Captura de la respuesta de la lesión cardíaca de las poblaciones celulares objetivo a través de imágenes tridimensionales del corazón despejado

Resumen

La proliferación de cardiomiocitos después de una lesión es un proceso dinámico que requiere una sinfonía de señales extracelulares de poblaciones de células no miocitos. Utilizando el trazado de linaje, la CLARIDAD pasiva y las técnicas tridimensionales de microscopía confocal de montaje completo, podemos analizar la influencia de una variedad de tipos de células en la reparación y regeneración cardíaca.

Resumen

Las enfermedades cardiovasculares son las que más se operando a todas las demás causas de muerte y son responsables de un asombroso 31% de las muertes en todo el mundo. Esta enfermedad se manifiesta en lesiones cardíacas, principalmente en forma de un infarto agudo de miocardio. Con poca resiliencia después de una lesión, el tejido cardíaco una vez sano será reemplazado por tejido cicatricial fibroso, no contráctelo y a menudo será un preludio de la insuficiencia cardíaca. Para identificar nuevas opciones de tratamiento en medicina regenerativa, la investigación se ha centrado en vertebrados con capacidades regenerativas innatas. Uno de estos organismos modelo es el ratón neonatal, que responde a una lesión cardíaca con una sólida regeneración miocárdica. Con el fin de inducir una lesión en el ratón neonatal que es clínicamente relevante, hemos desarrollado una cirugía para ocluir la arteria descendente anterior izquierda (LAD), reflejando un infarto de miocardio desencadenado por la aterosclerosis en el corazón humano. Cuando se combina con la tecnología para realizar un seguimiento de los cambios tanto dentro de las poblaciones de cardiomiocitos como de no miocitos, este modelo nos proporciona una plataforma para identificar los mecanismos que guían la regeneración del corazón. Obtener información sobre los cambios en las poblaciones de células cardíacas después de la lesión una vez se basó en gran medida en métodos como la sección de tejidos y el examen histológico, que se limitan al análisis bidimensional y a menudo dañan el tejido en el proceso. Además, estos métodos carecen de la capacidad de rastrear los cambios en los linajes celulares, sino que proporcionan simplemente una instantánea de la respuesta a la lesión. Aquí, describimos cómo los métodos tecnológicamente avanzados en los modelos de trazado de linaje, la limpieza de órganos enteros y la microscopía tridimensional (3D) de montaje completo se pueden utilizar para dilucidar los mecanismos de reparación cardíaca. Con nuestro protocolo para la cirugía de infarto de miocardio de ratón neonatal, la limpieza de tejidos y la toma de imágenes de órganos enteros en 3D, las complejas vías que inducen la proliferación de cardiomiocitos pueden desentrañarse, revelando nuevas dianas terapéuticas para la regeneración cardíaca.

Introducción

El corazón ha sido considerado durante mucho tiempo como un órgano post-mitótico, sin embargo, la evidencia reciente demuestra que la renovación de cardiomiocitos ocurre en el corazón humano adulto en alrededor del 1% por año¹. Sin embargo, estas bajas tasas de rotación de cardiomiocitos son insuficientes para reponer la pérdida masiva de tejido que se produce después de una lesión. Un corazón que ha sufrido un infarto de miocardio perderá alrededor de mil millones de cardiomiocitos, a menudo sirviendo como preludio de la insuficiencia cardíaca y la muerte súbita cardíaca^2,3. Con más de....

Protocolo

Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía para el Uso y Cuidado de Animales de Laboratorio y de conformidad con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en la Escuela de Medicina y Salud Pública de la Universidad de Wisconsin-Madison. Todos los métodos se realizaron en líneas de ratón transgénicas (B6) y transgénicas de tipo salvaje C57BL/6J (B6) y líneas de ratón transgénicas obtenidas de Jackson Laboratories.

1. Oclusión de la arteria coronaria (infarto de miocardio) Inducida a través de la ligadura de la arteria descendente anterior izquierda (LAD) en ratones neonatales de 1 día de edad^6....

Resultados

A menudo, los dos pasos más desafiantes son guiar el corazón fuera de la cavidad torácica y ligar el LAD. Para solucionar estos pasos, se pueden realizar ajustes en la colocación de la punción inicial entre los cuartos músculos intercostales; si la punción y la disección contundente están demasiado cerca del esternón, es posible que el corazón no pueda salir de la cavidad torácica(Figura 1A).

Además, puede ser necesario aumentar la presión en el a.......

Discusión

Las interacciones células celulares entre los cardiomiocitos y las poblaciones no miocitos son un factor determinante de si el corazón sufrirá fibrosis o reparación después de una lesión. Se han realizado descubrimientos demostrando que una variedad de tipos de células, incluyendo nervios^14,células epicardiales²⁴, macrófagos peritoneales²⁵, arteriolas^12,,13,y células endoteliales linfáticas

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1-tioglicerol
6-0 Suturas de Prolene	Ethicon	8889H	Suturas de polipropileno
Acrilamida
Ácido
Pinzas curvas	Excelta	16-050-146	Media curva, dentada, 4 en
pinzas de vendaje	Fisherbrand	13-812-39	Vial de disección, 4,5 pulgadas
Vial de vidrio	Fisherbrand	03-339-26A	12 x 35 mm Vial con tapón
Histodenz	Sigma-Aldrich		Medio con gradiente de densidad
Tijeras de iridectomía	Fine Science Tools	15000-03	mm Filo de corte
Tijeras de disección grandes	Fisherbrand	08-951-20	Recto, 6 pulgadas
Portaagujas	Fisherbrand	08-966	Mayo-Hegar, 6 pulgadas
Tampón
de paraformaldehído
Pinzas afiladas	Sigma-Adrich	Z168777	fina, recta, 4,25 pulgadas
tijera de disección pequeña	Walter Stern Inc	25870-002	30 mm Cuchilla Asida
de
Dodecilo de Sodio Sulfato (SDS)
Pinza de tejido	Excelta	16050133	tejido medio, 1X2 dientes
VA-044	Wako Chemicals		Iniciador azoico soluble en agua

bórico 2 de fosfato punta Sodio