Membran olgun adiposit agrega kültürü (MAAC) kültür olgun insan adipositler için yeni bir yöntemdir. Burada insan yağlarından adipositleri nasıl izole edebileceğimizi ve MAAC’ı nasıl kurabileceğimizi ayrıntılarıyla anlatıyoruz.
Beyaz yağ dokusu (WAT) disregülasyonu insülin direnci ve tip 2 diyabet (T2D) gelişiminde merkezi bir rol oynar. T2D için yeni tedaviler geliştirmek için, daha fizyolojik olarak ilgili in vitro adiposit modelleri gereklidir. Bu çalışma, insan adipositlerini izole etmek ve kültür emzetmek için yeni bir tekniği tanımlar. Bu yöntem MAAC (membran olgun adiposit agrega kültürü) olarak adlandırılır ve diğer adiposit in vitro modelleri ile karşılaştırıldığında, MAAC taze izole olgun adipositlere en yakın adipojenik gen imzasına sahiptir. MAAC kullanılarak, adipositler yalın ve obez hastalardan, farklı yağ depolarından, farklı hücre tipleriyle birlikte kültüre alınabilir ve daha da önemlisi 2 hafta boyunca kültürde tutulabilir. Fonksiyonel deneyler de glikoz alımı, lipogenez ve lipoliz de dahil olmak üzere MAAC yapılabilir. Ayrıca, MAAC çeşitli farmakolojik agonizme sağlam yanıt ve kahverengi gibi yağ hücrelerine beyaz adipositlerin transdifferentiation dahil olmak üzere adiposit fenotipik değişiklikleri incelemek için kullanılabilir.
Obezite ve obeziteile ilgili eşlik eden hastalıklardaki dünya çapındaki artış yeni tedavi olanaklarının geliştirilmesini gerektirmektedir. Beyaz yağ dokusu (WAT) tüm vücut metabolizmasının önemli bir düzenleyici, enerji homeostaz, ve insülin direnci ve tip 2 diyabet gelişiminde merkezi bir oyuncu (T2D)1,2. Kronik aşırı kalori tüketimi sırasında, adipositler enerji fazlalığı işlemek için büyütmek. Ancak, adiposit lipid depolama kapasitesi aşılabilir, yağ asitleri dolaşım düzeylerinin bir yükseklik ve periferik non-adipoz dokularda artan depolama ve lipotoksite yol açan3,4.
Yüksek çevirisel alaka ile adiposit in vitro modellerin eksikliği obezite ve T2D için yeni tedavilerin geliştirilmesinde önemli bir sorundur. Ex vivo eksplant modeli, yağ dokusunun küçük parçaları kültürlü olduğu, hipoksi ve inflamasyon tarafından yönlendirilen adipojenik gen ekspresyonunda hızlı değişiklikler ile ilişkilidir5,6. Tavan kültürleri (CCs) olgun adipositler yüzer ve medya dolu şişelerin üst yapışır, hızla lipideksikliğifibroblast benzeri hücrelere farklılaşmak7 ,8,9,10. En sık kullanılan model, in vitro olarak işlenen öncüllerden ayırt edilen adipositlerdir. Ayırt edici hücreler, ancak, morfolojik olarak erişkin olgun adipositlerden farklıdır, çünkü boyutları çok daha küçüktür ve tekiloküler lipid damlacığı ndan yoksundur. Bu model ile diğer sınırlamalar farklılaşma sürücü için bir kimyasal kokteyl fizyolojik ihtiyacı yanı sıra faktörlerin bir dizi etkilenebilir farklılaşma verimliliği değişkenlik içerir11,12,13,14.
Biz son zamanlarda membran olgun adiposit agrega kültür geliştirdik (MAAC), taze izole olgun adipositler uzun vadeli kültür için bir yöntem, adipositler geçirimli membranlar altında kültürlü10. RNA dizilimi verilerinin tarafsız analizi, yağ dokusu eksektiflerine ve in vitro-didipositlere göre MAAC’ın yeni izole edilmiş adipositlere en çok benzediğini göstermiştir. MAAC hem deri altı hem de visseral yağ dokusundan izole edilmiş olgun adipositlerin yanı sıra hem obez hem de yağsız deneklerin adipositlerini kültüre almak için kullanılabilir. Bu metodoloji uzun vadeli adiposit fenotipik değişikliklerin incelenmesine izin verir ve diğer hücre tipleri ile adipositlerin ortak kültürünü kolaylaştırır. Burada insan yağ dokusundan olgun adipositlerin izolasyonu ve MAAC sisteminin nasıl kurulması için ayrıntılı bir protokol salıyoruz.
Membran olgun adiposit agrega kültürü (MAAC) taze izole olgun adipositlerin uzun vadeli kültür için yeni bir yöntemdir. MAAC’ın kurulmasında, protokolde olgun adipositlerin verimini, kalitesini ve uygulanabilirliğini büyük ölçüde etkileyen birkaç kritik adım vardır. Bu adım doğrudan adipositler kollajenaz maruz kalan zaman miktarını etkiler beri çok çaba adım 3.2 yağ kıyma koymak gerekir. Yağ parçaları çok büyükse, sindirim süresi nin uzatılması gerekir ve bu da hücrelerin canlılığını olumsuz etkiler. Tersine, doku makasla çok ince işlenirse, canlılık da etkilenebilir. MAAC olarak olgun adipositlerin başarılı bir kültür için, aşağıdaki adımlara özel dikkat vermelidir: membranlar üzerine adipositlerin başarılı tohumlanması için, serbest lipid ve taşıma yıkama tampon olgun adipositler kaldırılır çok önemlidir adım 5.3 ve 5.4. Kalan lipid veya yıkama tamponu adipositlerin yüzey gerilimini azaltacak ve adipositlerin ters çevrildiğinde membranlardan damlama riskini artıracaktır. Adipositler tohumlu ve ortamda olduğunda, hücreler öncelikle yüzdürme yoluyla membran ile temas halinde kalır, böylece hücreleri kaybetmemek için ortam değiştirirken yavaş ve nazik bir teknik önerilir. Adım 7.1’de açıklandığı gibi kuyuların altındaki ortamı çıkarın ve medyayı duvarların kenarlarından yavaşça borulayarak ortam ekleyin. Son olarak, zaman tasarrufu önerisi adiposit izolasyon işlemi önce medya ve tedaviler ile plakaları hazırlamaktır. Özellikle karmaşık deneysel tasarımlar için, plakaların önceden hazırlanması çok zaman kazandırır ve adipositlerin izole edilir yayılmaz tedavileri ile ortama yerleştirilmesini sağlar.
Maac kullanarak preadipocytes ayırt karşılaştırıldığında bir yararı kullanılan MAAC medya çok basit ve fizyolojik olmayan bir hormon kokteyl gerektirmez. Burada glikoz açısından zengin medya (DMEM/F12), %10 FBS, %1 penn/strep ve 20 nM insülin ile kültürlenmiş MAAC’a sahibiz. Daha da önemlisi, insülin kesinlikle UCP110rosiglitazone / pioglitazone tahrik indüksiyon için gerekli olduğunu bulduk. İnsülin, ancak, hücrelerin adipojenik fenotip korumak için gerekli değildir. Böylece, deneysel soruya bağlı olarak, insülin dahil edilebilir veya atlanabilir.
Yukarıda ayrıntılı prosedür izolasyon ve insan adipositkültürü için optimize edilmiştir. Ancak, fare, ve muhtemelen diğer organizmanın adipositler, aynı zamanda MAAC olarak kültürlü olabilir. Fare adipositleri MAAC olarak kültürlenecekse, akılda tutulması gereken ek hususlar ve önlemler vardır. Farelerden gelen olgun adipositlerin insanlardan çok daha kırılgan olduğunu bulduk. Sonuç olarak, sindirim süresi hücre canlılığını artırmak için mutlak bir minimumkısaltılmalıdır. Ayrıca genç farelerden gelen adipositlerin (8 haftalık ve genç) en sağlam ve tekrarlanabilir sonuçları sağladığını bulduk. Son olarak, fare MAAC bir haftaya kadar kültürlenebilir, ancak adipojenik fenotiplerinin insanlardan daha az kararlı göründüğü göz önüne alındığında (en az iki hafta boyunca kültürlenebilir) fare MAAC’ı ele almak için gereken en az süre için kültüre almanızı öneririz. deneysel sorular.
MAAC modeli geçirimli membranlar kullanılarak dayandığıiçin, bu tekniğin bir avantajı diğer hücre tipleri ile birlikte olgun adipositler kültüre olasılığıdır. Daha önce maac10kullanımı ile crosstalk olgun adipositler ve makrofajlar yeteneğini göstermiştir. Bu daha fazla obezite arasındaki bağlantıyı keşfetmek için fırsatlar açılır, insülin direnci, ve bağışıklık yanıtları15,16,17. Gelecekteki deneyler, MAAC modelinin karmaşıklığını ve çevirisel alaka düzeyini daha da artırmak ve birden fazla hücre tipi arasındaki çapraz konuşmayı araştırmak için hepatositler, preadipocytes, endotel hücreleri veya pankreas hücreleri gibi diğer hücre türlerini de dahil edebilir.
MAAC’ın diğer adiposit in vitro modellere göre adipositlerin işlevselliğini ve kimliğini korumada üstün olduğu gösterilmiş olsa da, dikkate alınması gereken sınırlamalar da vardır. Öncül hücrelerden farklı olan adipositlerin kullanılmasıyla karşılaştırıldığında, MAAC daha zahmetli ve zaman alan bir modeldir. Membranlı plakalar da normal hücre kültürü plakalarına göre daha pahalıdır. Daha da önemlisi, olgun adipositler tohumlama üzerine her zaman taze izole edilmesi gerekir ve genişletilemez veya öncül hücreler gibi stoklar içine dondurulmuş. Böylece, bu taze beyaz yağ dokusu örnekleri ne erişim gerektirir, ama aynı zamanda donör varyasyonları donör kaynaklanan karmaşıklık düzeyi ekler.
Burada insan olgun adipositler izole ve MAAC kurma için ayrıntılı bir protokol sunduk. MAAC olarak kültürlenmiş adipositlerin iki hafta boyunca canlı kaldıklarını, adipojenik gen izlerinin korunduğunu ve çeşitli farmakolojik agonizme yanıt verdiklerini gösterdik. MAAC kullanarak çapraz konuşma betweeen adipositler ve diğer hücre tipleri çalışma ve farklı uyaranlara yanıt olarak olgun adipositlerin uzun vadeli fenotibik değişikliklerin değerlendirilmesi için izin verir.
The authors have nothing to disclose.
Xiao-Rong Peng ve Stefan Hallen’e kaynak sağladıkları ve adiposit izolasyonlarını optimize edildikleri için, teknik yardım için Martin Uhrbom’a ve daniel Olausson ve Malin Lönn’e insan yağlarını koordine edip sağladıkları için teşekkür ederiz.
Autoclaved scissors | |||
Autoclaved spoons | |||
Autoclaved tweezers | |||
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A6003 | |
Buffer RLT | QIAGEN | 79216 | Lysis buffer |
CaCl2*2H2O | Sigma-Aldrich | C7902 | |
Conical tubes, 50 mL | |||
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
DMEM/F-12 | Gibco | 31331-028 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
Filter flask 0.2 µm pore size, 75 mm | Thermo Scientific | 156-4020 | 500 mL |
Filter flask 0.2 µm pore size, 75 mm | Thermo Scientific | 158-0020 | 1000 mL |
HBSS+CaCl2+MgCl2 | Gibco | 14065-49 | |
HEPES buffer solution (1M) | Gibco | 15630-056 | |
High-Capacity cDNA Reverse Transcription kit | Applied Biosystems | 4368814 | |
Insulin (Actrapid Penfill) | Novo Nordisk A/S | ||
KCl | Merck | 104936 | |
KH2PO4 | Merck | 104873 | |
Medium 199 | Gibco | 10012-011 | |
Mesh filter (250 µM) | Sintab AB | 6111-025043 | |
MgSO4*7H2O | Sigma-Aldrich | M1880 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Needles, 18G, 1.20×40 mm | Sterican | 613-2948 | |
Pencillin-Streptomycin (Penn/Strep) | Gibco | 15140 | |
Petri dishes, 150×21 mm | Thermo Scientific | 168381 | |
Power SYBR Green PCR master mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
Quantstudio 7 Flex Real-Time PCR machine | Applied Biosystems | ||
RNeasy Mini kits | QIAGEN | 74106 | |
Separation funnel | VWR | 527-0008 | For large scale preparation |
Separation funnel | VWR | 527-0005 | For small scale preparation |
Shaking incubator (37 °C) | |||
Syringes, 5 mL | Omnifix | 612-2892 | 100 st |
Tissue culture incubator (37 °C, 5% CO2) | |||
Transwells, 24-well (6,5 mm) | Costar | 3397 | Permeable membrane inserts |
TRIzol reagent | Invitrogen | 10296010 | Lysis buffer |
Type 2 Collagenase | Worthington | LS004177 |