Summary
Vi beskriver en 3D Human ekstracellulære Matrix-adipocyte in vitro kultur system som tillater Disseksjon av rollene til matrisen og adipocytter i å bidra til fettvev metabolske fenotype.
Abstract
Den ekstracellulære matrise (ECM) spiller en sentral rolle i å regulere vev homeostase, engasjere seg i crosstalk med celler og regulere flere aspekter av cellulære funksjon. ECM spiller en spesielt viktig rolle i fettvev funksjon i fedme, og endringer i fettvev ECM avsetning og sammensetning er forbundet med metabolsk sykdom hos mus og mennesker. Medgjørlig in vitro modeller som tillater Disseksjon av rollene til ECM og celler i å bidra til global vev fenotype er sparsom. Vi beskriver en roman 3D in vitro modell av menneskelig ECM-adipocyte kultur som tillater studier av de spesifikke rollene til ECM og adipocytter i regulering fettvev metabolsk fenotype. Humant fettvev er decellularized å isolere ECM, som senere repopulated med preadipocytes som deretter skilles innenfor ECM i modne adipocytter. Denne metoden skaper ECM-adipocyte konstruksjoner som er metabolically aktive og beholde egenskapene til vev og pasienter som de er avledet. Vi har brukt dette systemet til å demonstrere sykdoms spesifikk ECM-adipocyte crosstalk i humant fettvev. Denne kulturen modellen gir et verktøy for å dissekere rollene til ECM og adipocytter i å bidra til globale fettvev metabolske fenotype og tillatelser studie av rollen til ECM i regulering fettvev homeostase.
Introduction
Ekstracellulære matrise (ECM) gir ikke bare et mekanisk stillas for vev, men også engasjerer seg i komplekse crosstalk med celler som ligger innenfor det, regulere ulike prosesser som er nødvendige for vev homeostase, inkludert celle spredning, differensiering, signalering, og metabolisme1. Mens sunn ECM spiller en viktig rolle opprettholdelsen av normal vev funksjon, dysfunksjonelle ECM har vært innblandet i flere sykdommer2.
Fettvev spiller en viktig rolle i patogenesen av metabolsk sykdom. Fedme er forbundet med overdreven adipocyte hypertrofi og cellulær hypoksi, defekter i adipocyte cellulær metabolisme, og fettvev endoplasmatiske retikulum og oksidativt stress og betennelser. Mens dårlig forstått, disse komplekse prosesser konspirerer å svekke fettvev nærings buffer bufring kapasitet, noe som fører til næringsstoff overflyt fra fettvev, toksisitet i flere vev, og systemisk metabolsk sykdom3,4 ,5. Sekvensen av hendelser og spesifikke mekanismer som ligger til grunn fettvev svikt er dårlig forstått, men endringer i fettvev ECM har vært innblandet. ECM-sammensetningen er endret i fettvev i humant og murine fedme, med økt deponering av ECM-protein sammen med kvalitative biokjemiske og strukturelle forskjeller i fettvev ECM forbundet med menneskelig metabolsk sykdom, inkludert type 2 diabetes og hyperlipidemi6,7,8,9,10,11.
Til tross for disse observasjonene, er rollen av fettvev ECM i formidling fettvev dysfunksjon ikke veldefinert. Dette er delvis på grunn av mangel på medgjørlig eksperimentelle modeller som tillater Disseksjon av de spesifikke rollene til ECM og adipocytter i å regulere ultimate fettvev funksjon. ECM-adipocyte kultur simulerer bedre in vivo miljø av innfødte fettvev i minst to henseender. For det første gir ECM-kulturen et molekyl miljø som ligner på det innfødte fettvevet, inkludert innfødte kollagen, elastins og andre matrise proteiner fraværende i standard 2D-kultur. Dernest har kultur på 2D plast vist å endre adipocyte metabolisme via mekaniske effekter på grunn av redusert elastisitet av plast substrat12, som ECM-kultur eliminerer.
Metoder for å utvikle biologiske stillaser ved isolering av ECM fra decellularized fett og annet vev har blitt studert i sammenheng med regenererende og rekonstruktiv medisin og vev engineering13,14, 15,16,17,18. Vi har tidligere publisert metodikk der vi tilpasset disse metodene for å utvikle en in vitro 3D modell av menneskelig ECM-adipocyte kultur, ved hjelp av ECM og adipocyte stamceller (preadipocytes) avledet fra menneskelige visceral fettvev11. I denne artikkelen beskriver vi disse metodene i detalj. Den decellularization prosedyre for menneskelig fettvev er en fire-dagers prosess som innebærer mekaniske og enzymatisk behandlinger for å fjerne celler og lipid, etterlot seg en biologisk stillas som opprettholder egenskapene til vevet som det er avledet. Decellularized ECM støtter adipogenic differensiering av menneskelig preadipocytes, og når tilberedt med adipocytter, opprettholder mikroarkitektur og biokjemiske og sykdoms-spesifikke karakteristikker av intakt fettvev og engasjerer seg i metabolske funksjoner karakteristisk for innfødte fettvev. Denne matrisen kan bli studert alene eller reseeded med celler, tillater studier av interaksjoner og crosstalk mellom cellulære og ekstracellulære komponenter av fettvev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Fettvev er anskaffet fra menneskelige gjennomgår valgfag BARIATRIC kirurgi under institusjonelle gjennomgang styret godkjenning.
1. Preadipocyte isolasjon og kultur reagens forberedelse
- Forbered 2% storfe serum albumin (BSA) i 1x fosfat bufret saltvann oppløsning (PBS). Filteret steriliseres og oppbevares ved 4 ° c.
- Klargjør type II-kollagenase: 2 mg/mL i 2% BSA i 1x PBS. Forbered umiddelbart før bruk.
- Forbered røde blodlegemer (RBC) lysering løsning: 1,5 M NH4Cl, 100 mm NaHCO3, 10 mm Disodium EDTA i deionisert vann (di/H2O). Oppbevares ved 4 ° c. Forbered 1x RBC lysering Solution fra 10x lagerløsning i DI/H2O umiddelbart før bruk.
- Forbered vekst medier: 15% fosterets storfe serum (FBS), 1% antibiotika-antimykotisk løsning (ABAM) i Dulbecco ' s modifisert Eagle medium: næringsstoff blanding F-12 (DMEM/F12). Filteret steriliseres og oppbevares ved 4 ° c.
- Forbered Preadipocyte frysing løsning: 10% dimethyl sulfoxide, 15% FBS i DMEM/F12 Media. Filteret steriliseres og oppbevares ved 4 ° c.
- Forbered differensiering Media: 10 mg/L transferrin, 33 μM biotin, 0,5 μM humant insulin løsning, 17 μM D-Pantotensyre acid hemicalcium salt, 100 nM deksametason, 2 nM 3, 3 ', 5-Triiodo-L-thyronine natrium salt (T3), 1 μM ciglitizone, 540 μM 3- Isobutyl-1-metylxanthin (IBMX), 1% ABAM i DMEM/F12. Filteret steriliseres og oppbevares ved 4 ° c.
2. ECM forberedelse av reagenser
- Klargjør fryse buffer løsning: 10 mM Tris base, 5 mM EDTA, 1% ABAM, 1% phenylmethylsulfonyl fluor (PMSF) i DI/H2O. rør løsning for å oppløse EDTA. Juster pH til 8,0 med HCl eller NaOH. store ved 4 ° c i opptil 3 måneder.
- Forbered enzymatisk løsning #1:1% ABAM i 0,25% Trypsin-EDTA. Oppbevares ved 4 ° c i opptil 3 måneder.
- Klargjør skylle buffer løsning: 137 mM NaCl, 2,68 mM KCl, 7 mM na2HPO4, 1,5 mm KH2PO4, 1% ABAM, 1% PMSF i sterilisert di/H2O. rør for å oppløse salter. Juster pH til 8,0 med HCl eller NaOH. Oppbevares ved 4 ° c i opptil 3 måneder.
- Forbered enzymatisk løsning #2:55 mM na2HPO4, 17 mm KH2PO4, 4,9 mm MgSO4∙ 7H2O, 1% ABAM, 1% PMSF i di/H2O. store 4 ° c i opptil 3 måneder. Rør for å oppløse salter. Legg til 80 U/mL-lipase fra svin bukspyttkjertel umiddelbart før bruk, Skriv inn VI-S; 160 U/mL deoxyribonuclease I fra storfe bukspyttkjertel, type II-S; og 100 μg/mL ribonuklease A fra storfe bukspyttkjertel, type III-A.
- Klargjør løsning for fjerning av Polar løsningsmiddel: 1% ABAM, 1% PMSF i isopropanol.
FORSIKTIG: isopropanol er brannfarlig; i et brannfarlig skap ved 25 ° c og kastes i brennbart avfall. - Forbered 70% etanol, 1% ABAM, 1% PMSF i DI/H2O. Legg ABAM og PMSF like før bruk.
FORSIKTIG: etanol er brannfarlig; i et brannfarlig skap ved 25 ° c og kastes i brennbart avfall. - Klargjør lagringsløsning: 1% ABAM, 1% PMSF i 1x PBS. Oppbevares ved 4 ° c i opptil 3 måneder.
3. metabolsk bestemmelse av fenotype reagens forberedelse
- Opptak av glukose
- Forbered serum sult Media: DMEM/F12, 1% ABAM. Filteret steriliseres og oppbevares ved 4 ° c
- Klargjør 200 nM humant insulin oppløsning i 1x PBS umiddelbart før bruk.
- Forbered 200 nM humant insulin, 0,1 mM 2-Deoxy-D-glukose, 1 μCi/brønn Deoxy-D-glukose, 2-[1, 2-3H (N)]-, i 1x PBS. Forbered umiddelbart før bruk.
- Lipolyse
- Forbered Isoproterenol fortynnet i PBS: 3 mM lagerløsning. Fortynne til å arbeide konsentrasjon av 3 μM for analysen.
- Olje rød-O farging
- Forbered 4% formalin i DI/H2O. oppbevares ved romtemperatur.
- Klargjør olje rød-O arbeids løsning. Fortynne olje rød-O Solution (ORO) med DI/H2o i a 3:2 ratio (Oro: di/H2O). Forbered umiddelbart før bruk. Filtrer gjennom filter papir (tabell med materialer).
4. fettvev anskaffelser
Merk: visceral fettvev (mva) er samlet inn fra større segl i begynnelsen av operasjonen av kirurgen og transporteres tilbake til laboratoriet på isen for umiddelbar behandling. Universelle forholdsregler bør brukes ved håndtering av alle menneskelige vev og etsende reagenser, inkludert å utføre alt arbeid i en laminær strømnings hette, ved hjelp av komplett laboratorie sikkerhets slitasje, og ingen recapping.
- Tilsett 5-10 g intakt VAT til 15-25 mL fryse buffer løsning i et 50 mL konisk rør for å senke vevsprøven. Lagre prøver ved-80 ° c til decellularization, i opptil 1 måned.
- Bruk et separat, friskt utvalg av MERVERDIAVGIFT for preadipocyte isolasjon som beskrevet i avsnitt 5.
5. Preadipocyte isolasjon
- Plasser 2 g intakt mva i 20 mL av kollagenase, type II, løsning i en 50 mL konisk rør. Så hakke grundig ved å sette inn steril saks i konisk rør og hakking vevet i røret. Når fullt hakket til en fin slurry, ruge vevet i kollagenase løsningen på en orbital shaker på 130 RPM og 37 ° c for 60 min.
- Filtrer den resulterende biorest gjennom en 100 μm nylon mesh til en frisk 50 mL konisk rør ved å helle biorest fra ett konisk rør gjennom et stykke mesh foldet over toppen av en frisk konisk rør. Biorest på dette punktet bør være en gul-oransje væske med moderat viskositet, med små mengder av rester av ufordøyd fiber vev. Den mesh bør fange større biter av ufordøyd vev, som er forkastet.
- Sentrifuger prøven ved 270 x g i 10 min. Fjern supernatanten og resuspend celle pellet i 2 ml 1X RBC lysering Solution med en pipette.
- Ruge for 1 min ved 25 ° c og tilsett deretter 10 mL 15% FBS-DMEM/F12. Sentrifuger på 270 x g i 10 min.
- Fjern supernatanten og resuspend celle pellet i 10 mL 15% FBS-DMEM/F12 med en pipette. Overfør celle suspensjonen til 100 mm Petri parabol med en pipette og ruge ved 37 ° c og 5% CO2, inntil cellene nå 80-100% samløpet, vanligvis 2-6 dager. Endre Media hver 2-3 dager.
- Løsne og vask celler.
- Fjern medier med en pipette og påfør 4 mL 0,25% Trypsin-EDTA for å tilhenger celler. Ruge ved 37 ° c i 10 min, periodevis virvlende platen forsiktig for å løsne cellene.
- Tilsett 20 mL 15% FBS-DMEM/F12 og resuspend de frakoblede cellene i dette mediet med en pipette. Deretter overføres til en frisk 50 mL konisk rør og sentrifuger 270 x g i 10 min.
- Fjern supernatanten og kast den. Vask celle pellet en gang i 1x PBS, og resuspend deretter celle pellet i 20 mL fersk 15% FBS-DMEM/F12 med en pipette. Overfør celle suspensjonen til en T-150 kultur kolbe.
- Kultur celler ved 37 ° c og 5% CO2. Split og utvide celler hver 2-3 dager som de når 80-100% samløpet ved å bruke 7 mL av 0,25% Trypsin-EDTA, utvide fra en kolbe til 8 flasker.
Merk: Dette krever vanligvis 3-4 passasjer, som tillater riktig ekspansjon og beholder adipogenic potensial og pasient-og Depot-spesifikke cellulære metabolske fenotyper. Passaging preadipocytes i overkant av 4-5 passasjer fører til tap av adipogenic potensial. - Løsne celler i 8 flasker med 7 mL 0,25% Trypsin-EDTA per kolbe som beskrevet ovenfor, og ruge ved 37 ° c i 10 min.
- Tilsett 8 mL 15% FBS-DMEM/F12 per kolbe og resuspend de frittstående cellene med en pipette. Overfør hele celle fjæringen delt jevnt inn i 3 50 mL koniske rør og sentrifuge ved 270 x g i 10 min.
- Resuspend den resulterende celle pellets i 5 mL 15% FBS-DMEM/F12 i et 15 mL konisk rør og telle celler ved hjelp av celle telleren og Trypan blå.
- Sentrifuger celle fjæringen ved 270 x g i 10 min. Deretter resuspend cellen pellet i Preadipocyte frysing løsning til en endelig celle konsentrasjon på 1 x 106/ml, og Alikvot 1 ml celle suspensjon per 1,5 ml cryovial tube.
- Oppbevar celler i cryovials for 1 dager ved-80 ° c. Overfør cryovials til flytende nitrogen for langtidsoppbevaring i 3-6 måneder.
- Når den er klar til bruk, Tin en cryovial i et vannbad på 37 ° c i 3-5 min. Resuspend cellene i 20 mL 15% FBS-DMEM/F12, og sentrifuger ved 270 x g i 10 min.
- Resuspend celle pellet i 20 mL 15% FBS-DMEM/F12, pipette til en enkelt T-150 kolbe, og deretter vokse til 80% samløpet over 2-3 dager ved 37 ° c og 5% CO2.
- Løsne celler med 7 mL 0,25% Trypsin-EDTA per kolbe som beskrevet ovenfor i trinn 5,6. Resuspend på 3 000 000 celler per mL (dvs. 6 x 104 celler per 20 μL) i 15% FBS-DMEM/F12, og bruk som beskrevet nedenfor (punkt 7, trinn 7,4).
6. fettvev ECM forberedelse
- Dag 1: Frys-tine og enzymatisk fordøyelse #1
- Frys-Tin tidligere frosne (trinn 4,2) mva-prøver som er lagret i fryse buffer løsning i 50 mL koniske rør fra-80 ° c til 37 ° c i et forvarmet vannbad, incubating 20 min med skånsom periodisk manuell omrøring. Når tint, Overfør tilbake til-80 ° c og ruge 20 min. Gjenta fryse-tine 3x, avslutt med tine prøver i et 37 ° c vannbad.
- Ved hjelp av steril tang, Overfør mva-prøvene til friske 50 mL koniske rør som inneholder 15-25 mL enzymatisk oppløsning #1, slik at mva-prøvene er fullstendig nedsenket. Deretter ruge over natten på en orbital shaker (130 RPM, 37 ° c).
- Dag 2: enzymatisk fordøyelse #2
- Vask prøvene 3x med 15-25 mL skylle buffer løsning på en orbital shaker (130 RPM, 37 ° c, 20 min hver vask). Tøm skylle buffer løsningen etter hver vask.
- Overfør prøver til friske 50 mL koniske rør som inneholder 15-25 mL enzymatisk oppløsning #2 og ruge på en orbital shaker (130 RPM, 37 ° c, over natten).
- Dag 3: Delipidation
- Vask prøvene 3x med 15-25 mL skylle buffer løsning på en orbital shaker (130 RPM, 37 ° c, 20 min hver vask). Tøm skylle buffer løsningen etter hver vask.
- Overfør prøver til friske 50 mL koniske rør som inneholder 15-25 mL Polar løsnings løsning og ruge på en orbital shaker (130 RPM, 25 ° c, overnatting). Etter dette trinnet, et flertall av lipid bør fjernes, og prøvene skal være hvit eller gjennomskinnelig i fargen.
FORSIKTIG: avsugs løsningen for Polar løsemiddel er brannfarlig og bør oppbevares og brukes ved 25 ° c.
- Dag 4: vask og oppbevaring
- Overfør prøver til friske 50 mL koniske rør som inneholder 15-25 mL skylle buffer løsning. Vask prøvene 3x på en orbital shaker (130 RPM, 37 ° c, 20 min hver vask).
- Vask prøver 3x med 15-25 mL 70% etanol på en orbital shaker (130 RPM, 37 ° c, 20 min hver vask) helle av 70% etanol løsning etter hver vask.
- Vask prøvene en gang med lagringsløsning på en orbital shaker (130 RPM, 37 ° c, 20 min hver vask).
- Ved hjelp av steril tang, overføre prøver til friske 50 mL koniske rør som inneholder 15-25 mL lagringsløsning. Sørg for at nok lagringsløsning brukes til å fordype prøvene helt. Oppbevares ved 4 ° c i opptil 1 måned.
7. ECM-adipocyte forberedelse
- Overfør lagrede ECM-fragmenter til individuelle brønner av 24-brønn plate ved hjelp av steril tang. Legg til så mange ECM-fragmenter i så mange brønner som kreves for den planlagte nedstrøms analysen (f.eks. glukose opptak eller lipolyse, se nedenfor), inkludert duplikater eller triplicates. Vask med 500 μL av 70% etanol 3x på en orbital shaker (130 RPM, 37 ° c, 20 min hver vask).
- Rehydrate ECM ved å vaske 3x i steril 1x PBS på en orbital shaker (130 RPM, 37 ° c, 20 min hver vask).
- Ved hjelp av steril saks, kutt og veie ECM i 100 mg fragmenter. Ved hjelp av steril tang, sted 1 100 mg fragment i hver brønn av en 24-brønn plate. Ruge ved 25 ° c i 15 minutter for å tillate overflødig PBS å extrude fra fragmenter. Fjern forsiktig overflødig PBS med en pipette.
- Seed hver 100 mg ECM-fragment med 20 μL av preadipocyte celle fjæring (3 000 000 celler per mL, 6 x 104 celler per 20 μL, i 15% FBS-DMEM/F12, fra trinn 5,10). Pipetter cellene direkte inn i ECM ved å plassere tuppen av pipette i ECM og forsiktig utviste celle fjæringen i midten av matrisen, og pass på at celle fjæringen ikke renner over og ender opp på undersiden av brønnen.
- Hvis celle fjæringen er overfylt fra ECM der pipette spissen er plassert, fjerner du tuppen fra dette stedet og setter inn et annet sted i ECM. Ruge seeded ECM for 40 min ved 37 ° c.
Merk: for RNA-ekstraksjon for qrtPCR, frø hver 500 mg ECM-fragmenter med 3 x 105 celler i 100 μL (3 000 000-celler per ml, dvs. 3 x 105 -celler per 100 μL, i 15% FBS-DMEM/F12).
- Hvis celle fjæringen er overfylt fra ECM der pipette spissen er plassert, fjerner du tuppen fra dette stedet og setter inn et annet sted i ECM. Ruge seeded ECM for 40 min ved 37 ° c.
- Fyll hver brønn på 24-brønn plate med 500 μL av vekst medier for å dekke de seeded ECM-fragmentene. Kultur ved 37 ° c og 5% CO2 for 72 h.
- Etter 72 h, nøye aspirer 15% FBS-DMEM/F12, vippe platen litt slik at Media til bassenget under fragment, og plassere pipette spissen bare ved siden av ECM fragment uten å forstyrre den. Etter aspirating, tilsett 500 μL av differensiering Media, skiftende medier hver 2-3 dager ved hjelp av en lignende teknikk, for en total kultur periode på 14 dager.
- Sjekk for differensiering ved hjelp av lys mikroskopi: cellene vil akkumulere lipider, slå brun-gul i farge og mer sfærisk i form.
Merk: seeded matriser kan brukes til metabolsk testing (f. eks, glukose opptak analysen, lipolyse analysen, ORO), histologi eller immunhistokjemi (IHC), eller standard vev Imaging. For fast vev ORO farging og Imaging, fryse ECM-adipocyte prøver i flytende nitrogen.
- Sjekk for differensiering ved hjelp av lys mikroskopi: cellene vil akkumulere lipider, slå brun-gul i farge og mer sfærisk i form.
8. metabolsk bestemmelse av fenotype
- Skanner elektron mikroskopi
- Fix prøver i 2,5% glutaraldehyde i Sorensen ' s fosfat buffer ved 25 ° c for 12 h. Postfix i 1% Osmium tetroxide i Sorensen ' s fosfat buffer ved 4 ° c for 1 t.
- Serielt tørke prøver i etanol. Vask i hexamethyldisalizane, og luft-tørt. Deretter monteres på en skanning elektron mikroskopi spire med kolloidalt grafitt. Tørr, og frese-coat med gull.
- Ta bilder med et skanne elektronmikroskop.
- Olje rød-O farging
- Levende vev: olje rød-O løsning
- Nøye aspirer medier fra brønner med en pipette. Deretter vaskes prøvene en gang med 500 μL av 1x PBS per brønn.
- Fiks prøver med 200 μL av 4% formalin i steril deionisert H2O ved 25 ° c i 15 min. aspirer formalin med en pipette, vask prøver to ganger med 1x PBS (500 μL hver vask).
- Tilsett 200 μL av 60% isopropanol prøver ved 25 ° c i 5 min. aspirer 60% isopropanol med en pipette.
- Fargeprøver med olje rød-O arbeids løsning ved 25 ° c i 5 min. aspirer olje rød-O med en pipette og deretter vaske prøvene 3x med 1x PBS (500 μL hver vask). Deretter bildet med en optisk mikroskop.
- Fast vev: olje rød-O stain Kit
- Flash-Frys ECM-adipocyte prøver i optimal skjæring temperatur (OCT) sammensatte og seksjon (5 μm) på en kryostaten.
- Plasser glidebryteren i 85% propylenglykol i DI/H2o i 2 min. Plasser RASET i Oro beis ved 60 ° c i 6 min. Plasser steh lide i 85% PROPYLENGLYKOL i di/h2o i 1 min. skyll RASET to ganger med di/h2o.
- Plasser raset i modifisert Mayer ' s Hematoksylin fra olje rød-O farging Kit for 1 min. skyll raset to ganger med vann fra springen. Skyll glidebryteren to ganger med DI/H2O.
- Monter dekkglass ved hjelp av vandig festemiddel og bilde på et mikroskop.
- RNA-ekstraksjon fra ECM for qrtPCR
Merk: for å maksimere RNA yield, bruk 500 mg ECM-fragmenter sådd med 3 x 105 preadipocytes i 100 μL og differensiere som ovenfor i 6-brønn plater i 3 ml differensiering medier per brønn.- Når differensiert, overføre hver enkelt ECM-adipocyte prøve inn i en 50 mL konisk rør på isen ved hjelp av steril tang.
- Vask tom brønn med 500 μL av buffer RLT. Legg buffer RLT til 50 mL konisk rør med matchende ECM-adipocyte sample.
- Ved hjelp av sterile saks, fint hakke hver ECM-adipocyte prøve innenfor 50 mL konisk rør, mens du holder røret på isen, sette inn saksen i den koniske rør for å hakke vevet.
- Fullstendig fryse og tine de koniske rørene fra-80 ° c til 37 ° c 3x.
- Sentrifuger koniske rør ved 500 x g og 4 ° c i 10 min.
- Fjern forsiktig supernatanten med en pipette og bruk for RNA-ekstraksjon med en fiber tissue RNA avsugs sett (tabell av materialer).
- Levende vev: olje rød-O løsning
- Glukose opptak analysen
- Skille 6 x 104 preadipocytes i 100 mg ECM fragmenter i 0,5 ml differensiering medium i 24-brønn plater som beskrevet ovenfor (avsnitt 5).
- Etter 14 dager med differensiering, Fjern mediet og vask ECM-adipocytter en gang med 1x PBS. Tilsett 0,5 mL/brønn serum sult medium og kultur ved 37 ° c og 5% CO2 for 12 timer.
- Fjern medium og vask celler to ganger med 1x PBS. Tilsett 0,5 mL/brønn 2% BSA i PBS og kultur ved 37 ° c og 5% CO2 for 2 timer.
- Vask celler én gang med 1x PBS, tilsett 0,5 mL/Well 1x PBS med eller uten 200 nM insulin, og ruge ved 37 ° c i 40 min.
- Aspirer 1x PBS, tilsett 0,5 mL/brønn 1X PBS med 0,1 mM 2-deoxy-D-glukose, 2 μCi/mL deoxy-D-glukose, 2-[1, 2-3H (N)], med eller uten 200 nM insulin, og ruge ved 37 ° c og 5% co2 for 40 min. Bruk standard forholdsregler for håndtering og avhending av alle radioaktive reagenser og avfall, som lovpålagt av lokale, institusjonelle regulatoriske lover.
- Fjern medium med en pipette og vask celler 3x med 1x PBS. Tilsett 420 μL av 1% SDS-løsning i DI/H2O, og lyse celler med kraftig pipettering. Ruge 25 ° c i 10 min.
- Samle 5 μL fra hver brønn for Bradford protein analysen. Overfør 400 μL av gjenværende celle lysat i 2 mL scintillation væske i et scintillation hetteglass. Count 3H-2DG aktivitet på scintillation telleren. Analyser data som teller per minutt normalisert til protein, mg/mL.
- Lipolyse analysen
- Skille 6 x 104 preadipocytes i 100 mg ECM fragmenter i 0,5 ml av menneskelig differensiering medium i 24-brønn plater som beskrevet ovenfor (avsnitt 5).
- Etter 14 dager med differensiering, fjerne medium og vaske celler to ganger med varm 1x PBS. Tilsett 0,5 mL av serum sult medium (uten insulin) med eller uten 3 μM isoproterenol, og kultur adipocytter ved 37 ° c og 5% CO2 for 72 h.
- Samle kultur supernatanter, som kan oppbevares ved-80 ° c til klar for analyse. Samle ECM i mikrosentrifugen rør for DNA-kvantifisering for data normalisering.
- Pipet 2 μL av hver supernatanten i en 96-brønn mikroplate. Reserver brønner for blanks (destillert H2O) og glyserol standard løsning som tilbys i triglyserider fastsettelse Kit.
- Tilsett 270 μL av gratis glyserol reagens fra triglyserider fastsettelse Kit til hver brønn, pipette å blande. Ruge plate ved 37 ° c i 5 min.
- Mål absorbansen ved 540 NM på en mikroplate spektrofotometer.
- Beregn konsentrasjonen av glyserol og normalisere med DNA fra ECM:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utarbeidelse av fettvev ECM, seeding med preadipocytes, og in vitro differensiering inn modne adipocytter resultere i klare sekvensielle morfologiske endringer i vev som tillater visuell vurdering av fremgang gjennom protokollen (figur 1) . Preadipocytes som brukes til å frø ECM er isolert ved hjelp av kollagenase fordøyelse fra separate mva-prøver (figur 2). Scanning elektron mikroskopi av ECM-adipocyte konstruksjoner på hvert trinn i behandlingen avslører decellularization av ECM og påfølgende recapitulation av lipid-inneholdende adipocytter på reseeding og differensiering (Figur 3). Kollagen 1-spesifikke immunhistokjemi av decellularized ECM avslører vedlikehold av kollagen mikroarkitektur, mens olje rød-O farging av levende og fast/delt 3D ECM-adipocyte konstruksjoner avslører lipid-inneholdende adipocytter (Figur 4 A). qrtPCR fra adipocytter DIFFERENSIERT i ECM demonstrerer markerte oppregulering av adipogenic gener i forhold til udifferensierte preadipocytes KULTIVERT i ECM (Figur 4B). Metabolsk bestemmelse av fenotype av ECM-adipocyte konstruerer studere alle kombinasjoner av ECM og adipocytter fra diabetiker (DM) og ikke-diabetiker (NDM) avslører nedsatt glukose opptak og lipolytic funksjon i ECM-adipocyte konstruksjoner fra DM i forhold til NDM vev, recapitulating DM-spesifikke metabolske defekter vi har tidligere rapportert i menneskelig adipocytter i standard 2D-kultur11. Viktigere, NDM ECM redder insulin-stimulert glukose opptak og lipolytic kapasitet i DM adipocytter (Figur 4C)11. Sammen viser disse dataene sykdoms spesifikk regulering av adipocyte cellulære metabolisme av ECM. Ytterligere detaljer er rapportert i Baker et al.11.
Figur 1: arbeidsflyt for ECM-adipocyte-forberedelser. Dag 1: hele visceral fettvev prøver gjennomgår tre fryse-tine sykluser etterfulgt av natten inkubasjons med enzymatisk fordøyelsen løsning #1. Dag 2: etter fordøyelsen med enzymatisk løsning #1, er prøvene fordøyd over natten med enzymatisk fordøyelsen løsning #2. På dette punktet, vil prøvene være delvis delipidated. Dag 3: etter enzymatisk fordøyelsen #2, prøver gjennomgår over natten inkubasjons med Polar løsningsmiddel utvinnings løsning, som vil fullføre delipidation. Etter dag 3, bør prøvene være fullt delipidated og hvit/gjennomskinnelig i fargen. Prøvene vaskes grundig med skylling buffer løsning, deretter 70% etanol og oppbevares i oppbevaringsløsning i 40 ° c til det er klart for reseeding med preadipocytes. Dag 4: Preadipocytes er sådd i decellularized mva etterfulgt av adipogenic differensiering i 14 dager. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: arbeidsflyt for preadipocyte isolering. MOMS er hakket, fordøyd med kollagenase, filtrert, sentrifugert, og den resulterende stromovascular celle pellet belagt og kultivert å utvide preadipocytes. Se Baker et al. 201721 for mer informasjon om menneskelig preadipocyte isolering og 2D-adipocyte kultur. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: skanne elektron mikroskopi bilder. Intakt fettvev, decellularized fettvev, og decellularized fettvev repopulated med preadipocytes og differensiert i adipogenic medier i 14 dager. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: karakterisering av adipocytter i ECM. (A) Decellularized fettvev ECM opprettholder mikroarkitektur og støtter adipocyte differensiering: topp: kollagen 1 immunhistokjemi av hele menneske moms før og etter decellularization demonstrere vedlikehold av mikroarkitektur Middle: 3D konfokalmikroskopi fargefotomikrografier av levende menneskelig adipocytter innen ECM; intakt decellularized Human moms beiset med olje Red-O før reseeding med preadipocytes, 4 dager etter såing, og 14 dager etter seeding med preadipocytes etterfulgt av adipogenic differensiering; blå: DAPI farging av cellekjerner; rød: olje rød-O farging av intracellulære lipid; bunn: formalin-fast, parafin-embedded, 5 μm delt, olje rød-O-beiset menneskelig mva før decellularization, umiddelbart etter decellularization, og etter decellularization, preadipocyte-seeding, og 14 dager med adipogenic differensiering, demonstrere cytoplasmatiske lipid akkumulering i adipocytter innen ECM. (B) ADIPOCYTTER i ECM-upregulate adipogenic genuttrykk: qrtPCR-analyse som sammenligner adipogenic gen transkripsjon nivåer i RNA fra Human VAT adipocytter DIFFERENSIERT i mva ECM i 14 dager i forhold til udifferensierte PREADIPOCYTES i mva ECM kultivert for 72 h i nonadipogenic Media. Data er bety ± SEM. ACLY: ATP citrate Lyase, ATGL: fett triglyserider lipase, FASN: fatty acid syntase, PPARg: peroksisomproliferatoraktiverende proliferativ aktivert reseptor gamma; samordne: fold forskjell i transkripsjon nivå i modne adipocytter forhold til udifferensierte preadipocyte referent = 1; alle fold forskjeller signifikant (p < 0.001, sammenkoblet t-test); ECM fra 10, preadipocytes/adipocytter fra n = 11. (C) ECM regulerer adipocyte metabolisme i en DM-spesifikk måte: 3D-ECM fra DM eller NDM seeded med PREADIPOCYTES fra DM eller NDM, differensiert i adipocytter, og studert med metabolske bestemmelse av fenotype. Data stolper merket med pasient kilde (NDM, DM) av ECM og adipocytter (ECM/AD); f. eks, NDM/NDM betegner både ECM og preadipocytes avledet fra NDM pasienter, mens NDM/DM betegner ECM fra NDM pasienter kombinert med preadipocytes fra DM pasienter. Data er gjennomsnittlig ± SEM. koordinater: glukose opptak (CPM), normalisert til ECM/celle lysat proteinkonsentrasjon (mg/mL); lipolyse: kultur supernatanten glyserol konsentrasjon (mg/mL) normalisert til ECM/Cell lysat DNA konsentrasjon (ng/mL); * p < 0.050, * * p < 0.100 sammenligne indikerte data-punkt til tilsvarende data-punkt (basal eller insulin-stimulert for glukose opptak, basal eller isoproterenol-stimulert for lipolyse) i DM/DM arm, ved hjelp av blandet modell analyse justering for gjentatt tiltak ECM fra n = 9 NDM, 8 DM, preadipocytes fra 10 NDM, 9 DM for glukose opptak; ECM fra 6 NDM, 6 DM, preadipocytes fra 6 NDM, 6 DM for lipolyse. Dette tallet er tilpasset fra O ' Rourke og Lumeng11. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ECM-adipocyte kultur modell gir et verdifullt verktøy for å dissekere de enkelte rollene til ECM og celler i å diktere ultimate vev fenotype. ECM-isolasjons protokollen er ganske reproduserbar, men variasjon i decellularization prosessen kan observeres. Delipidation-trinnet i dag 3 er et kritisk punkt i protokollen. Ved fullføring av overnight utvinning, bør delipidation av matrisen være dokumentert av Polar løsemiddel løsning snu gult, mens matrisen bør overgangen fra en gul-oransje farge karakteristisk for intakt fettvev til gjennomskinnelig/ hvit (figur 1). Hvis disse fargeendringene ikke forekommer, er det sannsynlig at delipidation ikke er fullført. Inter-pasient variasjon i delipidation effektivitet er vanlig, men hittil har vi ikke observert noen korrelasjon av effektiviteten av delipidation med emne DM status, alder, BMI, eller andre kliniske variabler. Store prøver (større enn 20 g) vil ikke gjennomgå effektive delipidation; behandlings prøver < 20 g kan forhindre dette problemet. Hvis en prøve ikke vises helt delipidated etter dag 3, dele prøven i halv med steril saks, deretter overføre prøvene til frisk 15-20 mL av Polar løsemiddel avsug løsning og plasser på en orbital shaker for 3-5 h. Det kan hende at enkelte prøver ikke er fullstendig decellularize etter at du har gjentatt avsugs trinnet for Polar løsemiddel. Hvis et flertall av prøven er decellularized, er det mulig å kutte ut delene som inneholder lipid før du bruker prøven i eksperimenter.
Forurensning kan forekomme hvis sterilitet ikke vedlikeholdes flittig gjennom hele prosessen. Alt arbeid skal utføres i en laminær Flow hette ved hjelp av standard cellekultur forholdsregler. Vi oppbevarer vanligvis ECM i opptil 3 måneder ved 4 ° c, og preadipocytes i opptil 6 måneder i flytende nitrogen. Bevaring av biofunctionality og sykdom-og Depot-spesifikke egenskaper utover denne tiden har ikke blitt testet.
Konfokalmikroskopi mikroskopi tillater visualisering av modne adipocytter innenfor ECM, som kan forsterkes med olje rød-O farging. Scanning elektron mikroskopi (SEM) gir også en ikke-kvantitativ metode for å visualisere adipocytter innen ECM. Av notatet, SEM og olje rød-O farging tyder unilocular adipocytter i ECM-adipocyte konstruksjoner, en morfologi som ligner in vivo adipocytter og i motsetning til de typiske multilocular adipocytter observert når preadipocytes gjennomgår adipogenic differensiering på 2D-plast (Figur 3, Figur 4A). Denne observasjonen tyder på at ECM gir et mer fysiologiske miljø for adipogenic differensiering enn standard vevs kultur på plast. Fiksering og snitting av ECM-adipocyte konstruksjoner kan være vanskelig, som OCT-embedded konstruksjoner er skjøre og ikke delen lett. Skjæring innebygd vev umiddelbart etter fjerning fra lagring fra-80 ° c fryser og utføre snitting i et kaldt-rom (4 ° c) på en pre-kjølt kryostaten gjør snitting gjennomførbart.
ECM-adipocyte kultur gir et fysiologiske miljø som tilnærmet i vivo fettvev miljø og gir et bærekraftig miljø for preadipocyte stilk cellen vekst og differensiering, noe som gjenspeiles av oppregulering av adipogenic gener i 3D-ECM-adipocyte kultur. ECM-adipocyte kulturer også engasjere seg i adipocyte metabolske funksjoner, inkludert glukose opptak og lipolyse8. Vi rapporterer glukose opptak som CPM normalisert til enten total protein utvunnet fra ECM-adipocyte kulturer målt med en Bradford-analysen, eller til DNA-innhold målt med en DNA-analysen Kit, og har observert lignende resultater med begge metoder. På samme måte rapporterer vi lipolyse som mg/mL glyserol Release normalisert til enten protein eller DNA, også med lignende resultater oppnådd med enten normalisering metode. Andre foreslår normalisering adipocyte metabolske data til lipid innhold, men hittil våre forsøk på å pålitelig ekstrakt lipid fra ECM konstruksjoner har vært mislykket. Rapportering glukose opptak rate som føflekker av glukose per enhet av tid og lipolyse som føflekker av glyserol/fri fatty acid per tidsenhet kan tillate mer nøyaktige sammenligninger mellom separate eksperimenter. Isolering av RNA fra ECM for qrtPCR analyse er preget av lavere avkastning sammenlignet med celler i 2D-kulturen, men utarbeidelse av større ECM fragmenter seeded med flere celler overvinner dette problemet, som beskrevet i trinn 8.3.1. Vi har støtt på vanskeligheter med å isolere tilstrekkelige mengder undegraded protein med phosphomoieties intakt for Western Blot analyse, som representerer en begrensning av modellen.
Lignende metodikk for å isolere ECM fra fettvev og seeding med preadipocytes har tidligere blitt publisert, med bevis som tyder på at ECM kan fremme adipogenic differensiering fraværende klassiske adipogenic meglere inkludert cAMP agonister, insulin, og PPAR-γ agonister12,14. Våre data er de første til å demonstrere sykdoms spesifikk regulering av cellulær metabolisme av ECM i fettvev, ved hjelp av metoder der adipocytter stimuleres med klassisk adipogenic differensiering faktorer11; lignende studier i fravær av adipogenic stimuli er et mål for fremtidig forskning. Andre har demonstrert lignende sykdomsspesifikke ECM-celle crosstalk ved hjelp av ECM og celler isolert fra lungevevet19,20. Alternative strategier har også vært ansatt, inkludert opprettelse av matriser ved å blande homogenisert fettvev ECM preparater i peptid hydrogeler12.
Mens Inter-pasient variasjon i humant adipocyte Cellular metabolisme er observert i både 2D-plast og 3D-ECM kultur, når analysert i samlet, disse cellene manifest sykdom-, depot-og sex-spesifikke forskjeller i cellulær metabolisme, som beskrevet av vår gruppe og andre11,21,22,23,24, validere verktøyet og generalizability av disse kultur modeller for studiet av adipocyte Cellular metabolisme. Vi har vist at adipocytter differensiert i sykdom-matchet ECM (dvs. NDM adipocytter i NDM ECM, DM adipocytter i DM ECM) recapitulate metabolske fenotyper av isolerte NDM og DM adipocytter i standard 2D kultur, støtter ECM-adipocyte kultur som en modell for å studere sykdom-spesifikke endringer i adipocyte cellulære metabolisme i et mer fysiologiske miljø. Vi har ikke observert forskjeller i omfanget eller retningen av metabolske funksjoner, inkludert glukose opptak eller lipolyse, når ECM og adipocytter fra samme eller forskjellige givere blir studert. I begge tilfeller, ECM-adipocyte konstruerer manifest DM-spesifikke metabolske fenotype (f. eks, redusert GU i DM/DM i forhold til NDM/NDM konstruksjoner), med ingen klar forskjell når sammenligne konstruksjoner består av ECM og adipocytter fra samme eller ulike givere .
ECM-adipocyte kultur tillater studie av kombinasjoner av ECM og preadipocytes fra distinkte pasientpopulasjoner og vev lagre, tillater analyse av sykdom-og Depot-spesifikke bidrag av ECM og adipocytter til ultimate fettvev metabolske fenotype. Demonstrerer denne styrken av ECM-adipocyte kultur modell, har vi vist at ECM fra NDM vev har kapasitet til å redde metabolske defekter i DM adipocytter (Figur 4C)11. Foreløpige data i murine visceral og subkutant fettvev tyder på at murine ECM regulerer murine adipocyte metabolisme tilsvarende på en Depot-spesifikk måte (upubliserte data, O ' Rourke RW, 2019), noe som tyder på at denne modellen systemet kan brukes til å studere ECM-adipocyte crosstalk i både murine og menneskelige systemer. Videre tillater denne modellen studie av isolert manipulering av ECM som et middel til å regulere fettvev fenotype. Foreløpige studier av ECM behandlet i forhold som induserer glycation målrettet spesielt til ECM, for eksempel, tyder på at disse endringene regulerer cellulære metabolske fenotype av celler senere seeded til behandlet ECM (upubliserte data, O ' Rourke RW, 2019), som gir en modell for studier av virkningene av målrettet manipulering av ECM på adipocyte fenotype.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen motstridende interesser.
Acknowledgments
Vi takker Danielle Berger, Marilyn Woodruff, Simone Correa, og Retha Geiss for assistanse til studie koordinering. SEM ble utført av University of Michigan mikroskopi & Image Analysis laboratorium Biomedical Research Core Facility. Dette prosjektet ble støttet av NIH tilskudd R01DK097449 (RWO), R01DK115190 (RWO, CNL), R01DK090262 (CNL), Veterans Affairs Merit Grant I01CX001811 (RWO), pilot og gjennomførbarhet Grant fra Michigan diabetes Research Center (NIH Grant P30-DK020572) (RWO), Veteraner administrasjon VISN 10 SPARK pilot Grant (RWO). Scanning elektron mikroskopi utført av University of Michigan mikroskopi & Image Analysis laboratorium Biomedical Research Core Facility. Figur 4 av dette manuskriptet ble opprinnelig publisert i Baker et al., J Clin Endo Metab 2017; 1. mars 102 (3), 1032-1043. Doi: 10.1210/JC. 2016-2915, og har blitt gjengitt med tillatelse fra Oxford University Press [https://academic.oup.com/jcem/article/102/3/1032/2836329]. For tillatelse til å gjenbruke dette materialet, kan du gå http://global.oup.com/academic/rights.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#25200056 | |
| 1.5 mL cryovial tube | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#02-682-557 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#89370-094 | |
| 100 µm nylon mesh filter | Corning Inc., Corning, NY, USA | Cat#352360 | |
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#D8375 | |
| 2 nM 3,3’,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt (T3) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#T6397 | |
| 24-well tissue culture plates | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10861-700 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#I5879 | |
| 96-well tissue culture plates | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10861-666 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (ABAM) | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#15240062 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#B4639 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#A8806 | |
| Buffer RLT | Qiagen, Hilden, Germany | Cat#79216 | |
| Ciglitizone | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#C3974 | |
| Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]- | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | Cat#NET328A250UC | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type II-S | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#D4513 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#D4902 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#BP231 | Flammable, caustic |
| Disodium EDTA | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#BP118 | |
| D-pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#21210 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12 | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#11320033 | |
| Ethanol | Decon Labs, Inc., King of Prussia, PA, USA | Cat#DSP-MD.43 | Flammable |
| EVE Cell Counting Slides, NanoEnTek | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10027-446 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#10437028 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#G5882 | Caustic |
| Hexamethyldisalizane | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#440191 | Flammable, caustic |
| Human insulin solution | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#I9278 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#A415 | Flammable |
| Isoproterenol | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#I5627 | Flammable |
| KCl | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#S25484 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#P5655 | |
| Lipase from porcine pancreas, type VI-S | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#L0382 | |
| MgSO4*7H2O | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#230391 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#S3014 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#S233 | |
| NH4Cl | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#A661 | |
| Optimal cutting temperature (OCT) compound | Agar Scientific, Ltd., Stansted, Essex, UK | Cat# AGR1180 | |
| Oil Red-O Solution (ORO) | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#O1391 | |
| Oil Red-O Stain Kit | American Master Tech Scientific Inc., Lodi, CA, USA | Cat#KTORO-G | |
| Osmium tetroxide | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#201030 | Caustic |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#93482 | Caustic |
| Phosphate Buffered Saline Solution (PBS) | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#SH3025601 | |
| Ribonuclease A from bovine pancreas, type III-A | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#R5125 | |
| RNAEasy Fibrous Tissue MiniKit | Qiagen, Hilden, Germany | Cat#74704 | |
| Scintillation Fluid | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#SX18 | |
| Scintillation Counter | |||
| Scissors, forceps, sterile | |||
| Sorensen's phosphate buffer | Thomas Scientific, Inc., Swedesboro, NJ | CAS #: 10049-21-5 | |
| T-150 culture flask | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10062-864 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#4369016 | |
| Temperature-controlled orbital shaker | |||
| Tissue Homogenizer, BeadBug Microtube Homogenizer | Benchmark Scientific | Cat#D1030 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#T3309 | |
| Triglyceride Determination Kit | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#TR0100 | |
| Trypan blue stain, 0.4% | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10027-446 | |
| Type II collagenase | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#17101015 | |
| Whatman Reeve Angel filter paper, Grade 201, 150mm | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#WHA5201150 |
References
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123, 4195-4200 (2010).
- Berrier, A. L., Yamada, K. M. Cell-matrix adhesion. Journal of Cell Physiology. 213 (3), 565-573 (2007).
- Trayhurn, P. Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity. Physiology Reviews. 93 (1), 1-21 (2014).
- O'Rourke, R. W., Lumeng, C. N. Obesity heats up adipose tissue lymphocytes. Gastroenterology. 145 (2), 282-285 (2013).
- Engin, A. The Pathogenesis of Obesity-Associated Adipose Tissue Inflammation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 960. 960, 221-245 (2017).
- Dankel, S. N., et al. COL6A3 expression in adipocytes associates with insulin resistance and depends on PPARγ and adipocyte size. Obesity (Silver Spring). 22 (8), 1807-1813 (2014).
- Divoux, A., et al. Fibrosis in human adipose tissue: composition, distribution, and link with lipid metabolism and fat mass loss. Diabetes. 59, 2817-2825 (2010).
- Lackey, D. E., et al. Contributions of adipose tissue architectural and tensile properties toward defining healthy and unhealthy obesity. American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 306 (3), E233-E246 (2014).
- Muir, L. A., et al. Adipose tissue fibrosis, hypertrophy, and hyperplasia: correlations with diabetes in human obesity. Obesity (Silver Spring). 24 (3), 597-605 (2016).
- Spencer, M., et al. Adipose tissue macrophages in insulin-resistant subjects are associated with collagen VI and fibrosis and demonstrate alternative activation. American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 299 (6), E1016-E1027 (2010).
- Baker, N. A., et al. Diabetes-specific regulation of adipocyte metabolism by the adipose tissue extracellular matrix. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 102 (3), 1-12 (2017).
- Pellegrinelli, V., et al. Human adipocyte function is impacted by mechanical cues. Journal of Patholology. 233 (2), 183-195 (2014).
- Flynn, L. E. The use of decellularized adipose tissue to provide an inductive microenvironment for the adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells. Biomaterials. 31 (17), 4715-4724 (2010).
- Perea-Gil, I., et al. In vitro comparative study of two decellularization protocols in search of an optimal myocardial scaffold for recellularization. American Journal Translational Research. 7 (3), 558-573 (2015).
- Porzionato, A., et al. Decellularized omentum as novel biologic scaffold for reconstructive surgery and regenerative medicine. European Journal of Histochemistry. 57 (1), e4 (2013).
- Tebyanian, H., et al. A Comparative Study of Rat Lung Decellularization by Chemical Detergents for Lung Tissue Engineering. Open Access Macedonian Journal of Medical Sciences. 5 (7), 859-865 (2017).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Wang, L., Johnson, J. A., Zhang, Q., Beahm, E. K. Combining decellularized human adipose tissue extracellular matrix and adipose-derived stem cells for adipose tissue engineering. Acta Biomaterials. 9 (11), 8921-8931 (2013).
- Booth, A. J., et al. Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 186 (9), 866-876 (2012).
- Parker, M. W., et al. Fibrotic extracellular matrix activates a profibrotic positive feedback loop. Journal of Clinical Investigation. 124 (4), 1622-1635 (2014).
- Baker, N. A., Muir, L. A., Lumeng, C. N., O'Rourke, R. W. Differentiation and Metabolic Interrogation of Human Adipocytes. Methods in Molecular Biology. 1566, 61-76 (2017).
- O'Rourke, R. W., et al. Hexosamine biosynthesis is a possible mechanism underlying hypoxia's effects on lipid metabolism in human adipocytes. PLoS One. 8 (8), e71165 (2013).
- Tchkonia, T., et al. Fat depot-specific characteristics are retained in strains derived from single human preadipocytes. Diabetes. 55 (9), 2571-2578 (2006).
- Tchoukalova, Y. D., et al. Sex- and depot-dependent differences in adipogenesis in normal-weight humans. Obesity (Silver Spring). 18 (10), 1875-1880 (2010).
