de 96 pocillos.
- Añadir 200 l de tinte DMMB a cada pocal utilizando una pipeta multicanal.
- Lea inmediatamente la absorbancia a 525 nm en un lector de microplacas.
- Realizar un ensayo de hidroxiprolina para cuantificar la cantidad de colágeno.
- Para llevar a cabo un ensayo de hidroxiprolina, incubar 250 ml de muestra digerida con volúmenes iguales de HCl a 120 oC durante 16 h.
- Secar los residuos a temperatura ambiente durante 3 h para enfriar las muestras y luego volver a disolver las muestras en 1 ml de 1x PBS.
- Centrífuga a 2.400 x g durante 10 min a 4oC.
- Preparar de serie una solución de hidroxiprolina de 100 g/ml.
- Diluir la solución de hidroxiprolina con agua destilada a una concentración de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 30 g/ml para una solución estándar.
- Cargue triplicados de 50 ml de muestras y solución estándar en una placa de 96 pocillos.
- Añadir 50 l de solución de cloramina T y luego incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente.
- Añadir 50 sl de solución p-DAB e incubar durante 30 min a 60 oC.
NOTA: Aliquot en una habitación oscura. Después de la adición, envuelva la placa con papel de aluminio. - Incubar a temperatura ambiente durante 30 min.
- Después de enfriar, mida la absorbancia a 540 nm en un lector de microplacas.
3. Preparación de Bioink
NOTA: El polvo de pdECM se puede almacenar de forma estable a -80 oC durante al menos un año. Antes del ajuste del pH, la solución de pdECM digerido se puede almacenar a -20 oC durante un mes. Antes de su uso, descongele la muestra de la solución de pdECM congelada a 4 oC durante la noche. La solución pdECM ajustada al pH se puede almacenar a 4 oC durante un máximo de una semana. La solución de pdECM digerido se puede almacenar a 4 oC durante al menos unos días, pero no debe exceder 1 semana.
- Digerir el pdECM liofilizado con pepsina.
- Para una digestión eficaz de biotinta, pulverizar el pdECM liofilizado con nitrógeno líquido utilizando un mortero y un pestillo.
- Recoger 200 mg del polvo pdECM en el tubo cónico de 50 ml y añadir 20 mg de la pepsina y 8,4 ml del ácido acético de 0,5 M (la concentración final es de 2 p/v%).
- Coloque la barra de agitación magnética en el tubo cónico de 50 ml y revuelva a 300 rpm durante 96 h.
- Ajuste el pH de la solución pdECM digerida.
NOTA: Con el fin de evitar la gelación antes del ajuste del pH, este proceso debe llevarse a cabo sobre hielo.- Filtrar las partículas no digeridas en la solución pdECM utilizando un colador de células de 40 m utilizando una pipeta de desplazamiento positivo en hielo para obtener la digestión óptima de las piezas.
- Agregue 1 mL del PBS 10x y el vórtice antes de usar NaOH.
- Ajuste el pH a 7 con 10 M NaOH comprobando el pH con tiras indicadoras de pH.
NOTA: Vortex cada vez que se añade NaOH para que el bioink se mezcle a fondo con los otros reactivos.
4. Análisis reológico
- Configuración experimental
- Preparar el 1,5% (p/v) del bioink pdECM para evaluar las propiedades reológicas.
- Establezca una geometría de placa de cono de 20 mm (diámetro de cono de 20 mm con un ángulo de 2o) en modo de velocidad controlada de un reómetro.
- Cree secuencias experimentales en el software instalado (TRIOS) para medir la viscosidad, la cinética de la gelación y el módulo dinámico del biotinta pdECM.
- Viscosidad: Coloque el biotinta pdECM en la placa. Mida la viscosidad compleja (Pa-s) de la biotinta pdECM bajo una tasa de cizallamiento creciente de 1 a 1.000 s-1 a una temperatura constante de 15 oC.
- Cinética de gelión: Coloque el bioink pdECM en la placa. Calcule el módulo complejo (G*) midiendo el módulo de almacenamiento y pérdida de biotinta pdECM a 4-37 oC con una tasa de aumento incremental de 5 oC/min (modo de barrido de tiempo).
- Módulo dinámico: Coloque el biotinta pdECM en la placa a 37 oC durante 60 minutos antes de la medición. Mida el módulo de almacenamiento dependiente de la frecuencia (G') y el módulo de pérdida (G'') del biotinta pdECM en el rango de 0,1-100 rad/s a una tensión del 2%.
5. Impresión de células 3D de construcciones de tejido pancreático usando islotes
- Preparación de islotes aislados
- Aísle los islotes primarios de una rata de acuerdo con los protocolos descritos en un trabajo anterior5.
- Para separar los desechos y las células muertas del islo aislado, pase la suspensión celular a través de un colador de células de 70 m. Los islotes con un diámetro inferior a 70 m se consideran muertos o anormales.
- Suspenda los islotes aislados en el medio RPMI-1640 y colóquelos en la placa de petri. Retire los islotes de más de 300 m de diámetro utilizando una pipeta de volumen P200 bajo el microscopio (lente objetivo 4x) en el gabinete de bioseguridad.
- Encapsulación de isletenen biotinta pdECM
- Prepare el bioink pdECM ajustado al pH y el isloaislado aislado.
NOTA: Para evitar la gelación antes del ajuste del pH, este proceso debe realizarse sobre hielo. - Mezcle suavemente el biotinta pdECM y el medio suspendido con islotes (relación 3:1) utilizando una pipeta de desplazamiento positivo hasta que se mezclen uniformemente.
NOTA: La concentración final del biotinta pdECM es del 1,5% y la densidad celular en el biotinta pdECM es de 3.000 IEQ/ml.
- Prepare el bioink pdECM ajustado al pH y el isloaislado aislado.
- Impresión de células 3D de construcciones de tejido pancreático
- Prepare una jeringa esterilizada y una boquilla de 22 G.
NOTA: Este medidor fue seleccionado para la impresión de islotes con un diámetro de 100-250 m. - Cargue el bioink pdECM cargado de islos en la jeringa.
- Imprima el bioink con la condición de impresión optimizada (velocidad de avance: 150 mm/min; presión neumática: 15 kPa) a 18 oC en forma de celosía.
- Para recruzar el bioink, coloque la construcción impresa en la incubadora durante 30 min.
- Sumerja la construcción impresa en el medio de cultivo de islos que es un medio RPMI-1640 complementado con suero bovino fetal al 10% (FBS), penicilina de 100 U/ml y estreptomicina de 100 U/ml.
- Prepare una jeringa esterilizada y una boquilla de 22 G.
6. Impresión celular 3D de la construcción pancreática con estructura estampada
- Preparación de dos tipos de biotinta
- Para validar la versatilidad de impresión utilizando múltiples biotintas, prepare dos conjuntos de biotintas pdECM y tenín los dos agregando una solución de 1,4% Trypan Blue y Rose Bengal en cada biotinta pdECM a una proporción de 1:20, respectivamente.
NOTA: Para evitar la gelación antes del ajuste del pH, este proceso debe llevarse a cabo sobre hielo. - Mezcle suavemente el biotinta pdECM y el medio suspendido con islotes (relación 3:1) utilizando una pipeta de desplazamiento positivo hasta que se mezclen uniformemente.
NOTA: La concentración final del biotinta pdECM es del 1,5% y la densidad celular en el biotinta pdECM es de 3.000 IEQ/ml.
- Para validar la versatilidad de impresión utilizando múltiples biotintas, prepare dos conjuntos de biotintas pdECM y tenín los dos agregando una solución de 1,4% Trypan Blue y Rose Bengal en cada biotinta pdECM a una proporción de 1:20, respectivamente.
- Impresión de células 3D de construcciones de tejido pancreático multimaterial
- Prepare jeringas esterilizadas y una boquilla de 25 G.
- Cargue cada biotinta (azul y rojo) en dos jeringas diferentes, respectivamente.
- Imprima el bioink con una condición de impresión optimizada (velocidad de avance: 150 mm/min; presión neumática: 15 kPa) a 18oC en forma de celosía con líneas alternas de azul y rojo.
- Para recruzar el bioink, coloque la construcción impresa en la incubadora durante 30 min.
- Sumerja la construcción impresa en medios de cultivo de islet que son medios RPMI-1640 complementados con suero bovino fetal 10% (FBS), penicilina de 100 U/ml y estreptomicina de 100 U/ml.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Descelularización de los tejidos pancreáticos
Desarrollamos el proceso de preparación de biotinta pdECM para proporcionar microambientes específicos del tejido pancreático para mejorar la funcionalidad de los islotes en una construcción de tejido bioimpreso 3D(Figura 2A). Después del proceso de descelularización, se eliminó el 97,3% del ADN DSDNA y los componentes representativos de ECM, como el colágeno y los GAG, se mantuvieron en 1278,1% y 96,9% en comparación con el tejido pancreático nativo, respectivamente(Figura 2B).
Preparación de Bioink
Para aplicar el pdECM en el proceso de impresión, el polvo pdECM fue solubilizado en ácido débil con pepsina y neutralizado utilizando una solución NaOH de 10 M. La solución de pdECM digerido podría diluirse a través de la mezcla con un medio de cultivo celular o 1x PBS. En este estudio, preparamos biotinta pdECM a una concentración final del 1,5% para su estudio posterior. El biotinta pdECM mantuvo una fase de solución cuando se colocó bajo temperatura ambiente y se convirtió instantáneamente en una fase de gel después de la incubación a 37 oC durante 30 min. Para investigar el efecto del bioink pdECM en los islotes, se encapsularon islotes aislados en las biotintas pdECM, alginato y colágeno a una concentración del 1,5%. El resultado de la prueba de secreción de insulina estimulada por glucosa mostró que los islotes en el biocontenido pdECM representaban el índice más alto (aproximadamente 3.174) entre los grupos experimentales, lo que indica una mayor funcionalidad sobre los hidrogeles ampliamente aplicados para la encapsulación de islotes5.
Análisis reológico
La viscosidad es una de las características críticas al considerar un biomaterial imprimible. Medimos la viscosidad del biotinta pdECM a una frecuencia que oscila entre 1 y 1.000 Hz a 15 oC para la impresión de varias biotintas dECM6,7,8. El bioink pdECM mostró un comportamiento de adelgazamiento de cizallamiento y el valor era de aproximadamente 10 Pas a la velocidad de cizallamiento de 1/s, lo que indica que la biotinta pdECM tenía características reológicas apropiadas para la extrusión a través de una boquilla(Figura 3A). La cinética de gelificación a una temperatura que oscilaba entre 4 y 37oC indicaba el comportamiento de gelación del biotinta pdECM a temperaturas fisiológicamente relevantes. El módulo complejo comenzó a aumentar cuando la temperatura alcanzó los 15 oC, y aumentó rápidamente cuando la temperatura se mantuvo a 37 oC, lo que indica la transición sol-gel del bioink pdECM(Figura 3B). El G' y G" dinámicos del bioink pdECM se investigaron a temperaturas fisiológicamente relevantes para garantizar su estabilidad después del proceso de impresión, lo que dio lugar a tener un módulo estable bajo la condición de barrido de frecuencia(Figura 3C).
Impresión de celdas 3D
Las construcciones de tejido pancreático cargado de células 3D se fabricaron mediante el uso de un proceso de impresión basado en microextrusión. Para construir una construcción que contenga al menos 3.000 equivalentes de isla (IEQ), que corresponde al volumen tisular de un isla perfectamente esférica con un diámetro de 150 m9,diseñamos la construcción con una dimensión de 10 mm x 10 mm x 3 mm(Figura 4A). Los parámetros y condiciones del proceso para la impresión de islotes pancreáticos fueron seleccionados para encapsular islotes, que son grandes racimos celulares en tamaños de 100-250 m de diámetro(Figura 4B). Utilizando un sistema de impresión multicabezal, varios tipos de construcciones 3D, como la forma de la celosía que tiene líneas alternativas de azul y rojo, se fabricaron utilizando el pdECM desarrollado(Figura 4C),lo que indica la versatilidad del pdECM con el propósito de la bioimpresión 3D para armonizar dos o más tipos de células vivas en una disposición similar a un tejido.
Figura 1: Esquema del desarrollo de tejido pancreático decelularizado, evaluación de biotinta pdECM y fabricación de construcciones de tejido pancreático 3D. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imágenes representativas del proceso de descelularización y caracterización bioquímica de pdECM. (A) Visión general de la descelularización del tejido pancreático porcino. (B) Resultados de ensayos bioquímicos de tejido nativo y pdECM. Las barras de error muestran la desviación estándar. Copyright (2019) La Royal Society of Chemistry5. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Análisis reológico de biotinta pdECM. (A) Viscosidad de pdECM y biotintas de colágeno que mostraban un comportamiento de adelgazamiento de cizallamiento. (B) Cinética de gelificación de pdECM y biotintas de colágeno durante el cambio de temperatura. (C) El módulo complejo de pdECM reticulado y biotintas de colágeno. Copyright (2019) de The Royal Society of Chemistry5. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Impresión de células 3D de biotinta pdECM cargado de células para construcciones de tejido pancreático 3D. (A) Las dimensiones de las construcciones de tejido pancreático 3D. (B) Construcciones de tejido pancreático 3D a base de islotes y(C)cargados de islotes pancreáticos. Copyright (2019) de The Royal Society of Chemistry5. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Este protocolo describió el desarrollo de biotintas pdECM y la fabricación de construcciones de tejido pancreático 3D mediante el uso de técnicas de impresión de células 3D. Para recapitular el microambiente del tejido diana en la construcción de tejido diseñado 3D, la elección de biotinta es fundamental. En un estudio anterior, validamos que las biotintas dECM específicas del tejido son beneficiosas para promover la diferenciación de células madre y la proliferación10. En comparación con los polímeros sintéticos, dECM puede servir como un entorno favorable a las células debido a la composición específica del tejido y la arquitectura11. Por lo tanto, el proceso de descelularización debe ser considerado seriamente para la alta retención de los componentes principales en el dECM.
La selección de diferentes detergentes para la descelularización del tejido pancreático varía el componente residual de ECM12. En el proceso de descelularización, notamos que el uso de sulfato de dodecilo sódico (SDS) puede afectar a la pérdida de las proteínas ECM13. Por lo tanto, modificamos nuestro protocolo anterior eliminando el paso para el tratamiento de la solución SDS, que es un tensioactivo iónico utilizado en muchos procesos de limpieza y descelularización con características relativamente duras en comparación con otros como Trion-X 100, o 3-[(3-cholamidopropyl) dimetil-lammonio]-1-propanesulfonato (CHAPS). En este protocolo, utilizamos 1% de solución Triton-X 100 para 84 h en lugar de solución SDS, que fue capaz de eliminar los componentes celulares de manera efectiva mientras preservaba los GAG y las proteínas colages. Además, observamos que la eliminación de lípidos residuales mediante el tratamiento con El IAP es también un proceso muy crucial para inducir la reticulación del bioink pdECM y puede entenderse en el mismo contexto que un artículo4publicado anteriormente. También se aplicó tratamiento con solución de ácido peracético para la esterilización de tejido descelularizado. Además, la eliminación de los detergentes y productos químicos restantes en el tejido descelularizado es un paso crucial para prevenir la respuesta inflamatoria del huésped. Sin embargo, no discutimos esta cuestión en este protocolo. Los protocolos que incluyen un proceso de desinfección al final de la descelularización mejorarán la biocompatibilidad del material descelularizado. Además, deben considerarse normas para los criterios de evaluación para garantizar que los detergentes y los productos químicos se eliminen por completo.
La digestión de biotinta pdECM con pepsina se realizó para lograr la mezcla homogénea de polvo pdECM en la solución ácida por escisión de la región de telopéptidos en la proteína colágeno. En el proceso de ajuste del pH, mantener el bioink pdECM sobre hielo es fundamental para la preservación de la gelación. Después, podemos producir biotintas pregel pdECM filartables físicamente que pueden entrar en un estado de gel incubando a 37 oC, que es una de las principales ventajas de los bioinks a base de dECM. La selección de la concentración adecuada del biotinta pdECM también es importante10. Un bioink ideal debe proteger las células de daños externos que se producen durante el proceso de impresión, como la presión neumática y el cambio de temperatura. Se sabe que la fuerza cortante aplicada puede causar daño a las células y reducir la viabilidad celular en las construcciones impresas10. También, mejorar las concentraciones de biotinta podría inducir la muerte celular5. Por el contrario, las bajas concentraciones de biotinta inducen una baja viscosidad, lo que significa una baja imprimibilidad y fidelidad de forma durante la impresión. Es necesario comprobar la viscosidad del biotinta y optimizar su concentración.
Actualmente, los investigadores están estudiando activamente el desarrollo de varios tipos de biotintas derivadas de tejido para la impresión de construcciones de tejido 3D14,15,16. Los resultados de estos estudios indican que el bioink podría proporcionar microambientes específicos del tejido para las células. Estas condiciones únicas pueden promover la diferenciación o maduración de las células madre y la proliferación de células. Además, la utilización del sistema de impresión de celdas 3D equipado con múltiples cabezales permite imprimir múltiples tipos de biotintas con alta precisión simultáneamente. Usando esta técnica, se puede producir una estructura con un patrón específico, mostrando así versatilidad de diseño. Además, es factible encapsular diferentes tipos de células en cada biotinta para imitar la disposición celular nativa17. Estas estructuras de patrones se pueden utilizar en la inducción de la vascularización o efecto de cocultivo mejorando las interacciones de célula a célula, que pueden ser factores clave en la supervivencia a largo plazo de células específicas18,19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ninguno.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por el programa bio y tecnología médica de la Fundación Nacional de Investigación (NRF) financiado por el gobierno coreano (MSIT) (2017M3A9C6032067) y "ICT Consilience Creative Program" (IITP-2019-2011-1-00783) supervisado por el IITP (Instituto de Planificación y Evaluación de Tecnologías de la Información y las Comunicaciones).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biological Safety Cabinets | CRYSTE | PURICUBE 1200 | |
| Deep Freezer | Thermo Scientific Forma | 957 | |
| Digital orbital shaker | DAIHAN Scientific | DH.WSO04010 | |
| Dry oven | DAIHAN Scientific | WON-155 | |
| Freeze dryer | LABCONCO | 7670540 | |
| Fridge | SANSUNG | CRFD-1141 | |
| Grater | ABM | 1415605793 | |
| Inverted Microscopes | Leica | DMi1 | |
| Microcentrifuge | CRYSTE | PURISPIN 17R | |
| Microplate reader | Thermo Fisher Scientific | Multiskan GO | |
| Mini centrifuge | DAIHAN Scientific | CF-5 | |
| Multi-Hotplate Stirrers | DAIHAN Scientific | SMHS-6 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | ND-LITE-PR | |
| pH benchtop meter | Thermo Fisher Scientific | STARA2110 | |
| Rheometer | TA Instrument | Discovery HR-2 | |
| Vortex Mixer | DAIHAN Scientific | VM-10 | |
| Cirurgical Instruments | |||
| Operating Scissors | Hirose | HC.13-122 | |
| Forcep | Korea Ace Scientific | HC.203-30 | |
| Materials | |||
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
| 10 ml glass vial | Scilab | SL.VI1243 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 5 L beaker | Dong Sung Science | SDS 2400 | |
| 50 mL cornical tube | Falcon | 352070 | |
| 500 mL beaker | Korea Ace Scientific | KA.23-08 | |
| 500 mL bottle-top vacuum filter | Corning | 431118 | |
| 500 mL plastic container | LOCK&LOCK | INL301 | |
| 96well plate | Falcon | 353072 | |
| Aluminum foil | DAEKYO | ||
| Kimwipe | Kimtech | ||
| Magnetic bar | Korea Ace Scientific | BA.37110-0003 | |
| Mortar and pestle | DAIHAN Scientific | SC.MG100 | |
| Multi-channel pipettor | Eppendorf | 4982000314 | |
| Petri Dish | SPL | 10100 | |
| pH indicator strips | Sigma-Aldrich | 1095350001 | |
| Sieve filter mesh | DAIHAN Scientific | ||
| Decellularization | |||
| 10x pbs | Hyclone | SH30258.01 | |
| 4.7% Peracetic acid | Omegafarm | ||
| 70% ethanol | SAMCHUN CHEMICALS | E0220 SAM | |
| Distilled water | |||
| IPA | SAMCHUN CHEMICALS | samchun I0348 | |
| Triton-X 100 | Biosesang | T1020 | |
| Biochemical assay | |||
| 1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt | Sigma-Aldrich | 341088 | |
| 10 N NaOH | Biosesang | S2018 | |
| Chloramine T | Sigma-Aldrich | 857319 | |
| Chondroitin sulfate A | Sigma-Aldrich | C4384 | |
| Citric acid | Supelco | 46933 | |
| Cysteine-HCl | Sigma-Aldrich | C1276 | |
| Glacial acetic acid | Merok | 100063 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 410225 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Na2-EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| NaCl | SAMCHUN CHEMICALS | S2097 | |
| Papain | Sigma-Aldrich | p4762 | |
| P-DAB | Sigma-Aldrich | D2004 | |
| Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 311421 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S5636 | |
| Sodium hydroxide | Supelco | SX0607N | |
| Sodium phosphate(monobasic) | Sigma-Aldrich | RDD007 | |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | |
| Bioink | |||
| Charicterized FBS | Hyclone | SH30084.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pepsin | Sigma-Aldrich | P7215 | |
| Rose bengal | Sigma-Aldrich | 198250 | |
| RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 |
References
- Shapiro, A. J., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. Clinical pancreatic islet transplantation. Nature Reviews Endocrinology. 13 (5), 268 (2017).
- Venturini, M., et al. Technique, complications, and therapeutic efficacy of percutaneous transplantation of human pancreatic islet cells in type 1 diabetes: the role of US. Radiology. 234 (2), 617-624 (2005).
- Xie, D., et al. Cytoprotection of PEG-modified adult porcine pancreatic islets for improved xenotransplantation. Biomaterials. 26 (4), 403-412 (2005).
- Sackett, S. D., et al. Extracellular matrix scaffold and hydrogel derived from decellularized and delipidized human pancreas. Scientific Reports. 8 (1), 10452 (2018).
- Kim, J., et al. 3D cell printing of islet-laden pancreatic tissue-derived extracellular matrix bioink constructs for enhancing pancreatic functions. Journal of Materials Chemistry B. 7 (10), 1773-1781 (2019).
- Yi, H. G., et al. A bioprinted human-glioblastoma-on-a-chip for the identification of patient-specific responses to chemoradiotherapy. Nature Biomedical Engineering. 1, (2019).
- Das, S., et al. Decellularized extracellular matrix bioinks and the external stimuli to enhance cardiac tissue development in vitro. Acta Biomaterialia. , (2019).
- Kim, H., et al. Shear-induced alignment of collagen fibrils using 3D cell printing for corneal stroma tissue engineering. Biofabrication. 11 (3), 035017 (2019).
- Huang, H. H., Ramachandran, K., Stehno-Bittel, L. A replacement for islet equivalents with improved reliability and validity. Acta Diabetologica. 50 (5), 687-696 (2013).
- Pati, F., et al. Printing three-dimensional tissue analogues with decellularized extracellular matrix bioink. Nature Communications. 5, 3935 (2014).
- Hussey, G. S., Dziki, J. L., Badylak, S. F. Extracellular matrix-based materials for regenerative medicine. Nature Reviews Materials. 1, (2018).
- Kim, B. S., Kim, H., Gao, G., Jang, J., Cho, D. W. Decellularized extracellular matrix: a step towards the next generation source for bioink manufacturing. Biofabrication. 9 (3), 034104 (2017).
- Gaetani, R., et al. Evaluation of different decellularization protocols on the generation of pancreas-derived hydrogels. Tissue Engineering Part C: Methods. 24 (12), 697-708 (2018).
- Gao, G., et al. Tissue engineered bio-blood-vessels constructed using a tissue-specific bioink and 3D coaxial cell printing technique: a novel therapy for ischemic disease. Advanced Functional Materials. 27 (33), 1700798 (2017).
- La, W. G., et al. Systemically replicated organic and inorganic bony microenvironment for new bone formation generated by a 3D printing technology. RSC Advances. 6 (14), 11546-11553 (2016).
- Lee, H., et al. Development of liver decellularized extracellular matrix bioink for three-dimensional cell printing-based liver tissue engineering. Biomacromolecules. 18 (4), 1229-1237 (2017).
- Choudhury, D., Tun, H. W., Wang, T., Naing, M. W. Organ-derived decellularized extracellular matrix: a game changer for bioink manufacturing? Trends in Biotechnology. 36 (8), 787-805 (2018).
- Kurpios, N. A., et al. The direction of gut looping is established by changes in the extracellular matrix and in cell: cell adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (25), 8499-8506 (2008).
- Sakai, T., Larsen, M., Yamada, K. M. Fibronectin requirement in branching morphogenesis. Nature. 423 (6942), 876 (2003).
