Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

मैट्रिक्स-सेल मेटाबोलिक क्रॉसटॉक का अध्ययन करने के लिए एक मानव 3 डी एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स-एडिपोसाइट संस्कृति मॉडल

Published: November 7, 2019 doi: 10.3791/60486
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 5, 1,2, 1, 2,3,4, 1,6
1Department of Surgery, University of Michigan Medical School, 2Department of Pediatrics and Communicable Diseases, University of Michigan Medical School, 3Graduate Program in Immunology, University of Michigan Medical School, 4Graduate Program in Cellular and Molecular Biology, University of Michigan Medical School, 5Undergraduate Research Opportunity Program, University of Michigan, 6Department of Surgery, Ann Arbor Veterans Affairs Healthcare System

Summary

हम विट्रो संस्कृति प्रणाली में 3 डी मानव बाह्य मैट्रिक्स-आदिपोसाइट का वर्णन करते हैं जो मैट्रिक्स और आदिपोसाइट्स की भूमिकाओं के विच्छेदन को ऊतक मेटाबोलिक फेनोटाइप में योगदान करने की अनुमति देता है।

Abstract

एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम) ऊतक होमोस्टासिस को विनियमित करने, कोशिकाओं के साथ क्रॉसटॉक में उलझाने और सेलुलर फ़ंक्शन के कई पहलुओं को विनियमित करने में एक केंद्रीय भूमिका निभाता है। ईसीएम मोटापे में ऊतक समारोह को कम करने में विशेष रूप से महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, और एडीपोज ऊतक ईसीएम जमाव और संरचना में परिवर्तन चूहों और मनुष्यों में मेटाबोलिक रोग से जुड़े होते हैं। विट्रो मॉडल में ट्रैक करने योग्य है कि वैश्विक ऊतक फेनोटाइप में योगदान में ईसीएम और कोशिकाओं की भूमिकाओं के विच्छेदन की अनुमति विरल हैं । हम मानव ईसीएम-आदिपोसाइट संस्कृति के एक उपन्यास 3डी इन विट्रो मॉडल का वर्णन करते हैं जो एडीपोज ऊतक मेटाबोलिक फेनोटाइप को विनियमित करने में ईसीएम और एडीपोसाइट्स की विशिष्ट भूमिकाओं के अध्ययन की अनुमति देता है। मानव एडीपोज़ ऊतक को ईसीएम को अलग करने के लिए विसेमिलीकृत किया जाता है, जिसे बाद में पेरीडपोसाइट्स के साथ फिर से आबाद किया जाता है जो तब ईसीएम के भीतर परिपक्व आदिपोसाइट्स में अंतर करते हैं। यह विधि ईसीएम-आदिपोसाइट निर्माण बनाती है जो चयापचय रूप से सक्रिय होती हैं और ऊतकों और रोगियों की विशेषताओं को बनाए रखती हैं जिनसे वे प्राप्त होते हैं। हमने मानव एडीपोज ऊतक में रोग-विशिष्ट ईसीएम-आदिपोसाइट क्रॉसटॉक प्रदर्शित करने के लिए इस प्रणाली का उपयोग किया है। यह संस्कृति मॉडल वैश्विक एडीपोज ऊतक मेटाबोलिक फेनोटाइप में योगदान करने में ईसीएम और एडीपोसाइट्स की भूमिकाओं को विच्छेदन करने के लिए एक उपकरण प्रदान करता है और एडीपोज ऊतक होमोस्टोसिस को विनियमित करने में ईसीएम की भूमिका के अध्ययन की अनुमति देता है।

Introduction

बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) न केवल ऊतकों के लिए एक यांत्रिक पाड़ प्रदान करता है, बल्कि कोशिकाओं के साथ जटिल क्रॉसटॉक में भी संलग्न है जो इसके भीतर रहते हैं, कोशिका प्रसार सहित ऊतक होमोस्टासिस के लिए आवश्यक विविध प्रक्रियाओं को विनियमित करते हैं, भेदभाव, सिग्नलिंग, और चयापचय1. जबकि स्वस्थ ईसीएम सामान्य ऊतक समारोह के रखरखाव के लिए एक आवश्यक भूमिका निभाता है, बेकार ईसीएम कई बीमारियों2में फंसाया गया है ।

मेटाबोलिक रोग के रोगजनकता में एडीपोज ऊतक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। मोटापा अत्यधिक आदिपोसाइट हाइपरट्रॉफी और सेलुलर हाइपोक्सिया, एडीपोसाइट सेलुलर मेटाबोलिज्म में दोष, और ऊतक एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम और ऑक्सीडेटिव तनाव और सूजन को कम करता है। जबकि खराब समझ में आता है, ये जटिल प्रक्रियाएं ऊतक पोषक तत्व बफरिंग क्षमता को ख़राब करने की साजिश करती हैं, जिससे एडीपोस ऊतक, कई ऊतकों में विषाक्तता, और प्रणालीगत मेटाबोलिक रोग3,4 से पोषक तत्व ओवरफ्लो होते हैं ,5. घटनाओं और विशिष्ट तंत्र है कि ऊतक विफलता को कम करने के अनुक्रम खराब समझ रहे हैं, लेकिन adipose ऊतक ECM में परिवर्तन फंसाया गया है । ईसीएम संरचना मानव और मूत्र मोटापे में एडीपोज ऊतक के भीतर बदल जाती है, जिसमें ईसीएम प्रोटीन के बढ़ते जमाव के साथ-साथ मानव मेटाबोलिक रोग से जुड़े एडीपोस ऊतक ईसीएम में गुणात्मक जैव रासायनिक और संरचनात्मक अंतर शामिल हैं। टाइप 2 डायबिटीज और हाइपरलिपिडेमिया6,7,8,9,10,11.

इन टिप्पणियों के बावजूद, एडीपोस ऊतक रोग मध्यस्थता में एडीपोज ऊतक ईसीएम की भूमिका अच्छी तरह से परिभाषित नहीं है। यह ट्रैक करने योग्य प्रयोगात्मक मॉडलों की कमी के कारण भाग में है जो अंतिम एडीपोस ऊतक फ़ंक्शन को विनियमित करने में ईसीएम और आदिपोसाइट्स की विशिष्ट भूमिकाओं के विच्छेदन की अनुमति देते हैं। ईसीएम-आदिपोसाइट संस्कृति कम से कम दो मामलों में देशी एडीपोस ऊतक के वीवो वातावरण में बेहतर अनुकरण करती है। सबसे पहले, ईसीएम संस्कृति देशी एडीपोज ऊतक के समान एक आणविक वातावरण प्रदान करती है, जिसमें देशी कोलेजन, इलास्टिन और अन्य मैट्रिक्स प्रोटीन मानक 2डी संस्कृति में अनुपस्थित होते हैं। दूसरे, 2डी प्लास्टिक पर संस्कृति को प्लास्टिक सब्सट्रेट12की लोच में कमी के कारण यांत्रिक प्रभावों के माध्यम से आदिपोसाइट चयापचय को बदलने के लिए दिखाया गया है, जो ईसीएम-संस्कृति समाप्त हो जाती है।

पुनर्योजी और पुनर्निर्माण दवा और ऊतक इंजीनियरिंग13,14के संदर्भ में ईसीएम के अलगाव से जैविक मचानों को इंजीनियर करने के तरीकों का अध्ययन किया गया है, 15,16,17,18. हमने पहले कार्यप्रणाली प्रकाशित की है जिसमें हमने मानव ईसीएम-आदिपोसाइट संस्कृति के इन विट्रो 3डी मॉडल को विकसित करने के लिए इन तरीकों को अनुकूलित किया है, जिसमें मानव आंत से प्राप्त ईसीएम और आदिपोसाइट स्टेम सेल (preadipocytes) का उपयोग करके11ऊतकों को प्राप्त किया गया है। वर्तमान लेख में हम इन तरीकों का विस्तार से वर्णन करते हैं। मानव एडीपोज ऊतक के लिए विशिष्ठता प्रक्रिया एक चार दिवसीय प्रक्रिया है जिसमें कोशिकाओं और लिपिड को हटाने के लिए यांत्रिक और एंजाइमैटिक उपचार शामिल हैं, एक जैविक पाड़ छोड़ना जो ऊतक की विशेषताओं को बनाए रखता है जिससे यह प्राप्त होता है। Decellularized ECM मानव preadipocytes के आदिपोजेनिक भेदभाव का समर्थन करता है, और जब आदिपोसाइट्स के साथ पुनर्गठित, माइक्रोआर्किटेक्चर और जैव रासायनिक और रोग-अक्षुण्ण एडीपोज ऊतक की विशिष्ट विशेषताओं को बनाए रखता है और मेटाबोलिक में संलग्न है देशी एडीपोस ऊतक की विशेषता कार्य करता है। इस मैट्रिक्स का अकेले अध्ययन किया जा सकता है या कोशिकाओं के साथ फिर से बीज ित किया जा सकता है, जिससे एडीपोस ऊतक के सेलुलर और अतिरिक्त सेलुलर घटकों के बीच बातचीत और क्रॉसटॉक के अध्ययन की अनुमति दी जा सकती है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

संस्थागत समीक्षा बोर्ड की मंजूरी के तहत ऐच्छिक बैरिएट्रिक सर्जरी से गुजर रहे मानव विषयों से आदिवास ऊतक खरीदे जाते हैं ।

1. Preadipocyte अलगाव और संस्कृति अभिकर्मक तैयारी

  1. 1x फॉस्फेट बफरेड लवकुश (पीबीएस) में 2% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) तैयार करें। फिल्टर स्टरलाइज करें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. टाइप II कोलेजेनेस तैयार करें: 1x पीबीएस में 2% बीएसए में 2 मिलीग्राम/एमएल। उपयोग से पहले तुरंत तैयारी करें।
  3. रेड ब्लड सेल (आरबीसी) लायसिंग सॉल्यूशन तैयार करें: 1.5 एम एनएच4सीएल, 100 एम एम नाहको3,10 एम एम डिसोडियम ईडीटीए डिओनाइज्ड वॉटर (डीआई/एच2ओ) में। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। उपयोग से तुरंत पहले DI/H2O में 10x स्टॉक समाधान से 1x आरबीसी लाइसिंग समाधान तैयार करें।
  4. विकास मीडिया तैयार करें: 15% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 1% एंटीबायोटिक एंटीमाइकोटिक समाधान (ABAM) Dulbecco संशोधित ईगल माध्यम में: पोषक तत्व मिश्रण एफ-12 (DMEM/F12) । फिल्टर स्टरलाइज करें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  5. Preadipocyte फ्रीजिंग समाधान तैयार करें: 10% डिमेथिल सल्फासऑक्साइड, डीएमईएम/एफ12 मीडिया में 15% एफबीएस। फिल्टर स्टरलाइज करें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  6. तैयार करें डिविडेंड मीडिया: 10 मिलीग्राम/एल ट्रांसफरिन, 33 माइक्रोन बायोटिन, 0.5 माइक्रोएम ह्यूमन इंसुलिन सॉल्यूशन, 17 माइक्रोन डी-पेंटोथेनिक एसिड हेमीकैल्शियम नमक, 100 एनएम डिक्सेटोसिससोन, 2 एनएम 3,3,3,5-ट्रिओडो-एल-थाइरोनिन सोडियम नमक (टी3), 1 माइक्रोएम सिग्लिटिजोन, 540 माइक्रोएम 3एम आइसोबुटिल-1-मिथाइलक्सेंथिन (आईबीएमएक्स), डीएमईएम/F12 में 1% ABAM । फिल्टर स्टरलाइज करें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. ईसीएम रिएजेंट तैयारी

  1. तैयार करें फ्रीजिंग बफर सॉल्यूशन: 10 एमएम ट्रिस बेस, 5 एमएम ईटीए, 1% एबाम, 1% फिनाइलमेथिलसल्फोनाइल फ्लोराइड (पीएमएसएफ) डीआई/एच2ओ हलचल समाधान में EDTA को भंग करने के लिए। पीएच को एचसीएल या NaOH.Store के साथ 8.0 से 3 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर समायोजित करें।
  2. #1 एंजिमैटिक सॉल्यूशन तैयार करें: 0.25% ट्राइप्सिन-ईटीए में 1% ABAM। 3 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. रिंसिंग बफर सॉल्यूशन तैयार करें: 137 एमएम एनसीएल, 2.68 एमएम केसीएल, 7 एमएम एनए2एचएमओ4,1.5 एमएम केएच2पीओ4,1% एबाम, 1% पीएमएसएफ में निष्फल डीआई/एच2ओ हलचल लवण ों को भंग करने के लिए। एचसीएल या नाओएच के साथ पीएच को 8.0 पर समायोजित करें। 3 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. #2 एंजाइमैटिक सॉल्यूशन तैयार करें: 55 एमएम एनए2एचपीओ4,17 एमएम एचएएच2पीओ4,4.9 एमएम एमजीएसओ4'7एच2ओ, 1% ABAM, 1% पीएमएसएफ में डीआई/एच2ओ स्टोर 4 डिग्री सेल्सियस तक 3 महीने तक। लवण भंग करने के लिए हिलाओ। उपयोग करने से तुरंत पहले, पोर्सिन अग्न्याशय, प्रकार VI-S से 80 यू/एमएल लिपेस जोड़ें; १६० यू/mL deoxyribonuclease मैं गोजातीय अग्न्याशय से, प्रकार द्वितीय एस; और १०० μg/mL ribonuclease एक गोजातीय अग्न्याशय से, प्रकार III-ए ।
  5. ध्रुवीय सॉल्वेंट निष्कर्षण समाधान तैयार करें: आइसोप्रोपेनॉल में 1% ABAM, 1% पीएमएसएफ।
    सावधानी: आइसोप्रोपेनॉल ज्वलनशील है; 25 डिग्री सेल्सियस पर ज्वलनशील कैबिनेट में स्टोर करें और ज्वलनशील कचरे में निपटाना।
  6. 70% इथेनॉल, 1% ABAM, DI/H2O. में 1% PMSF तैयार करें उपयोग करने से ठीक पहले ABAM और PMSF जोड़ें।
    सावधानी: इथेनॉल ज्वलनशील है; 25 डिग्री सेल्सियस पर ज्वलनशील कैबिनेट में स्टोर करें और ज्वलनशील कचरे में निपटाना।
  7. भंडारण समाधान तैयार करें: 1% ABAM, 1x PBS में 1% पीएमएसएफ। 3 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

3. मेटाबोलिक फेनोटाइपिंग रिएजेंट तैयारी

  1. ग्लूकोज तेज
    1. सीरम भुखमरी मीडिया तैयार करें: DMEM/F12, 1% ABAM । फिल्टर स्टरलाइज करें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें
    2. उपयोग से तुरंत पहले 1x पीबीएस में 200 एनएम मानव इंसुलिन समाधान तैयार करें।
    3. 1x पीबीएस में 200 एनएम मानव इंसुलिन, 0.1 एमएम 2-डेऑक्सी-डी-ग्लूकोज, 1 माइक्रोसी/वेलडिऑक्सी-डी-ग्लूकोज, 2-[1,2-3 एच (एन)]- तैयार करें। उपयोग से पहले तुरंत तैयारी करें।
  2. लिपोलिसिस
    1. पीबीएस में आइसोप्रोटेरेनॉल तैयार करें: 3 एमएम स्टॉक समाधान। परख के लिए 3 μM की एकाग्रता काम करने के लिए पतला।
  3. तेल लाल-ओ धुंधला
    1. कमरे के तापमान पर DI/H2O स्टोर में 4% फॉर्मेलिन तैयार करें ।
    2. ऑयल रेड-ओ वर्किंग सॉल्यूशन तैयार करें। एक 3:2 अनुपात में DI/H2O के साथ तेल लाल-ओ समाधान(ORO) पतला (ORO) । उपयोग से पहले तुरंत तैयारी करें। फिल्टर पेपर(सामग्री की तालिका) केमाध्यम से फ़िल्टर करें।

4. एडीपोज टिश्यू प्रोक्योरमेंट

नोट: आंत एडीपोज ऊतक (वैट) सर्जन द्वारा ऑपरेशन की शुरुआत में अधिक से अधिक ओमेंटम से एकत्र किया जाता है और तत्काल प्रसंस्करण के लिए बर्फ पर प्रयोगशाला में वापस ले जाया जाता है। सार्वभौमिक सावधानियों का उपयोग सभी मानव ऊतकों और कास्टिक अभिकर्मकों को संभालते समय किया जाना चाहिए, जिसमें एक लैमिनार प्रवाह हुड में सभी काम करना, पूर्ण प्रयोगशाला सुरक्षा पहनने का उपयोग करना और सुइयों का कोई त्याग करना शामिल है।

  1. ऊतक नमूना विसर्जित करने के लिए 50 मीटर शंकुई ट्यूब में फ्रीजिंग बफर समाधान के 15-25 मीटर के लिए बरकरार वैट के 5-10 ग्राम जोड़ें। 1 महीने तक के लिए, विसेलुलराइजेशन तक -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूने स्टोर करें।
  2. धारा 5 में वर्णित प्रreadipocyte अलगाव के लिए वैट के एक अलग ताजा नमूने का उपयोग करें।

5. प्रांपीसिसाइट अलगाव

  1. कोलेजेनेज, टाइप II, 50 मीटर शंकुई ट्यूब में समाधान के 20 मीटर में 2 ग्राम बरकरार वैट रखें। फिर शंकुट्यूब में बाँझ कैंची डालने और ट्यूब के भीतर ऊतक कीमा बनाकर अच्छी तरह से कीमा करें। एक बार पूरी तरह से एक ठीक घोल के लिए कीमा बनाया हुआ, 130 आरपीएम पर एक कक्षीय शेखर पर कोलेजेनेज़ समाधान में ऊतक को इनक्यूबेट करें और 60 मीटर के लिए 37 डिग्री सेल्सियस।
  2. एक ताजा शंकुट्यूब के शीर्ष पर मुड़ा जाल के एक टुकड़े के माध्यम से एक शंकुई ट्यूब से डिजीएस्टेट डालने के द्वारा एक ताजा 50 मीटर नायलॉन जाल के माध्यम से परिणामी डिगएस्टेट को फ़िल्टर करें। इस बिंदु पर डिएस्टेट मध्यम चिपचिपाहट के साथ एक पीला-नारंगी तरल होना चाहिए, जिसमें अपाच्य रेशेदार ऊतक की अवशिष्ट किस्में थोड़ी मात्रा में होना चाहिए। जाल को अपाच्य ऊतक के बड़े टुकड़ों को पकड़ना चाहिए, जिन्हें त्याग दिया जाता है।
  3. 10 00 मीटर के लिए 270 x ग्राम पर नमूना अपकेंद्रित करें। 1x आरबीसी लायसिंग सॉल्यूशन के 2 मीटर में सेल पेलेट को पिपेट के साथ रीसस्पेंड करें।
    1. 25 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिन के लिए इनक्यूबेट और फिर 15% FBS-DMEM/F12 के 10 mL जोड़ें । 10 मिन के लिए 270 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
  4. अधिनायक को हटादें और एक पिपेट के साथ 15% एफबीएस-डीएमईएम/F12 के 10 mL में सेल पैलेट को फिर से निलंबित करें । सेल निलंबन को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर एक पिपेट और इनक्यूबेट के साथ 100 मिमी पेट्री डिश में स्थानांतरित करें, जब तक कि कोशिकाएं 80-100% संगम तक न पहुंच जाएं, आमतौर पर 2-6 दिन। हर 2-3 दिन में मीडिया बदलें।
  5. अलग और धोने की कोशिकाओं।
    1. एक पिपेट के साथ मीडिया निकालें और अनुयायी कोशिकाओं के लिए 0.25% ट्राइप्सिन-EDTA के 4 mL लागू होते हैं। 10 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, समय-समय पर कोशिकाओं को अलग करने के लिए प्लेट को धीरे-धीरे घूमता है।
    2. 15% FBS-DMEM/F12 के 20 mL जोड़ें और एक पिपेट के साथ इस मीडिया में अलग कोशिकाओं को फिर से निलंबित । फिर 10 मीटर के लिए एक ताजा 50 mL शंकुन ट्यूब और अपकेंद्रित्र 270 x ग्राम में स्थानांतरित करें।
    3. अधिसंचलक निकालें और त्यागें। 1x पीबीएस में एक बार सेल पैलेट धोएं, और फिर एक पिपेट के साथ ताजा 15% FBS-DMEM/F12 के 20 mL में सेल पैलेट को फिर से निलंबित करें । सेल निलंबन को टी-150 कल्चर फ्लास्क में ट्रांसफर करें।
  6. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर संस्कृति कोशिकाएं । विभाजन और कोशिकाओं का विस्तार हर 2-3 दिनों के रूप में वे 0.25% ट्राइप्सिन-EDTA के 7 mL लागू करके 80-100% संगम तक पहुंचने, एक फ्लास्क से 8 फ्लास्क तक विस्तार।
    नोट: यह आम तौर पर 3-4 मार्ग है, जो उचित विस्तार की अनुमति देता है और आदिपोजेनिक क्षमता और रोगी-और डिपो विशिष्ट सेलुलर मेटाबोलिक फेनोटाइप बरकरार रखती है की आवश्यकता है । 4-5 मार्ग से अधिक में पासिंग पेरिपोसाइट्स से एडिपोजेनिक क्षमता का नुकसान होता है।
  7. 8 फ्लास्क में कोशिकाओं को 0.25% ट्राइप्सिन-ईटीए प्रति फ्लास्क के साथ अलग करने के लिए ऊपर वर्णित है, और 10 मीटर के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  8. 15% एफबीएस-DMEM/F12 प्रति फ्लास्क के 8 mL जोड़ें और एक पिपेट के साथ अलग कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें । पूरे सेल निलंबन को समान रूप से तीन 50 मीटर शंकुट्यूब में विभाजित करें और 10 मिन के लिए 270 x ग्राम पर अपकेंद्री रखें।
  9. 15 एमबीएस-डीएमईएम/F12 के 5 mL में परिणामी सेल छर्रों को 15 मीटर शंकुई ट्यूब में फिर से निलंबित करें और सेल काउंटर और ट्राइपैन ब्लू का उपयोग करके कोशिकाओं की गिनती करें ।
  10. 10 मिन के लिए 270 x ग्राम पर सेल निलंबन को सेंट्रलाइज किया। फिर 1 x 10 6/mL की अंतिम कोशिका एकाग्रता केलिए प्रreadipocyte ठंड समाधान में सेल गोली को फिर से निलंबित करें, और प्रति 1.5 ml क्रायोवियल ट्यूब पर सेल निलंबन के 1 mL को एलिकोट करें।
  11. -80 डिग्री सेल्सियस पर 1 दिनों के लिए क्रायोवियल्स में कोशिकाओं को स्टोर करें। फिर 3-6 महीने के लिए दीर्घकालिक भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन में क्रायोवियल स्थानांतरित करें।
  12. उपयोग के लिए तैयार होने पर, 3-5 वर्ष के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में एक क्रायोवियल गल जाएं। 15% एफबीएस-डीएमईएम/एफ 12 के 20 मीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, और 10 वर्ष के लिए 270 x ग्राम पर अपकेंद्री।
  13. 15% एफबीएस-डीएमईएम/एफ 12 के 20 मीटर में सेल पैलेट को फिर से निलंबित करें, एक ही टी-150 फ्लास्क में पिपेट करें, और फिर 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर 2-3 दिनों में 80% संगम तक बढ़ें।
  14. चरण 5.6 में ऊपर वर्णित फ्लास्क प्रति फ्लास्क 0.25% ट्राइप्सिन-ईटीए के 7 मिलील के साथ अलग कोशिकाओं। 15% एफबीएस-डीएमईएम/एफ 12 में प्रति 3 मिलियन कोशिकाओं (यानी, प्रति 20 माइक्रोन) पर पुनर्निलंबित करें, और नीचे उल्लिखित उपयोग करें (धारा 7, चरण 7.4)।

6. एडीपोज टिश्यू ईसीएम तैयारी

  1. 1 दिन: फ्रीज-गल और एंजाइमैटिक पाचन #1
    1. फ्रीज-गल पहले जमे हुए (कदम 4.2) वैट नमूने 50 मिलीआर शंकु ट्यूबों में फ्रीजिंग बफर समाधान में संग्रहित -80 डिग्री सेल्सियस से 37 डिग्री सेल्सियस पहले से गरम पानी स्नान में, कोमल आवधिक मैनुअल आंदोलन के साथ 20 मिन इनक्यूबेटिंग। एक बार गल जाने के बाद, -80 डिग्री सेल्सियस और इनक्यूबेट 20 00 00 में वापस स्थानांतरित करें। 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में नमूनों को विगलन करके समाप्त होने वाले फ्रीज-गल 3x को दोहराएं।
    2. बाँझ संदंश का उपयोग करके, वैट नमूनों को ताजा 50 मिलील शंकुपूर्ण ट्यूबों में स्थानांतरित करें जिसमें एंजामेटिक सॉल्यूशन #1 के 15-25 मिलीएल होते हैं, यह सुनिश्चित करते हुए कि वैट नमूने पूरी तरह से डूब जाएं। फिर एक कक्षीय शेखर (130 आरपीएम, 37 डिग्री सेल्सियस) पर रात भर इनक्यूबेट।
  2. 2 दिन: एंजाइमैटिक पाचन #2
    1. एक कक्षीय शेखर (130 आरपीएम, 37 डिग्री सेल्सियस, 20 00 00 धोने) पर रिनसिंग बफर सॉल्यूशन के 15-25 mL के साथ नमूने 3x धोएं। प्रत्येक धोने के बाद रिंसिंग बफर सॉल्यूशन डालें।
    2. नमूने को ताजा 50 एमएल शंकुवर्ती ट्यूबों में स्थानांतरित करें जिसमें एंजामेटिक सॉल्यूशन के 15-25 mL #2 और एक कक्षीय शेखर (130 आरपीएम, 37 डिग्री सेल्सियस, रातोंरात) पर इनक्यूबेट शामिल हैं।
  3. 3 दिन: Delipidation
    1. एक कक्षीय शेखर (130 आरपीएम, 37 डिग्री सेल्सियस, 20 00 00 धोने) पर रिनसिंग बफर सॉल्यूशन के 15-25 mL के साथ नमूने 3x धोएं। प्रत्येक धोने के बाद रिंसिंग बफर सॉल्यूशन डालें।
    2. नमूनों को ताजा 50 मीटर शंकुत्मक ट्यूबों में स्थानांतरित करें जिसमें ध्रुवीय सॉल्वेंट निष्कर्षण समाधान के 15-25 मीटर होते हैं और एक कक्षीय शेखर (130 आरपीएम, 25 डिग्री सेल्सियस, रात भर) पर इनक्यूबेट करते हैं। इस कदम के बाद, लिपिड के बहुमत को हटा दिया जाना चाहिए, और नमूने सफेद या पारदर्शी रंग में होना चाहिए।
      सावधानी: ध्रुवीय विलायक निष्कर्षण समाधान ज्वलनशील है और इसे संग्रहित किया जाना चाहिए और 25 डिग्री सेल्सियस पर उपयोग किया जाना चाहिए।
  4. 4 दिन: धोने और भंडारण
    1. नमूनों को रिंसिंग बफर सॉल्यूशन के 15-25 मीटर युक्त ताजा 50 एमएल शंकुवर्ती ट्यूबों में स्थानांतरित करें। एक कक्षीय शेखर (130 आरपीएम, 37 डिग्री सेल्सियस, 20 00 00 प्रत्येक धोने) पर नमूने धोएं।
    2. एक कक्षीय शेखर (130 आरपीएम, 37 डिग्री सेल्सियस, 20 00 00 धोने) पर 70% इथेनॉल के 15-25 mL के साथ नमूने धोएं प्रत्येक धोने के बाद 70% इथेनॉल समाधान डाल दें।
    3. एक कक्षीय शेखर (130 आरपीएम, 37 डिग्री सेल्सियस, 20 00 प्रत्येक धोने) पर भंडारण समाधान के साथ एक बार नमूने धोएं।
    4. बाँझ संदंश का उपयोग करना, भंडारण समाधान के 15-25 mL युक्त ताजा 50 mL शंकुट्यूब के लिए नमूने हस्तांतरण। सुनिश्चित करें कि नमूनों को पूरी तरह से विसर्जित करने के लिए पर्याप्त भंडारण समाधान का उपयोग किया जाता है। 1 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

7. ईसीएम-आदिपोसाइट तैयारी

  1. स्थानांतरण बाँझ संदंश का उपयोग कर 24 अच्छी तरह से थाली के व्यक्तिगत कुओं के लिए ईसीएम टुकड़े संग्रहीत । डुप्लिकेट या ट्रिपलिकेट्स सहित, योजनाबद्ध डाउनस्ट्रीम परख (जैसे, ग्लूकोज तेज या लिपॉलीसिस, नीचे देखें) के लिए आवश्यक कई कुओं में कई ईसीएम टुकड़े जोड़ें। एक कक्षीय शेखर (130 आरपीएम, 37 डिग्री सेल्सियस, 20 00 00 धोने) पर 70% इथेनॉल 3x के 500 माइक्रोन के साथ धोएं।
  2. एक कक्षीय शेखर (130 आरपीएम, 37 डिग्री सेल्सियस, 20 मिन प्रत्येक धोने) पर बाँझ 1x पीबीएस में 3x धोकर रिहाइड्रेट ईसीएम।
  3. बाँझ कैंची का उपयोग करना, कट और 100 मिलीग्राम टुकड़ों में ECM वजन। बाँझ संदंश का उपयोग करना, एक 24 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में १ १०० मिलीग्राम टुकड़ा जगह है । अतिरिक्त पीबीएस को टुकड़ों से बाहर निकलने की अनुमति देने के लिए 15 वर्ष के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। ध्यान से एक पिपेट के साथ किसी भी अतिरिक्त पीबीएस को हटा दें।
  4. प्रत्येक 100 मिलीग्राम ईसीएम टुकड़ा पीरीडीपोसाइट सेल निलंबन (प्रति एमएल 3 मिलियन कोशिकाओं, 6 x 104 कोशिकाओं प्रति 20 μL, 15% FBS-DMEM/F12 में, कदम 5.10 से) के साथ बीज। कोशिकाओं को सीधे ईसीएम में पिपेट करके ईसीएम में पिपेट करें और धीरे-धीरे कोशिका निलंबन को मैट्रिक्स के केंद्र में निष्कासित कर दें, यह देखते हुए कि सेल निलंबन ओवरफ्लो न हो और कुएं के नीचे खत्म हो जाए।
    1. यदि सेल निलंबन ईसीएम से बह निकला है जहां पिपेट टिप रखी गई है, तो उस स्थान से टिप निकालें और ईसीएम में कहीं और डालें। इनक्यूबेट वरीयता प्राप्त ईसीएम 40 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर।
      नोट: क्यूआरटीपीसीआर के लिए आरएनए निष्कर्षण के लिए, प्रत्येक 500 मिलीग्राम ईसीएम टुकड़ों को 100 माइक्रोन में 3 x 105 कोशिकाओं (3 मिलियन कोशिकाओं प्रति एमआईएल, यानी 3 x 105 कोशिकाओं प्रति 100 माइक्रोनएल, 15% एफबीएस-डीएमईएम/एफ12) में बीज करें।
  5. वरीयता प्राप्त ईसीएम टुकड़ों को कवर करने के लिए विकास मीडिया के 500 माइक्रोन के साथ 24-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं को भरें। संस्कृति 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर 72 घंटे के लिए।
  6. ७२ एच के बाद, ध्यान से aspirate 15% FBS-DMEM/F12, थाली थोड़ा झुकाव के लिए टुकड़ा नीचे पूल के लिए मीडिया की अनुमति है, और सिर्फ यह परेशान किए बिना ECM टुकड़ा के निकट पिपेट टिप रख । aspirating के बाद, भेदभाव मीडिया के ५०० μL जोड़ें, मीडिया बदलने हर 2-3 दिनों में एक समान तकनीक का उपयोग कर, 14 दिनों की कुल संस्कृति अवधि के लिए ।
    1. प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग करभेदभाव की जांच करें: कोशिकाएं लिपिड जमा करेंगी, भूरे-पीले रंग में और आकार में अधिक गोलाकार हो जाएंगी।
      नोट: वरीयता प्राप्त मैट्रिस का उपयोग मेटाबोलिक परीक्षण (जैसे, ग्लूकोज तेज परख, लिपोलिसिस परख, ओआरओ), हिस्टोलॉजी या इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी), या मानक ऊतक इमेजिंग के लिए किया जा सकता है। फिक्स्ड टिश्यू ओआरओ धुंधला और इमेजिंग के लिए, तरल नाइट्रोजन में ईसीएम-आदिपोसाइट नमूनों को फ्रीज करें।

8. मेटाबोलिक फेनोटाइपिंग

  1. स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी
    1. सोरेनसेन के फॉस्फेट बफर में 2.5% ग्लूटाराल्डिहाइड में 12 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर नमूने फिक्स करें। 1 घंटे के लिए सोरेनसेन के फॉस्फेट बफर में 1% ऑस्मियम टेट्राऑक्साइड में पोस्टफिक्स करें।
    2. इथेनॉल में नमूनों को क्रमिक रूप से निर्जलित करें। हैक्थेल्डीलिज़ान में धोएं, और हवा-सूखी। फिर कोलॉयडल ग्रेफाइट के साथ स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी स्टब पर माउंट करें। सोने के साथ सूखा, और स्पंदन-कोट।
    3. स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के साथ छवियों को कैप्चर करें।
  2. तेल लाल-ओ धुंधला
    1. लाइव ऊतक: तेल लाल-ओ समाधान
      1. ध्यान से एक पिपेट के साथ कुओं से एस्पिरेट मीडिया। फिर प्रति अच्छी तरह से 1x पीबीएस के 500 माइक्रोन के साथ एक बार नमूने धोएं।
      2. 15 मिन के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ deionized एच2O में 4% फॉर्मलिन के 200 माइक्रोन के साथ नमूने फिक्स करें। 1x पीबीएस (500 माइक्रोन प्रत्येक धोने) के साथ दो बार नमूने धोएं।
      3. 5 मिन के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर 60% आइसोप्रोपेनॉल के नमूने के 200 माइक्रोन जोड़ें। एस्पिरेट 60% आइसोप्रोपेनॉल एक पिपेट के साथ।
      4. 5 मिन के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर तेल रेड-ओ वर्किंग सॉल्यूशन के साथ दाग के नमूने। 1x पीबीएस (500 माइक्रोन प्रत्येक वॉश) के साथ 3x के नमूने धोएं। फिर एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के साथ छवि।
    2. फिक्स्ड ऊतक: तेल लाल-ओ दाग किट
      1. फ्लैश-फ्रीज ईसीएम-एडिपोसाइट नमूने इष्टतम काटने के तापमान (OCT) यौगिक और अनुभाग (5 μm) में एक क्रायोस्टेट पर।
      2. 2 मिन के लिए DI/H2O में 85% प्रोपलीन ग्लाइकोल में स्लाइड रखें। 6 मिन के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर ओआरओ दाग में स्लाइड रखें। 85% प्रोपेलिन ग्लाइकोल में 1 मिन के लिए डीआई/एच2ओ में स्टेह लिडे रखें। DI/H2O के साथ दो बार स्लाइड कुल्ला करें।
      3. स्लाइड में रखें 1 मिन के लिए ऑयल रेड-ओ धुंधला किट से मॉडिफाइड मेयर की हेमेटोक्सिलिन को नल के पानी से दो बार स्लाइड कुल्ला करें। DI/H2O के साथ दो बार स्लाइड कुल्ला ।
      4. माइक्रोस्कोप पर जलीय बढ़ते माध्यम और छवि का उपयोग करके कवरस्लिप को माउंट करें।
    3. क्यूआरटीपीसीआर के लिए ईसीएम से आरएनए निकालना
      नोट: आरएनए उपज को अधिकतम करने के लिए, 100 माइक्रोन में 3 x 105 प्रreadipocytes के साथ वरीयता प्राप्त 500 मिलीग्राम ईसीएम टुकड़ों का उपयोग करें और प्रति अच्छी तरह से विभेदन मीडिया के 3 मिलील में 6-अच्छी तरह प्लेटों में ऊपर के रूप में अंतर करें।
      1. एक बार विभेदित होने के बाद, प्रत्येक व्यक्ति ईसीएम-आदिपोसाइट नमूने को बाँझ संदंश का उपयोग करके बर्फ पर 50 मिलीएल शंकुई ट्यूब में स्थानांतरित करें।
      2. बफर आरएलटी के 500 माइक्रोन के साथ खाली अच्छी तरह से धोलें। ईसीएम-आदिपोसाइट नमूने के मिलान के साथ 50 मीटर शंकुई ट्यूब पर बफर आरएलटी जोड़ें।
      3. बाँझ कैंची का उपयोग करना, पतले ५० mL शंकुट्यूब के भीतर प्रत्येक ECM-adipocyte नमूना कीमा, जबकि बर्फ पर ट्यूब पकड़े, शंकु ट्यूब में कैंची डालने के लिए ऊतक कीमा ।
      4. शंकुट्यूब को पूरी तरह से फ्रीज करें और गल जाएं -80 डिग्री सेल्सियस से 37 डिग्री सेल्सियस 3x तक।
      5. 500 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र शंकुई ट्यूब और 10 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस।
      6. ध्यान से एक पिपेट के साथ अधिनेत को हटा दें और रेशेदार ऊतक आरएनए निष्कर्षण किट(सामग्री की तालिका)के साथ आरएनए निष्कर्षण के लिए उपयोग करें।
  3. ग्लूकोज तेज परख
    1. ऊपर वर्णित (धारा 5) के अनुसार 24-अच्छी प्लेटों में भेदभाव माध्यम के 0.5 मिलीग्राम टुकड़ों में 100 मिलीग्राम ईसीएम टुकड़ों में 6 x 104 preadipocytes अंतर करें।
    2. 14 दिनों के भेदभाव के बाद, मीडियम को हटा दें और 1x पीबीएस के साथ एक बार ईसीएम-एडिपोसाइट्स को धो लें। 0.5 मिली/अच्छी तरह सीरम भुखमरी मध्यम और संस्कृति को 37 डिग्री सेल्सियस और 12 घंटे के लिए 5% सीओ2 जोड़ें।
    3. 1x पीबीएस के साथ दो बार मध्यम और धोने की कोशिकाओं को हटा दें। पीबीएस और कल्चर में 05 मिली/वेल 2% बीएसए को 37 डिग्री सेल्सियस और 2 घंटे के लिए 5% सीओ2 जोड़ें।
    4. 1x पीबीएस के साथ एक बार कोशिकाओं को धोएं, 200 एनएम इंसुलिन के साथ या बिना 0.5 mL/अच्छी तरह से 1x पीबीएस जोड़ें, और 40 00 00 के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    5. एस्पिरेट 1x पीबीएस, 0.1 mM 2-deoxy-D-ग्लूकोज, 2 μCi/mL deoxy-D-ग्लूकोज, 2-[1,2-3 एच (एन)], के साथ या बिना 200 एनएम इंसुलिन के साथ 0.5 mL/अच्छी तरह से 1X पीबीएस जोड़ें, और 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबट और 40 00 00 के लिए 5% सीओ2 का उपयोग करें। रेडियोधर्मी अभिकर्मकों और अपशिष्ट, जैसा कि स्थानीय संस्थागत नियामक विधियों द्वारा अधिदेशित है।
    6. 1x पीबीएस के साथ एक पिपेट और वॉश सेल 3x के साथ मध्यम निकालें। DI/H2O में 1% एसडीएस समाधान के ४२० μL जोड़ें, और जोरदार पाइपिंग के साथ lyse कोशिकाओं । 10 मिन के लिए 25 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेट।
    7. ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से 5 μL लीजिए । शेष कोशिका के 400 माइक्रोन को प्रस्फुटन शीशी में प्रस्फुटन तरल पदार्थ के 2 एल में स्थानांतरित करें। प्रस्फुटन काउंटर पर 3एच-2डीजी गतिविधि की गणना करें। प्रोटीन, एमजी/एमएल को सामान्यीकृत प्रति मिनट गिनती के रूप में डेटा का विश्लेषण करें।
  4. लिपोलिसिस परख
    1. ऊपर वर्णित 24-अच्छी प्लेटों में मानव भेदभाव माध्यम के 0.5 मिलीग्राम टुकड़ों में 100 मिलीग्राम ईसीएम टुकड़ों में 6 x 104 preadipocytes अंतर करें।
    2. भेदभाव के 14 दिनों के बाद, गर्म 1x पीबीएस के साथ दो बार मध्यम और धोने की कोशिकाओं को हटा दें। सीरम भुखमरी माध्यम (इंसुलिन के बिना) के साथ या 3 μM आइसोप्रोटेरोनॉल के बिना, और संस्कृति एडीपोसाइट्स के साथ 37 डिग्री सेल्सियस और 72 घंटे के लिए 5% सीओ2 के 0.5 मिलील जोड़ें।
    3. संस्कृति supernatants, जो परख के लिए तैयार होने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है ले लीजिए। डेटा सामान्यीकरण के लिए डीएनए क्वांटिटाइजेशन के लिए माइक्रोसेन्ट्रिफ्यूज ट्यूब में ईसीएम एकत्र करें।
    4. प्रत्येक सुपरनेटेंट का पिपेट 2 माइक्रोप्लेट में। ट्राइग्लिसराइड निर्धारण किट में प्रदान किए गए रिक्त स्थानों (आसुत एच2ओ) और ग्लाइसेरोल मानक समाधान के लिए आरक्षित कुएं।
    5. प्रत्येक अच्छी तरह से ट्राइग्लिसराइड दृढ़ संकल्प किट से मुफ्त ग्लाइसेरोल रिएजेंट के 270 μL जोड़ें, मिश्रण करने के लिए पिपेट। 5 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट प्लेट।
    6. माइक्रोप्लेट स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर 540 एनएम पर अवशोषण को मापें।
    7. ग्लाइसेरोल की एकाग्रता की गणना करें और ईसीएम से डीएनए के साथ सामान्य करें:

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

एडिपोज ऊतक ईसीएम की तैयारी, प्रreadipocytes के साथ सीडिंग, और परिपक्व आदिपोसाइट्स में विट्रो विभेदन ऊतक में स्पष्ट अनुक्रमिक रूपात्मक परिवर्तन करता है जो पूरे प्रोटोकॉल में प्रगति के दृश्य मूल्यांकन की अनुमति देता है(चित्रा 1) . ईसीएम को बीज देने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रreadipocytes अलग-अलग वैट नमूनों(चित्र ा 2)से कोलेजेनेज पाचन का उपयोग करके अलग-थलग कर दिए जाते हैं। प्रसंस्करण के प्रत्येक चरण में ईसीएम-एडिपोसाइट निर्माण की इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी स्कैन करना ईसीएम के विकोशियीकरण और बाद में रीसीडिंग और भेदभाव(चित्रा 3)पर लिपिड युक्त एडीपोसाइट्स के पुनर्केशिकाकरण का पता चलता है। कोलेजन 1-विकोशियत ईसीएम के विशिष्ट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री कोलेजन माइक्रोआर्किटेक्चर के रखरखाव का पता चलता है, जबकि लाइव और फिक्स्ड/सेक्शन्ड 3डी ईसीएम-एडिपोसाइट निर्माण के तेल लाल-ओ धुंधला लिपिड युक्त एडीपोसाइट्स(चित्रा 4) से पता चलता है ए)ईसीएम में विभेदित एडीपोसाइट्स से क्यूआरटीपीसीआर ईसीएम(चित्र4बी)में सुसंस्कृत अविभेदित प्रreadipocytes के सापेक्ष आदिपोजेनिक जीन के चिह्नित अपरेगुलेशन को दर्शाता है । ईसीएम-एडिपोसाइट का मेटाबोलिक फेनोटाइपिंग मधुमेह (डीएम) और गैर-मधुमेह (एनडीएम) विषयों से ईसीएम और एडीपोसाइट्स के सभी संयोजनों का अध्ययन करते हैं, जो डीएनएम के सापेक्ष डीएम से ईसीएम-आदिपोसाइट में बिगड़ा ग्लूकोज तेज और लिपॉलीटिक फंक्शन का निर्माण करते हैं ऊतकों, डीएम-विशिष्ट मेटाबोलिक दोषों को संक्षिप्त करना जो हमने पहले मानक 2डी संस्कृति11में मानव आदिपोसाइट्स में रिपोर्ट किए हैं। महत्वपूर्ण बात, एनडीएम ईसीएम डीएम आदिपोसाइट्स(चित्रा 4सी)11में इंसुलिन से उत्तेजित ग्लूकोज तेज और लिपॉलीटिक क्षमता को बचाता है। एक साथ, ये डेटा ईसीएम द्वारा आदिपोसाइट सेलुलर चयापचय के रोग-विशिष्ट विनियमन को प्रदर्शित करते हैं। अधिक जानकारी बेकर एट अल11में सूचित कर रहे हैं ।

Figure 1
चित्रा 1: ईसीएम-आदिपोसाइट तैयारी के लिए कार्यप्रवाह। 1 दिन: पूरे आंत एडीपोज ऊतक के नमूने तीन फ्रीज-गल चक्र से गुजरना चारों ओर से एंजाइमैटिक पाचन समाधान के साथ रात भर ऊष्मायन के बाद #1। 2 दिन: एंजाइमैटिक समाधान #1 के साथ पाचन के बाद, नमूने #2 एंजाइमैटिक पाचन समाधान के साथ रातोंरात पचा रहे हैं। इस बिंदु पर, नमूने आंशिक रूप से बेसुध हो जाएंगे। 3 दिन: #2 एंजाइमैटिक पाचन के बाद, नमूने ध्रुवीय विलायक निष्कर्षण समाधान के साथ रात भर ऊष्मायन से गुजरते हैं, जो delipidation को पूरा करेगा। 3 दिन के बाद, नमूनों को पूरी तरह से बेसुध और सफेद/रंग में पारदर्शी होना चाहिए । नमूनों को rinsing बफर समाधान के साथ अच्छी तरह से धोया जाता है तो 70% इथेनॉल और 40 डिग्री सेल्सियस में भंडारण समाधान में संग्रहीत जब तक preadipocytes के साथ पुनर्बीज के लिए तैयार है। 4 दिन: Preadipocytes को विसेलुलर वैट में वरीयता दी जाती है और उसके बाद 14 दिनों के लिए एडीपोजेनिक भेदभाव होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: प्रreadipocyte अलगाव के लिए कार्यप्रवाह। वैट कीमा बनाया हुआ है, कोलेजेनेस, फ़िल्टर, सेंट्रलिफ्यूज, और परिणामी स्ट्रोमोवैस्कुलर सेल गोली चढ़ाया और प्रreadipocytes का विस्तार करने के लिए सुसंस्कृत के साथ पचा। मानव preadipocyte अलगाव और 2D आदिपोसाइट संस्कृति के बारे में अधिक जानकारी के लिए बेकर एट अल २०१७21 देखें । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवियां। बरकरार एडीपोज ऊतक, डिसेलुलर एडीपोज ऊतक, और डिसेलुलर एडीपोज ऊतक को फिर से पॉप्युलेट किया जाता है और 14 दिनों के लिए आदिपोजेनिक मीडिया में अंतर किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: ईसीएम में आदिपोसाइट्स का लक्षण वर्णन। (A)विसेलुलरएडी एडीपोज ऊतक ईसीएम माइक्रोआर्किटेक्चर को बनाए रखता है और एडीपोसाइट भेदभाव का समर्थन करता है: शीर्ष: कोलेजन 1 इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री से पहले और बाद में पूरे मानव वैट के रखरखाव का प्रदर्शन माइक्रोआर्किटेक्चर; मध्य: ईसीएम के भीतर लाइव मानव एडीपोसाइट्स के 3डी कॉन्फोकल फोटोमाइक्रोग्राफ; पेरिपोसाइट्स के साथ रीसीडिंग से पहले तेल रेड-ओ के साथ बरकरार मानव वैट, सीडिंग के 4 दिन बाद, और एडिपोजेनिक भेदभाव के बाद प्रreadipocytes के साथ सीडिंग के 14 दिनों के बाद; नीला: सेल नाभिक का डीपीआई धुंधला; लाल: तेल लाल-ओ इंट्रासेलुलर लिपिड के धुंधला; नीचे: फॉर्मेलिन-फिक्स्ड, पैराफिन-एम्बेडेड, 5 माइक्रोन सेक्शनेड, तेल रेड-ओ-दाग मानव वैट को कोशिकीपीकरण से तुरंत पहले, विसेलुलराइजेशन के तुरंत बाद, और विसेलुलराइजेशन, परिशिणीकरण, परिशिण-सीडिंग, और 14 दिनों के आदिपोजेनिक भेदभाव के बाद, ईसीएम के भीतर आदिपोसाइट्स में साइटोप्लाज्मिक लिपिड संचय का प्रदर्शन। (ख)ईसीएम में एडीपोसाइट्स ने एडिपोजेनिक जीन अभिव्यक्ति को बढ़ावा दिया: क्यूआरटीपीसीआर विश्लेषण वैट ईसीएम में अविभेदित प्रांडिओसाइट्स के सापेक्ष 14 दिनों के लिए वैट ईसीएम में अंतर से आरएनए में एडीपोजेनिक जीन ट्रांसक्रिप्ट के स्तर की तुलना करता है गैर-दिपोजेनिक मीडिया में 72 घंटे के लिए सुसंस्कृत। डेटा का मतलब है ± एसईएम. ACLY:एटीपी साइटेट lyase, ATGL:adipose ट्राइग्लिसराइड लिपेस, FASN:फैटी एसिड सिंथाज, पीपीआरजी:पेरिक्सिसोम प्रोलिफेरेटिव एक्टिवेटेड रिसेप्टर गामा; ऑर्डिनेट: अविभेदित प्रreadipocyte रेफरेंंट = 1 के सापेक्ष परिपक्व आदिपोसाइट्स में ट्रांसक्रिप्ट स्तर में गुना अंतर; सभी गुना मतभेद महत्वपूर्ण (पीएंडएलटी;0.001, बनती टी-टेस्ट); एन=11 विषयों से 10 विषयों से ईसीएम, पीरीडीपोसाइट्स/एडपोसाइट्स । (ग)ईसीएम डीएम-विशिष्ट तरीके से एडिपोसाइट मेटाबोलिज्म को नियंत्रित करता है: डीएम या एनडीएम विषयों से 3डी-ईसीएम, डीएम या एनडीएम विषयों से प्रreadipocytes के साथ वरीयता प्राप्त, आदिपोसाइट्स में अंतर, और मेटाबोलिक फेनोटाइपिंग के साथ अध्ययन किया । ईसीएम और एडिपोसाइट्स (ईसीएम/एडी) के रोगी स्रोत (एनडीएम, डीएम) के साथ लेबल किए गए डेटा बार; उदाहरण के लिए, एनडीएम/एनडीएम ने एनडीएम रोगियों से प्राप्त ईसीएम और प्रreadipocytes दोनों को दर्शाता है, जबकि एनडीएम/डीएम डीएम रोगियों से preadipocytes के साथ संयुक्त एनडीएम रोगियों से ईसीएम को दर्शाता है । डेटा का मतलब है ± एसईएम. ऑर्डिनेट्स: ग्लूकोज तेज (सीपीएम), ईसीएम/सेल लाइसेट प्रोटीन एकाग्रता (मिलीग्राम/एमएल) को सामान्यीकृत; लिपोलिसिस: संस्कृति सुपरनेट ग्लाइसेरोल एकाग्रता (मिलीग्राम/mL) को ईसीएम/सेल लाइसेट डीएनए एकाग्रता (एनजी/एमएल) के लिए सामान्यीकृत किया गया; * पीएंडएलटी;0.050, **p<0.100 ने संकेतित डेटा-पॉइंट की तुलना इसी डेटा-पॉइंट (ग्लूकोज तेज के लिए बेसल या इंसुलिन-उत्तेजित, बेसल या आइसोप्रोटेरोनॉल-लिपोलिसिस के लिए उत्तेजित) डीएम/डीएम आर्म में, मिश्रित मॉडल विश्लेषण का उपयोग करके दोहराया उपाय; एन = 9 एनडीएम, 8 डीएम विषयों, 10 एनडीएम से preadipocytes से ईसीएम, ग्लूकोज तेज के लिए 9 डीएम विषय; 6 एनडीएम से ईसीएम, 6 डीएम विषय, 6 एनडीएम से प्रांडिसिट्स, लिपोलिसिस के लिए 6 डीएम विषय। इस आंकड़े को ओ ' राउर्क और लुमेंग11से अनुकूलित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ईसीएम-एडिपोसाइट संस्कृति मॉडल अंतिम ऊतक फेनोटाइप को हुक्म देने में ईसीएम और कोशिकाओं की व्यक्तिगत भूमिकाओं को विच्छेदन करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण प्रदान करता है। ईसीएम आइसोलेशन प्रोटोकॉल काफी प्रजनन योग्य है, लेकिन विसेलुलराइजेशन प्रक्रिया में परिवर्तनशीलता देखी जा सकती है। दिन 3 delipidation कदम प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण बिंदु है । रात भर निष्कर्षण के पूरा होने पर, मैट्रिक्स के delipidation ध्रुवीय विलायक समाधान पीले रंग की ओर मुड़ने का सबूत होना चाहिए, जबकि मैट्रिक्स को बरकरार एडीपोज ऊतक की पीले-नारंगी रंग की विशेषता से पारदर्शी// सफेद(चित्रा 1)। यदि ये रंग परिवर्तन नहीं होते हैं, तो delipidation पूरा नहीं होने की संभावना है। delipidation दक्षता में अंतर रोगी परिवर्तनशीलता आम है, लेकिन आज तक हम विषय डीएम स्थिति, उंर, बीएमआई, या अंय नैदानिक चर के साथ delipidation की दक्षता के किसी भी संबंध नहीं देखा है । बड़े नमूने (20 ग्राम से अधिक) कुशल delipidation से गुजरना नहीं होगा; प्रसंस्करण के नमूनों और एलटी; 20 ग्राम इस समस्या को रोक सकता है। यदि कोई नमूना 3 दिन के बाद पूरी तरह से बेसुध दिखाई नहीं देता है, तो नमूने को बाँझ कैंची के साथ आधे में विभाजित करें, फिर नमूने को ध्रुवीय सॉल्वेंट निष्कर्षण समाधान के ताजा 15-20 मीटर में स्थानांतरित करें और 3-5 घंटे के लिए कक्षीय शेखर पर रखें। कुछ नमूने ध्रुवीय विलायक निष्कर्षण कदम दोहराने के बाद पूरी तरह से विकोशिय नहीं हो सकते हैं। यदि अधिकांश नमूने को विसेसेलुलाकृत किया जाता है, तो प्रयोगों में नमूने का उपयोग करने से पहले लिपिड युक्त वर्गों को काटना संभव है।

संदूषण हो सकता है अगर बंध्यता पूरी प्रक्रिया में लगन से बनाए नहीं रखा जाता है। सभी काम मानक सेल संस्कृति सावधानियों का उपयोग कर एक टुकड़े टुकड़े में किया जाना चाहिए। हम आम तौर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 महीने तक ईसीएम स्टोर करते हैं, और तरल नाइट्रोजन में 6 महीने तक के लिए preadipocytes। इस समय से परे जैव कार्यक्षमता और रोग और डिपो-विशिष्ट गुणों की अवधारण का परीक्षण नहीं किया गया है ।

कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी ईसीएम के भीतर परिपक्व आदिपोसाइट्स के दृश्य की अनुमति देती है, जिसे तेल लाल-ओ धुंधला के साथ बढ़ाया जा सकता है। स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) ईसीएम के भीतर एडीपोसाइट्स की कल्पना करने के लिए एक गैर-मात्रात्मक विधि भी प्रदान करता है। नोट की, एसईएम और ऑयल रेड-ओ धुंधला ईसीएम-एडिपोसाइट निर्माण में एकात्मक एडीपोसाइट्स का सुझाव देते हैं, एक आकृति विज्ञान जो वीवो आदिपोसाइट्स में समान है और विशिष्ट मल्टीलोकुलर आदिपोसाइट्स के विपरीत देखा जाता है जब preadipocytes आदिजेनिक से गुजरते हैं 2D प्लास्टिक पर भेदभाव(चित्रा 3, चित्रा 4ए)। इस अवलोकन से पता चलता है कि ईसीएम प्लास्टिक पर मानक ऊतक संस्कृति की तुलना में आदिजनीय भेदभाव के लिए अधिक शारीरिक वातावरण प्रदान करता है। ईसीएम-एडिपोसाइट निर्माण का निर्धारण और अनुभागीकरण मुश्किल हो सकता है, क्योंकि अक्टूबर-एम्बेडेड निर्माण नाजुक होते हैं और आसानी से अनुभाग नहीं करते हैं। -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से भंडारण से हटाने के तुरंत बाद एम्बेडेड ऊतकों को अनुभागित करना और एक पूर्व-ठंडा क्रायोस्टैट पर कोल्ड-रूम (4 डिग्री सेल्सियस) में अनुभागकरना अनुभागकरना अनुभागकरना संभव बनाता है।

ईसीएम-एडिपोसाइट संस्कृति एक शारीरिक वातावरण प्रदान करती है जो विवो में ऊतक पर्यावरण का अनुमान लगाता है और एडिपोजेनिक जीन के अपरेगुलेशन से प्रमाणित रूप से पेडिपोसाइट स्टेम सेल विकास और भेदभाव के लिए एक टिकाऊ वातावरण प्रदान करता है 3डी-ईसीएम-आदिपोसाइट संस्कृति में। ईसीएम-एडिपोसाइट संस्कृतियां ग्लूकोज तेज और लिपोलिसिस8सहित आदिपोसाइट मेटाबोलिक कार्यों में भी संलग्न हैं। हम सीपीएम के रूप में ग्लूकोज तेज रिपोर्ट या तो कुल ईसीएम से निकाले गए प्रोटीन के लिए सामान्यीकृत-adipocyte संस्कृतियों एक ब्रैडफोर्ड परख के साथ मापा, या डीएनए एक डीएनए परख किट के साथ मापा सामग्री के लिए, और दोनों तरीकों के साथ इसी तरह के परिणाम मनाया है । इसी प्रकार, हम लिपोलिसिस की रिपोर्ट करते हैं क्योंकि ग्लिसरोल रिलीज के एमजी/एमएल को या तो प्रोटीन या डीएनए के लिए सामान्यीकृत किया जाता है, साथ ही सामान्यीकरण विधि के साथ प्राप्त समान परिणाम भी होते हैं । अन्य लिपिड सामग्री के लिए आदिपोसाइट मेटाबोलिक डेटा को सामान्य बनाने का सुझाव देते हैं, लेकिन ईसीएम निर्माण से लिपिड को मज़बूती से निकालने के हमारे प्रयासों को आज तक असफल रहा है। ग्लूकोज तेज दर को समय की प्रति इकाई ग्लूकोज के मॉल के रूप में रिपोर्ट करना और लिपोलिसिस के रूप में ग्लाइसेरोल/फ्री फैटी एसिड प्रति यूनिट के मॉल अलग प्रयोगों के बीच अधिक सटीक तुलना की अनुमति दे सकते हैं । क्यूआरटीपीसीआर विश्लेषण के लिए ईसीएम से आरएनए का अलगाव 2डी संस्कृति में कोशिकाओं की तुलना में कम पैदावार की विशेषता है, लेकिन अधिक कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त बड़े ईसीएम टुकड़ों की तैयारी इस समस्या को दूर करती है, जैसा कि चरण 8.3.1 में वर्णित है। हमें पश्चिमी दाग विश्लेषण के लिए बरकरार फॉस्फोमोइटीज के साथ पर्याप्त मात्रा में अअपमानित प्रोटीन को अलग करने में कठिनाई का सामना करना पड़ा है, जो मॉडल की सीमा का प्रतिनिधित्व करता है ।

एडिपोस ऊतक और पीरीडीपोसाइट्स के साथ सीडिंग से ईसीएम को अलग करने के लिए इसी तरह की पद्धति पहले प्रकाशित की गई है, जिसमें यह सुझाव दिया गया है कि ईसीएम कैम्प एगोनिस्टों सहित एडीपोजेनिक विभेदन अनुपस्थित क्लासिक आदिजेनिक मध्यस्थों को बढ़ावा दे सकता है, इंसुलिन, और PPAR-agonists12,14. हमारा डेटा ईसीएम द्वारा सेलुलर मेटाबोलिज्म के रोग-विशिष्ट विनियमन को एडीपोज ऊतक में प्रदर्शित करने वाला पहला है, जिसमें उन तरीकों का उपयोग किया जाता है जिनमें एडिपोसाइट्स को क्लासिक आदिपोजेनिक विभेदन कारकों के साथ उत्तेजित किया जाता है11; आदिपोजेनिक उत्तेजनाओं के अभाव में इसी तरह के अध्ययन भविष्य के अनुसंधान का लक्ष्य हैं। दूसरों ने फेफड़ों केऊतकों सेअलग ईसीएम और कोशिकाओं का उपयोग करके इसी तरह की बीमारी-विशिष्ट ईसीएम-सेल क्रॉसटॉक का प्रदर्शन कियाहै। पेप्टाइड हाइड्रोगेल12में समरूप एडीपोस ऊतक ईसीएम तैयारियों को मिलाकर मैट्रिस का निर्माण करने सहित वैकल्पिक रणनीतियों को भी नियोजित किया गया है।

जबकि मानव आदिपोसाइट सेलुलर चयापचय में अंतर रोगी परिवर्तनशीलता 2डी-प्लास्टिक और 3डी-ईसीएम संस्कृति दोनों में देखी जाती है, जब कुल मिलाकर विश्लेषण किया जाता है, तो ये कोशिकाएं सेलुलर मेटाबोलिज्म में रोग प्रकट होती हैं-, डिपो और सेक्स-विशिष्ट अंतर, जैसा कि वर्णित है हमारे समूह और अन्य11,21,22,23,24,आदिपोसाइट सेलुलर चयापचय के अध्ययन के लिए इन संस्कृति मॉडलों की उपयोगिता और सामान्यता को मान्य करते हैं। हमने यह प्रदशत किया है कि एडिपोसाइट्स रोग-मिलान ईसीएम (यानी, एनडीएम ईसीएम में एनडीएम आदिपोसाइट्स, डीएम ईसीएम में डीएम आदिपोसाइट्स) मानक 2डी संस्कृति में अलग-थलग एनडीएम और डीएम आदिपादों के मेटाबोलिक फेनोटाइप को संक्षिप्त करें, ईसीएम-आदिपोसाइट संस्कृति का समर्थन करते हैं अधिक शारीरिक वातावरण में आदिपोसाइट सेलुलर मेटाबोलिज्म में रोग-विशिष्ट परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल। हमने ग्लूकोज तेज या लिपोलिसिस सहित मेटाबोलिक कार्यों की परिमाण या दिशा में अंतर नहीं देखा है, जब उसी या विभिन्न दानदाताओं से ईसीएम और आदिपोसाइट्स का अध्ययन किया जाता है। किसी भी मामले में, ईसीएम-आदिपोसाइट प्रकट डीएम-विशिष्ट मेटाबोलिक फेनोटाइप (उदाहरण के लिए, डीएम/डीएम में एनडीएम/एनडीएम निर्माण के सापेक्ष जीयू में कमी) का निर्माण करता है, जिसमें ईसीएम और एडीपोसाइट्स के समान या विभिन्न दानदाताओं से शामिल निर्माणों की तुलना करते समय कोई स्पष्ट अंतर नहीं है .

ईसीएम-आदिपोसाइट संस्कृति अलग रोगी आबादी और ऊतक डिपो से ईसीएम और preadipocytes के संयोजन के अध्ययन की अनुमति देता है, रोग के विश्लेषण की अनुमति-और डिपो-ईसीएम और आदिपोसाइट्स के विशिष्ट योगदान परम एडीपोज ऊतक मेटाबोलिक Phenotype. ईसीएम-एडिपोसाइट संस्कृति मॉडल की इस ताकत का प्रदर्शन करते हुए हमने दिखाया है कि एनडीएम टिश्यू से ईसीएम में डीएम आदिपोसाइट्स(चित्रा 4सी)11में मेटाबोलिक दोषों को बचाने की क्षमता है । मूत्र आंत और चमड़े के नीचे एडीपोज ऊतकों में प्रारंभिक डेटा का सुझाव है कि murine ECM एक डिपो विशिष्ट तरीके से इसी तरह मूत्र एडीपोसाइट चयापचय को नियंत्रित करता है (अप्रकाशित डेटा, O' Rourke RW, २०१९), सुझाव है कि इस मॉडल प्रणाली का उपयोग अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है मूत्र और मानव प्रणालियों दोनों में ईसीएम-एडिपोसाइट क्रॉसटॉक। इसके अलावा, यह मॉडल ईसीएम के अलग-थलग हेरफेर के अध्ययन को एडीपोज़ ऊतक फेनोटाइप को विनियमित करने के साधन के रूप में अनुमति देता है। ईसीएम का प्रारंभिक अध्ययन उन स्थितियों में माना जाता है जो विशेष रूप से ईसीएम को लक्षित ग्लाइसेशन को प्रेरित करते हैं, उदाहरण के लिए, सुझाव देते हैं कि ये संशोधन सेलुलर मेटाबोलिक फेनोटाइप कोशिकाओं को बाद में इलाज ईसीएम (अप्रकाशित डेटा, में वरीयता प्राप्त करते हैं ओ'राउर्क आरडब्ल्यू, 2019), एडिपोसाइट फेनोटाइप पर ईसीएम के लक्षित हेरफेर के प्रभावों के अध्ययन के लिए एक मॉडल प्रदान करता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखक कोई परस्पर विरोधी हितों की घोषणा करते हैं ।

Acknowledgments

हम अध्ययन समन्वय के साथ सहायता के लिए डेनिएल बर्जर, मर्लिन वुड्रफ, सिमोन कोरिया और रीठा गीस का शुक्रिया अदा करते हैं । एसईएम मिशिगन विश्वविद्यालय माइक्रोस्कोपी और छवि विश्लेषण प्रयोगशाला बायोमेडिकल रिसर्च कोर सुविधा द्वारा किया गया था। इस परियोजना को एनआईएच अनुदान R01DK097449 (RWO), R01DK115190 (RWO, द्वारा समर्थित किया गया था, सीएनएल), R01DK090262 (CNL), दिग्गजों मामलों योग्यता अनुदान I01CX001811 (RWO), पायलट और मिशिगन मधुमेह अनुसंधान केंद्र (NIH अनुदान P30-DK020572) (RWO), से व्यवहार्यता अनुदान दिग्गजों प्रशासन VISN 10 स्पार्क पायलट ग्रांट (RWO) । स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी मिशिगन विश्वविद्यालय माइक्रोस्कोपी और छवि विश्लेषण प्रयोगशाला बायोमेडिकल रिसर्च कोर सुविधा द्वारा प्रदर्शन किया। इस पांडुलिपि का चित्र4 मूल रूप से बेकर एट अल, जे क्लिन एंडो मेट 2017 में प्रकाशित किया गया था; मार्च 1;102 (3), 1032-1043 । दोई: 10.1210/jc.2016-2915, और ऑक्सफोर्ड यूनिवर्सिटी प्रेस [https://academic.oup.com/jcem/article/102/3/1032/2836329] की अनुमति से पुन: पेश किया गया है । इस सामग्री का पुन: उपयोग करने की अनुमति के लिए, कृपया http://global.oup.com/academic/rights पर जाएं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin-EDTA Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA Cat#25200056
1.5 mL cryovial tube Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA Cat#02-682-557
10% Neutral Buffered Formalin VWR International LLC., Radnor, PA, USA Cat#89370-094
100 µm nylon mesh filter Corning Inc., Corning, NY, USA Cat#352360
2-Deoxy-D-glucose Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA Cat#D8375
2 nM 3,3’,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt (T3) Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#T6397
24-well tissue culture plates VWR International LLC., Radnor, PA, USA Cat#10861-700
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#I5879
96-well tissue culture plates VWR International LLC., Radnor, PA, USA Cat#10861-666
Antibiotic-Antimycotic Solution (ABAM) Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA Cat#15240062
Biotin Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#B4639
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA Cat#A8806
Buffer RLT Qiagen, Hilden, Germany Cat#79216
Ciglitizone Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#C3974
Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]- PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA Cat#NET328A250UC
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type II-S Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#D4513
Dexamethasone Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#D4902
Dimethyl Sulfoxide Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA Cat#BP231 Flammable, caustic
Disodium EDTA Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA Cat#BP118
D-pantothenic acid hemicalcium salt Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#21210
Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12 Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA Cat#11320033
Ethanol Decon Labs, Inc., King of Prussia, PA, USA Cat#DSP-MD.43 Flammable
EVE Cell Counting Slides, NanoEnTek VWR International LLC., Radnor, PA, USA Cat#10027-446
Fetal bovine serum (FBS) Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA Cat#10437028
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA Cat#G5882 Caustic
Hexamethyldisalizane Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#440191 Flammable, caustic
Human insulin solution Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#I9278
Isopropanol Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA Cat#A415 Flammable
Isoproterenol Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA Cat#I5627 Flammable
KCl Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#S25484
KH2PO4 Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#P5655
Lipase from porcine pancreas, type VI-S Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#L0382
MgSO4*7H2O Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#230391
Na2HPO4 Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#S5136
NaCl Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#S3014
NaHCO3 Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA Cat#S233
NH4Cl Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA Cat#A661
Optimal cutting temperature (OCT) compound Agar Scientific, Ltd., Stansted, Essex, UK Cat# AGR1180
Oil Red-O Solution (ORO) Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA Cat#O1391
Oil Red-O Stain Kit American Master Tech Scientific Inc., Lodi, CA, USA Cat#KTORO-G
Osmium tetroxide Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#201030 Caustic
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#93482 Caustic
Phosphate Buffered Saline Solution (PBS) Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA Cat#SH3025601
Ribonuclease A from bovine pancreas, type III-A Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#R5125
RNAEasy Fibrous Tissue MiniKit Qiagen, Hilden, Germany Cat#74704
Scintillation Fluid Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA Cat#SX18
Scintillation Counter
Scissors, forceps, sterile
Sorensen's phosphate buffer Thomas Scientific, Inc., Swedesboro, NJ CAS #: 10049-21-5
T-150 culture flask VWR International LLC., Radnor, PA, USA Cat#10062-864
TaqMan Gene Expression Master Mix ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA Cat#4369016
Temperature-controlled orbital shaker
Tissue Homogenizer, BeadBug Microtube Homogenizer Benchmark Scientific Cat#D1030
Transferrin Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#T3309
Triglyceride Determination Kit Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA Cat#TR0100
Trypan blue stain, 0.4% VWR International LLC., Radnor, PA, USA Cat#10027-446
Type II collagenase Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA Cat#17101015
Whatman Reeve Angel filter paper, Grade 201, 150mm Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA Cat#WHA5201150

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123, 4195-4200 (2010).
  2. Berrier, A. L., Yamada, K. M. Cell-matrix adhesion. Journal of Cell Physiology. 213 (3), 565-573 (2007).
  3. Trayhurn, P. Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity. Physiology Reviews. 93 (1), 1-21 (2014).
  4. O'Rourke, R. W., Lumeng, C. N. Obesity heats up adipose tissue lymphocytes. Gastroenterology. 145 (2), 282-285 (2013).
  5. Engin, A. The Pathogenesis of Obesity-Associated Adipose Tissue Inflammation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 960. 960, 221-245 (2017).
  6. Dankel, S. N., et al. COL6A3 expression in adipocytes associates with insulin resistance and depends on PPARγ and adipocyte size. Obesity (Silver Spring). 22 (8), 1807-1813 (2014).
  7. Divoux, A., et al. Fibrosis in human adipose tissue: composition, distribution, and link with lipid metabolism and fat mass loss. Diabetes. 59, 2817-2825 (2010).
  8. Lackey, D. E., et al. Contributions of adipose tissue architectural and tensile properties toward defining healthy and unhealthy obesity. American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 306 (3), E233-E246 (2014).
  9. Muir, L. A., et al. Adipose tissue fibrosis, hypertrophy, and hyperplasia: correlations with diabetes in human obesity. Obesity (Silver Spring). 24 (3), 597-605 (2016).
  10. Spencer, M., et al. Adipose tissue macrophages in insulin-resistant subjects are associated with collagen VI and fibrosis and demonstrate alternative activation. American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 299 (6), E1016-E1027 (2010).
  11. Baker, N. A., et al. Diabetes-specific regulation of adipocyte metabolism by the adipose tissue extracellular matrix. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 102 (3), 1-12 (2017).
  12. Pellegrinelli, V., et al. Human adipocyte function is impacted by mechanical cues. Journal of Patholology. 233 (2), 183-195 (2014).
  13. Flynn, L. E. The use of decellularized adipose tissue to provide an inductive microenvironment for the adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells. Biomaterials. 31 (17), 4715-4724 (2010).
  14. Perea-Gil, I., et al. In vitro comparative study of two decellularization protocols in search of an optimal myocardial scaffold for recellularization. American Journal Translational Research. 7 (3), 558-573 (2015).
  15. Porzionato, A., et al. Decellularized omentum as novel biologic scaffold for reconstructive surgery and regenerative medicine. European Journal of Histochemistry. 57 (1), e4 (2013).
  16. Tebyanian, H., et al. A Comparative Study of Rat Lung Decellularization by Chemical Detergents for Lung Tissue Engineering. Open Access Macedonian Journal of Medical Sciences. 5 (7), 859-865 (2017).
  17. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  18. Wang, L., Johnson, J. A., Zhang, Q., Beahm, E. K. Combining decellularized human adipose tissue extracellular matrix and adipose-derived stem cells for adipose tissue engineering. Acta Biomaterials. 9 (11), 8921-8931 (2013).
  19. Booth, A. J., et al. Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 186 (9), 866-876 (2012).
  20. Parker, M. W., et al. Fibrotic extracellular matrix activates a profibrotic positive feedback loop. Journal of Clinical Investigation. 124 (4), 1622-1635 (2014).
  21. Baker, N. A., Muir, L. A., Lumeng, C. N., O'Rourke, R. W. Differentiation and Metabolic Interrogation of Human Adipocytes. Methods in Molecular Biology. 1566, 61-76 (2017).
  22. O'Rourke, R. W., et al. Hexosamine biosynthesis is a possible mechanism underlying hypoxia's effects on lipid metabolism in human adipocytes. PLoS One. 8 (8), e71165 (2013).
  23. Tchkonia, T., et al. Fat depot-specific characteristics are retained in strains derived from single human preadipocytes. Diabetes. 55 (9), 2571-2578 (2006).
  24. Tchoukalova, Y. D., et al. Sex- and depot-dependent differences in adipogenesis in normal-weight humans. Obesity (Silver Spring). 18 (10), 1875-1880 (2010).

Tags

बायोइंजीनियरिंग अंक 153 आदिपोसाइट एडीपोस ऊतक बाह्युशिएष्ठा मैट्रिक्स मधुमेह ग्लूकोज तेज मोटापा
मैट्रिक्स-सेल मेटाबोलिक क्रॉसटॉक का अध्ययन करने के लिए एक मानव 3 डी एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स-एडिपोसाइट संस्कृति मॉडल
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Flesher, C. G., Baker, N. A.,… More

Flesher, C. G., Baker, N. A., Strieder-Barboza, C., Polsinelli, D., Webster, P. J., Varban, O. A., Lumeng, C. N., O'Rourke, R. W. A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk. J. Vis. Exp. (153), e60486, doi:10.3791/60486 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter