Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Immunofluorescens farvning ved hjælp af IBA1 og TMEM119 til Mikroglial tæthed, morfologi og perifer myeloid celle infiltration analyse i muse hjernen

Published: October 27, 2019 doi: 10.3791/60510
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,3, 1,2,4, 1,2,4, 1,2
1Axe Neurosciences, Centre de Recherche du CHU de Québec-Université Laval, 2Département de Médecine Moléculaire, Faculté de Médecine, Université Laval, 3Integrated Program in Neuroscience, McGill University, 4Center for Brain Immunology and Glia (BIG), University of Virginia

ERRATUM NOTICE

Summary

Denne protokol beskriver en trin-for-trin arbejdsgang for immunfluorescent cofarvning af IBA1 og TMEM119, foruden analyse af mikroglial tæthed, distribution, og morfologi, samt perifer myeloid celleinfiltration i mus hjernevæv.

Abstract

Dette er en protokol til dual visualisering af microglia og infiltrerende makrofager i mus hjernevæv. TMEM119 (som etiketter microglia selektivt), når det kombineres med IBA1 (som giver en usædvanlig visualisering af deres morfologi), tillader undersøgelse af ændringer i tæthed, fordeling, og morfologi. Det er vigtigt at kvantificere disse parametre for at give indsigt i de roller, der udøves af microglia, hjernens hjemmehørende makrofager. Under normale fysiologiske forhold distribueres microglia regelmæssigt i et mosaiklignende mønster og præsenterer en lille Soma med forgrenede processer. Ikke desto mindre, som en reaktion på miljømæssige faktorer (dvs., traumer, infektion, sygdom, eller skade), mikroglial tæthed, distribution, og morfologi er ændret i forskellige manerer, afhængigt af fornærmelse. Desuden giver den beskrevne dobbelt farvning metode visualisering af infiltrerende makrofager i hjernen baseret på deres udtryk for IBA1 og uden samlokalisering med TMEM119. Denne tilgang giver således mulighed for diskrimination mellem microglia og infiltrering af makrofager, som er nødvendig for at give funktionel indsigt i deres særskilte involvering i hjernens homøostase på tværs af forskellige sammenhænge af sundhed og sygdom. Denne protokol integrerer de seneste fund i Neuro immunologi, der vedrører identifikationen af selektive markører. Det fungerer også som et nyttigt redskab for både erfarne Neuro immunologer og forskere, der søger at integrere Neuro Immunologi i projekter.

Introduction

Uanset om akut eller kronisk, neuroinflammation er tæt påvirket af microglia, de residente makrofager i hjernen. Visualisering af microglia gennem immun farvning er værdifuldt for studiet af neuroinflammation med brug af let mikroskopi, en meget tilgængelig teknik. I homeostatiske forhold distribueres microglia typisk i et ikke-overlappende mosaiklignende mønster. De udviser små Somas, der udvider forgrenede processer1, som undertiden kontakter hinanden2. Microglial forgrenede processer dynamisk undersøgelse hjernen parenchyma, interagere med neuroner, andre gliale celler, og blodkar under normale fysiologiske betingelser3. Microglia er udstyret med et arsenal af receptorer, der giver dem mulighed for at udføre immunologiske opgaver og reagere på ændringer i hjernen Milieu, celledød, eller vævsskader. Desuden, de udøver vigtige fysiologiske funktioner, især i synaptisk dannelse, vedligeholdelse, og elimination4,5.

Blandt de tilgængelige markører, der anvendes til at studere microglia, er ioniseret calcium bindende adapter molekyle 1 (IBA1) en af de mest udbredte. IBA1 er et calcium bindende protein, der giver enestående visualisering af mikroglial morfologi, herunder fine distale processer, som bekræftet af elektronmikroskopi6. Dette værktøj har været medvirkende til at karakterisere mikroglial transformation, tidligere kaldet "aktivering", i en bred vifte af dyresygdomme modeller7,8,9. I nærværelse af neuroinflammation, den mikrogliale respons omfatter: microgliose, der er defineret som en stigning i cellulær tæthed, ændringer i fordelingen, der undertiden resulterer i klyngedannelse, udvidelse af celle kroppen, samt fortykkelse og afkortning af processer forbundet med flere ameboid figurer10,11,12,13.

Immun farvning er begrænset af tilgængeligheden af antistoffer rettet mod specifikke markører. Det er vigtigt, at IBA1 udtrykkes af microglia, men også af perifere makrofager, der infiltrerer hjernen14. Mens observation af IBA1-positive celler inde i hjernen er blevet en markør for microglia i dette forskningsområde, perifer makrofag infiltration er blevet rapporteret under forskellige betingelser, selv marginalt i den raske hjerne15,16 ,17,18. Derfor tillader brugen af IBA1 alene ikke selektiv visualisering af microglia. Desuden, makrofager vedtage molekylære og morfologiske egenskaber af Resident microglia, når de har infiltreret hjernen, hvilket hindrer differentiering19. Dette udgør en udfordring, når man undersøger funktionen af både microglia og infiltrerer makrofager.

Mens microglia og perifere makrofager har forskellige oprindelser (f. eks. fra den embryonale blomme sæk og knoglemarv, henholdsvis20og21), er der et stigende antal fund, som indikerer, at de to cellepopulationer udøver forskellige roller i hjernen19. Det er derfor afgørende at anvende metoder, der diskriminerer mellem disse to populationer uden invasive manipulationer (dvs. knoglemarv kimærer eller parabioose), der kan moduere deres tæthed, fordeling, morfologi, og funktion. TMEM119 er dukket op som en microglia-specifik markør på tværs af sundheds-og sygdomsforhold22. Når det kombineres med IBA1, bliver denne markør nyttig til at differentiere disse celler fra infiltrering af makrofager, som er TMEM119-negative og IBA1-positive. Mens det er udviklingsmæssigt reguleret, TMEM119 udtrykkes så tidligt som postnatal dag 3 (P3) og 6 (P6), støt stigende indtil nå voksne niveauer mellem P10 og P1422. IBA1 udtrykkes så tidligt som embryonal dag 10,5 (E 10.5)23. Den foreslåede dobbelt mærkning protokol er derfor nyttigt at studere disse to populationer i hele postnatale liv.

Denne protokol giver en trin-for-trin immunofarvning procedure, der tillader diskrimination mellem microglia og perifere makrofager. Det forklarer også, hvordan man gennemfører en kvantitativ analyse af mikroglial tæthed, distribution og morfologi samt analyse af perifer makrofag infiltration. Mens undersøgelsen af microglia og perifere makrofager er nyttig på sin egen, denne protokol giver yderligere lokalisering af neuroinflammatoriske Foyers; det fungerer således også som en platform til at identificere specifikke regioner, der skal undersøge, med anvendelse af supplerende (endnu, mere tids-og ressourceforbrugende) teknikker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle forsøgsprocedurer blev udført efter aftale med retningslinjerne fra de etiske udvalg for Dyreetik i overensstemmelse med det canadiske råd om dyrepasning og Komiteen for dyrepasning i Université Laval.

1. immun farvning

  1. Vælg tre mus hjernen sektioner, der indeholder den region af interesse (ROI) (dvs., hippocampus) ved hjælp af en hjerne Atlas. Anbring sektionerne i en plastik multi-brønd plade, og dæk dem til med 350 μL fosfat-bufferet saltvand (PBS) (tabel 1).
    Bemærk: for at opnå optimale resultater skal hjernen være perfombrugt med 4% PARAFORMALDEHYD og skåret til en tykkelse på 50 μm med en vibratome. For en 24 multi-brønd plade, kan hver brønd holde op til seks sektioner. Den anbefalede volumen opløsning for hver brønd er 350 μL (i op til tre sektioner) og 500 μL for brønde, der indeholder seks sektioner. For et højere antal sektioner, anbefales det at bruge en 12 multi-brønd plade. Sørg for, at den valgte volumen af opløsningen for hver brønd dækker vævet og gør det muligt for sektionerne at flyde. De anbefalede mængder gælder for hver løsning, der anvendes i resten af protokollen.
  2. Prøverne vaskes ved at dække dem med 350 μL PBS og lade dem hvile ved at placere multi-brønd pladen oven på en multipurpose shaker ved stuetemperatur (RT). Fjern PBS efter 5 min og Udskift det 5x med frisk PBS.
    Bemærk: for at fjerne løsningerne anbefales en overførings pipette. Når du hælder i en løsning, skal du sørge for at placere spidsen af pipetten mod brønd væggen for at beskytte vævs integriteten. Sørg også for at bruge en ny pipette til hver ny løsning.
  3. Fjern PBS og tilsæt 350 μL 10 mM natriumcitrat buffer med pH = 6,0 (tabel 1).
  4. Forsegl multi-brønd pladen med paraffin folie og lad den flyde på et tidligere forvarmet vandbad til 40 min ved 70 °C.
  5. Lad multi-Well pladen køle ned i ca. 15 minutter.
  6. Fjern natriumcitrat bufferen, og vask sektionerne i PBS som udført i trin 1,2.
  7. Fjern PBS og tilsæt 350 μL frisklavet 0,1% NaBH4 (tabel 1) og lad inkubere i 30 min ved rt.
  8. Fjern opløsningen på 0,1% NaBH4 , og vask sektionerne i PBS som udført i trin 1,2.
  9. Fjern PBS og Tilføj blokerende buffer (tabel 1) for 1 t på rt oven på en multipurpose shaker.
    Bemærk: Sørg for at forberede fordoblet volumener af blokerende buffer, da den samme løsning vil blive brugt i næste trin.
  10. Fjern blokerings bufferen, og Erstat med blokerende buffer, der indeholder blandingen af primære antistoffer (1:150 Mouse IBA1 + 1:300 TMEM119). Forsegl pladen med paraffin folie, og lad den inkubere natten over ved 4 °C.
  11. Den næste dag, varme prøver på RT for ca 15 min.
  12. Afsnittene 5x i 5 minutter vaskes i PBS med Triton (PBST) (tabel 1).
  13. Fjern PBST og Tilføj blokerende buffer, der indeholder blandingen af sekundære antistoffer (1:300 æsel anti-Mouse Alexa 488 for IBA1; 1:300 ged anti-Rabbit Alexa 568 for TMEM119) for 1,5 h hos RT. fra dette punkt og fremefter beskyttes prøverne mod lys.
  14. Fjern blokerende buffer og vask sektionerne 5x som udført i trin 1,2, undtagen denne gang med PBST.
  15. Fjern PBST og tilsæt 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) [1:20000] i 5 minutter ved RT.
  16. Fjern DAPI og vask afsnittene 3x for 5 min hver i fosfatbuffer (PB).
  17. Monter sektionerne på et mikroskopdias. Lad dem tørre, mens de beskyttes mod lys.
  18. Når tørret, tilsættes nogle dråber af montering fluorescens medium og dække med en dækseddel, undgå bobledannelse.
    Bemærk: Opbevar diasene, mens de beskyttes mod lys, inde i en histologisk glide æske ved 4 °C. Prøverne kan opbevares i flere måneder.

2. billeddannelse til analyse af tæthed og fordeling

  1. Ved hjælp af et widefield epifluorescens mikroskop skal du bruge en lav forstørrelse og DAPI-kanalen til at lokalisere ROI (dvs.
  2. Erhverve billeder på 20x, ved hjælp af en numerisk blænde (NA) af 0,5, med DAPI, 488, og 568 kanaler og filtre, med en opløsning på 0,3 μm/pixel. Fang et mosaik billede, der dækker ROI. Alternativt kan du tage individuelle billeder, der vil blive syet ind i et større billede.
    Bemærk: et mosaik billede er et super billede, der udgøres af mindre billeder. Mosaik billeder bruges normalt til at overvinde det begrænsede område af synsfelt af høje forstørrelser. Nogle software indeholder en mosaik funktion; ikke desto mindre kan billeder også manuelt sys sammen med andre fotoredigeringssoftware ved at sy de enkelte billeder ind i en. Husk at føje Skaleringsoplysningerne til filen. For denne type analyse, anbefales det at have mindst 300 mikrogliale celler afbildet per ROI/dyr (svarende til ca 10 − 15 billeder for hippocampus, for eksempel), med mindst fem dyr pr eksperimentel tilstand. Figur 1A − C viser billeder af kolmærket mikroglia.
  3. Gem billedet som en TIFF-fil.

3. billeddannelse til morfologi analyse

  1. Ved hjælp af et Konfokal eller struktureret belysnings mikroskop skal du bruge DAPI-kanalen til at finde ROI ved lav forstørrelse.
  2. Ved hjælp af en 40x mål (dvs., NA 1,4 olie), finde en IBA1 +/TMEM119 + celle inde i ROI. Mens live Imaging, flytte i Z-aksen. Så snart signalet fra den tilfældigt valgte microglia forsvinder, indstilles dette Z-niveau som begyndelsen af Z-stakken. Flyt langs Z-aksen i den modsatte retning, indtil signalet fra mikroglia forsvinder, og sæt dette punkt som enden af Z-stakken.
    Bemærk: figur 2A − C viser billeder af IBA1 +/TMEM119 + microglia.
  3. Opret en Z-stak i alle tre kanaler (DAPI, 488, 568) ved hjælp af en 0,33 μm Z-interval og pixelstørrelse på 0,15 μm/pixel. Føj Skaleringsoplysningerne til filen.
    Bemærk: det anbefalede Z-interval afhænger af målenes løsnings effekt (f. eks. for en 40x-målsætning såsom NA 1,4-olie, det er 0,33 μm). For morfologi analyse anbefales det at have mindst 20 celler pr. dyr med minimum fem dyr pr. eksperimentel tilstand.
  4. Gem filen som en TIFF-fil.

4. analyse af tæthed og fordeling

  1. Åbn FIJI/ImageJ med det nærmeste nabo distance-plugin (NND) installeret. Åbn 20x-billedet.
    Bemærk: Brug en søgemaskine med nøgleordet "nærmeste nabo distancer beregning med ImageJ" for at finde installationsvejledningen. Plugin forfatteren er Yuxiong Mao.
  2. Hvis du vil indstille skalaen manuelt baseret på en skala, der er påtrykt billedet, skal du vælge det lige linje værktøj (figur 3E), placere markøren på kanten af skalaen og, mens du trykker på Skift-tasten, tegne en linje så tæt som muligt på skalaen på billedet (figur 3i ), skal du vælge Analysér | Angiv skalering, og indtast derefter de korrekte oplysninger (figur 3j).
    Bemærk: skalaen kan nogle gange være indeholdt i filens metadata og indstilles automatisk.
  3. Vælg billede | Farve | Gør sammensat for at oprette et sammensat billede af alle kanaler.
    Bemærk: under billed erhvervelse vil FIJI/ImageJ automatisk oprette en sammensat i RGB-format.
  4. På menulinjen skal du vælge Analysér | Sæt målinger. Tjek område, centroidog omkreds. Klik på fanen Omdiriger til, og vælg den åbnede fil (figur 3k).
  5. Gå til billede | Farve | Kanal værktøjet til at åbne kanal værktøjet.
    Bemærk: denne menu gør det muligt at deaktiverede en bestemt farve. DAPI-Kanalen kan være nyttig til at identificere ROI og til at bekræfte celler. Det kan deaktiveres for at gøre optælling lettere.
  6. Tegn en grov omkreds af ROI med frihånds markeringsværktøjet (figur 3D).
  7. Aktivér markerings penselværktøjet ved at dobbeltklikke på det ovale værktøj på værktøjslinjen og sørge for, at afkrydsningsfeltet Aktivér valg pensel er markeret (figur 3g). Dette værktøj vil blive brugt til at afgrænse ROI mere præcist. Vælg en passende pensel størrelse mellem 200 − 400.
  8. Brug markerings børsten til at justere omkredsen, så den passer bedst til ROI. Tryk på T på tastaturet for at føje til ROI Manager (figur 3L).
  9. Vælg Analysér | Mål eller tryk på M -tasten, hvorefter et resultat vindue dukker op. Kopiér og Indsæt resultaterne i et dataark, og Gem derefter oplysningerne om området (dvs. området for ROI; Figur 3R).
  10. Når du har kopieret området for ROI, skal du slette oplysningerne fra resultatvinduet ved at klikke på det og trykke på Backspace -tasten.
  11. Gå til vinduet ROI Manager (figur 3L), Højreklik på sporing af ROI, Skift navnet, så det svarer til billedets navn, og Gem derefter.
  12. Dobbeltklik på penselværktøjet på værktøjslinjen. Vælg den sorte farve og en pensel størrelse på 10. Sørg for, at indstillingen Paint af overlay ikke er markeret (figur 3h).
  13. I TMEM119 kanalen, forsigtigt placere en sort prik på midten Soma for hver TMEM119 + microglia. Placer en hvid prik på midten af cellerne, der ikke er positive for TMEM119 (for at markere infiltrering af makrofager). Gentag den samme procedure for alle celler, der er indeholdt i INVESTERINGSAFKASTET.
    Bemærk: det er vigtigt, at alle prikker (sort og hvid) er placeret i samme kanal. Identiteten af kanalen kan verificeres (rød, blå eller grøn) ved at se på farven på billedet vindues etiketter.
  14. Vælg billede | Farve | Delt kanal. Der vises et vindue for hver kanal. Identificer derefter den kanal, der har prik annoteringer, og luk de to andre vinduer.
  15. Omdiriger det nye split Channel-billede. Gå til Analysér | Sæt målinger. Under fanen Omdiriger til skaldu klikke på og vælge det opdelte kanal billede (figur 3k).
  16. Vælg billede | Type | 8-bit. Gå til billede | Juster og vælg tærskel (figur 3o). Hvis du vil justere tærsklen, skal du skubbe knappen på den anden bjælke hele vejen til venstre (tærskelværdi = 0) i begge søjler.
    Bemærk: Dette vil kun efterlade de sorte prikker på billedet, vises hvid.
  17. Vælg INVESTERINGSAFKASTET i vinduet ROI Manager. Vælg Analysér | Analysér partikel (figur 3N). På størrelse (tommer ˆ 2): Skriv 1 − 20. Hold pixel enheden ukontrolleret, Markér Vis, Sammenfat og Føj til Manager, og tryk på OK. Vinduet Resume vil dukke op og give antallet af point (figur 3P). Kopiér og Indsæt oplysningerne i dataarket.
  18. Vælg plugins | Nnd. Det NND vindue vil dukke op (figur 3Q). Kopiér/Indsæt alle oplysningerne i dataarket. Hvert tal repræsenterer afstanden hver microglia har til nærmeste nærliggende microglia.
  19. Gå tilbage til tærskel vinduet og skub den første bjælke hele vejen til højre (tærskelværdi = 255 i begge søjler), som vil efterlade alle de hvide prikker synlige, vises hvide (figur 3m).
  20. Vælg Analysér | Analysér partikel. Vinduet Resume, der angiver antallet af punkter, vil dukke op (figur 3P). Kopiér og Indsæt oplysningerne i dataarket.
  21. Gå til ROI Manager Vælg alle punkter, højreklik, og Gem med billedets navn. Dette vil gøre det muligt at gemme alle punkter i en zip-fil (figur 3L). Vælg fil | Gem som, og Gem filen med et navn, der gør det muligt at identificere det analyserede billede.
  22. Opnå tætheden af microglia (for hvert billede) ved at dividere antallet af IBA1 +/TMEM119 + dobbelt-positive celler med området for ROI.
    Bemærk: værdierne for hvert billede kan gennemsnitligt for hvert dyr. Dataene kan derefter præsenteres som middel ± standardfejl af middelværdien (SEM) for alle dyrene.
  23. Bestem NND ved at opnå et gennemsnit pr. billede af NND-værdierne for alle TMEM119 +-celler.
    Bemærk: dataene kan derefter præsenteres som Mean ± SEM for alle dyrene.
  24. Beregn afstands indekset ved hjælp af formlen: NND2 x tæthed.
    Bemærk: dataene kan derefter præsenteres som Mean ± SEM for alle dyrene. Enhederne til denne måling vil være vilkårlige enheder.
  25. Kvantificere mikrogliale klynger ved at identificere celler, der har en NND under 12 μm.
    Bemærk: her er 12 μm valgt, da det er den omtrentlige afstand mellem to direkte stiller mikrogliale celler, der rører hinanden med arborizationer. Hvis der er mere end tre mikroglia, der opfylder denne betingelse, skal du vende tilbage til billedet og kontrollere, om disse celler er en del af en eller flere klynger.
  26. Når du har bekræftet antallet af klynger, skriver du antallet af klynger i dataarket.
    Bemærk: antallet af klynger kan divideres med ROI-området for at opnå tætheden af celler/mm2 for hvert dyr. Dataene kan derefter præsenteres som Mean ± SEM for alle dyrene.
  27. For at bestemme procentdelen af perifer myeloid celleinfiltration beregnes% af IBA1 +/TMEM119-celler over det samlede antal myeloide celler (TMEM119 +/IBA1 + + TMEM119-/IBA1 +) for hvert dyr.
    Bemærk: dataene kan derefter præsenteres som Mean ± SEM for alle dyrene.

5. morfologi analyse

  1. Åbn FIJI/ImageJ.
  2. Åbn 40x-billedet ved hjælp af billede J eller FIJI. Vælg et popup-vindue vises spørger, om billederne skal åbnes i en stak. Klik på OK. Vælg derefter billede | Stakke | Z-projekt for at åbne z-projektionsvinduet. Medtag alle udsnit, fra det første til det sidste udsnit. Kontroller, at maksimumintensiteten er valgt under projektions type, og klik på OK
  3. Klik på det nye vindue med Z-projektet. Vælg billede | Farver | Opdelte kanaler. Udfør sporene på billederne af IBA1-kanalen.
    Bemærk: de andre kanaler (TMEM119 og DAPI) kan holdes åbne og konsulteres efter behov under den mikrogliale morfologiske analyse.
  4. På menulinjen skal du vælge Analysér | Sæt målinger. Kontroller området, centroidog omkreds. Vælg den åbne fil (figur 3K) under fanen Omdiriger til.
  5. Indstil skalaen som beskrevet i trin 4,2.
  6. For at måle Soma-størrelsen i IBA1-kanalen skal du tegne en ru omkreds af Soma med frihånds markeringsværktøjet (figur 3D).
  7. Aktivér markerings penselværktøjet ved at dobbeltklikke på det ovale værktøj på værktøjslinjen og derefter markere afkrydsningsfeltet Aktivér markerings pensel (figur 3g). Vælg en markerings pensel størrelse mellem 10 − 20 (figur 3b).
  8. Brug markerings børsten til at justere sporet, så det passer bedst til Soma. Når du zoomer ind, aktiveres præcisionen under dette trin (figur 2i).
  9. Tryk på T -tasten for at føje Soma Trace til ROI Manager (figur 3L).
  10. Vælg Analysér | Mål , eller tryk på tasten M . Et resultat vindue vil dukke op. Kopiér og Indsæt resultaterne i et dataark (figur 3R).
  11. Hvis du vil gemme oplysningerne om Soma-området, skal du gå til vinduet ROI Manager, højreklikke på INVESTERINGSAFKASTET, ændre navnet, så det svarer til billedets navn, angive, at sporingen er for Soma, og derefter gemme filen.
  12. For at måle arboriserings området i IBA1-kanalen skal du klikke på en mikroglial proces ekstremitet med polygon markeringsværktøjet, som vil starte polygon figuren (figur 3c).
  13. Efter spidsen af de mikrogliale processer, gå rundt i microglia ved at klikke på spidsen af hver proces ekstremitet til at danne en polygon, der bedst repræsenterer det område, som er omfattet af de mikrogliale arborizationer (figur 2D− H).
    Bemærk: Sørg for, at polygonen forbinder alle de mikrogliale proces ekstremiteter. De linjer, der danner polygonen, bør aldrig krydse hinanden. Når du klikker rundt om en mikroglial proces spids, være omhyggelig med at undgå at afskære nogen del af processen. Det er nogle gange nyttigt at tilføje ekstra point for at gå rundt i en proces. Antallet af punkter, der danner polygonen, er ikke direkte forbundet med antallet af distale processer og er derfor ikke relevant for undersøgelsen.
  14. For at lukke polygonen, klik på udgangspunktet for polygonen.
  15. Tryk på T -tasten for at føje sporingen til ROI Manager (figur 3L). Vælg Analysér | Mål , eller tryk på tasten M . Et resultat vindue vil dukke op. Kopiér og Indsæt resultaterne i et dataark (figur 3R).
  16. Hvis du vil gemme oplysningerne om området for arborisering, skal du gå til vinduet ROI Manager, højreklikke på INVESTERINGSAFKASTET, ændre navnet, så det svarer til billedets navn, angive for arborization og derefter gemme filen.
  17. Find Soma-området ved at gennemsnit alle Soma-områder for hvert dyr.
    Bemærk: dataene kan præsenteres som middel ± SEM for alle dyrene.
  18. Bestem arborization område ved at gennemsnit alle de arborization områder for hvert dyr.
    Bemærk: dataene kan præsenteres som middel ± SEM for alle dyrene.
  19. Beregn morfologi indekset ved hjælp af formlen Soma område/arborization område for hver mikroglial celle og gennemsnit pr. dyr.
    Bemærk: dataene kan præsenteres som middel ± SEM for alle dyrene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 viser Co-mærkning af microglia ved hjælp af IBA1 og TMEM119 i en koronal del af dorsale hippocampus afbildet ved 20x ved Fluorescens mikroskopi. En vellykket farvning afslører mikrogliale celle legemer og deres fine processer (figur 1A − C). Denne farvning muliggør bestemmelse af mikroglial tæthed og fordeling og identifikation af mikrogliale klynger (figur 1I) og infiltrerende makrofager (figur 1F).

Figur 2 viser IBA1 +/TMEM119 + microglia (figur 2A − C) i et trinvis eksempel på den mikrogliale arboriseringssporings procedure (figur 2D − H) samt et eksempel på celle kropssporing (figur 2i ), begge inddelt ved 40x ved Konfokal mikroskopi.

Figure 1
Figur 1: IBA1 og TMEM119 dobbelt farvning af mus hjernevæv for tæthed, fordeling, klyngedannelse, og perifer myeloid celleinfiltration analyse. (A − C) Typisk mikroglial fordeling i hippocampus af en C57BL/6 voksen mus. (D − F) Microglia identificeret som IBA1 +/tmem119 + og infiltrerer makrofag identificeret som IBA1 +/tmem119 (hvid pil) i amygdala af en mandlig mus. (G − I) Klynge af to microglia (hvid firkant) i hippocampus af en mus. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: IBA1 og TMEM119 farvning for mikroglial morfologi analyse. (A − C) Microglia. (D − I) Trin-for-trin eksempel på arborization sporing med IBA1 kanal ved hjælp af polygon værktøj i FIJI/ImageJ. J) eksempel på microglia Soma TRACING med IBA1-kanalen ved hjælp af værktøjet Frihåndsmarkering i Fiji/ImageJ. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Fiji/ImageJ interface og værktøjer til mikroglial tæthed, distribution, klyngedannelse, morfologi og perifer myeloid celleinfiltration analyse. (A − R) Kompilering af alle værktøjer, menuer og vinduer, der anvendes til tæthed, klynge, og morfologi analyser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Løsninger Under forberedelse
Blokerende buffer 0,5% gelatine + 5% naturlig gede serum + 5% naturligt æsel serum + 0,01% Triton X-100 i TBS [0,05 M]
Citratbuffer 1,92 g citronsyre [10 mm], 500 μl Tween 20 [0,05% (v/v)], 700 ml ultrarent vand, Justér pH = 6,0 med NaOH [10 N], fyld op til 1 L med ultrarent vand
NaBH4 [0,01% w/w] Disolve 0,01 g af nabh4 i 10 ml ultrarent vand skal opløsningen være godt blandet. Denne løsning skaber boble; Frigør trykket ved at åbne hætten efter blanding
Pb [100 mM] Disolve 23,48 g af na2HPO4 og 4,8 g af Nah2po4· H2O i 1 l af ultrarent vand, derefter fyldes op til 2 l, justere pH = 7,4
Pbs [50 mM] Disolve 5,87 g af na2HPO4, 1,2 g af Nah2po4· H2O, 9 g NaCl i 500 ml ultrarent vand, fyld op til 1 L med ultrarent vand, Justér pH = 7,4
PBST PBS + 0,01% Triton X-100
Tbs Den fortyndede Tris HCL [0,5 m] med ultrarent vand 1:10 [0,05 m], tag 1 L Tris HCL [0,05 m] og tilsæt 8,75 g NaCl
Tris HCl [0,5 M] 950 ml ultrarent vand, tilsæt 78,8 g Tris-buffer hydrochlorid (C4H11No3CL) Justér pH = 8 og fyld op til 1 L

Tabel 1: opløsninger, der anvendes til immun farvning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol kan opdeles i to kritiske dele: kvaliteten af farvning og analyse. Hvis farvning ikke er optimal, vil det ikke repræsentere mikrogliale celler tilstrækkeligt, hvilket påvirker tætheden, fordelingen og morfologiske målinger. Desuden kan andelen af infiltration perifere myeloide celler undervurderes. Dette er en optimeret version af farvnings protokollen, men der er flere faktorer, der kan resultere i suboptimale billeder. Selv om perfusion af dyret ikke er inkluderet i denne protokol, hvis hjernen fiksering ikke er veludført, vil kvaliteten af farvning blive kompromitteret. Derudover er der behov for tilstrækkelig perfusion for at sikre fravær af makrofager inde i blodkar, der kan forstyrre studiet.

Med hensyn til immun farvning, de mest kritiske detaljer omfatter kvaliteten af buffere, blokering trin, korrekt opbevaring af antistoffer, og hjernen prøvehåndtering. Den korrekte forberedelse af buffere og deres oplagring har en direkte indflydelse på kvaliteten af farvning. Medmindre andet er angivet, kan nogle buffere lagres i længere perioder, men brugen af en buffer, der viser tegn på kontaminering, bør undgås. Hvis buffere forberedes dage eller uger i forvejen, skal pH-værdien af hver opløsning før brug verificeres.

Derudover er tilstedeværelsen af baggrunds farvning fortsat et af de mest almindeligt forekommende problemer med hensyn til immun farvning. Baggrunds farvning gør det vanskeligt at analysere microglia, især deres morfologi, og dermed vil bias resultaterne. For at forhindre baggrund er det vigtigt, at blokerings trinnet udføres korrekt. Opbevaringsbetingelserne for antistofferne har også direkte indvirkning på deres virkning. Det tilrådes at nøje følge de retningslinjer for opbevaring, som virksomheden, samt undgå hyppige optøning-frysning cyklusser. Endelig, under hele processen, er det afgørende at være opmærksom på den fysiske integritet af hjernen sektioner. Det er vigtigt at udvise forsigtighed under hver manipulation (buffer ændringer, skylninger og montering), især hvis eksperimentatoren ikke har erfaring med denne procedure. Det tilrådes at undgå at forlade prøverne uden nogen flydende løsning, når du ændrer opløsninger eller buffere, løsninger til det efterfølgende trin skal være klar til at hælde i brønden på forhånd. Den multi-brønd plade skal være korrekt forseglet med paraffin film i løbet af natten trin for at undgå fordampning, der kan føre prøverne til at tørre.

Kvantitativ analyse af mikroglial tæthed, distribution og morfologi har flere fordele i forhold til kvalitative rapporter. For at forhindre bias, bør forskeren udfører analysen være blændet til den eksperimentelle tilstand. Således er det foreslået at have forskellige mennesker udføre analysen og ændre navnet på filerne (samtidig med at de oprindelige og nye navne i en nøgle ark). De nye navne bør ikke have antydninger af den eksperimentelle tilstand. Hele analysen kan gøres på disse blændet filer, og den oprindelige billede identitet er afsløret først efter indsamlingen af data og forud for statistisk analyse. Selv om blændende allerede praktiseres af erfarne forskere, er det stadig værdifuld rådgivning for dem, der udfører denne type analyse for første gang.

Kontrollerende for hjernen region er gjort i løbet af hjernen sektion udvælgelse og sporing af ROI under analyse. Sørg for at bruge sektioner fra samme område af Bregma niveauer på tværs af dyr. Den samme ROI bør anvendes til tæthed, fordeling, og morfologi analyser. For massefylde og distribution analyser, er det særlig vigtigt at være præcis, når du tegner ROI i FIJI/image J. Brugen af en Brain Atlas anbefales kraftigt til både sektions udvælgelse og ROI tracing. Brugen af DAPI letter også identifikationen af neuroanatomiske landemærker. For at undgå varians anbefales det at afvise microglia, der kun er delvist placeret i INVESTERINGSAFKASTET, da de kan afvige fra deres mikromiljø. Når du markerer microglia til massefylde analyse, kan DAPI-kanalen bruges som et udvælgelseskriterium. Ved kun at tælle microglia, der indeholder DAPI-farvede kerner, er alle betragtede microglia i samme plan, hvilket reducerer den personlige skævhed under udvælgelsen.

Da målinger for NND, afstands indeks og klynge analyse er baseret på placeringen af prikker, der markerer individuelle celler, og da afstandene beregnes af FIJI/ImageJ, er det vigtigt at være konsekvent, når disse prikker placeres. Sørg for at strengt placere prikkerne i midten af cellen kroppen, som bestemmes visuelt. Desuden bør størrelsen af prikkerne forblive konsistent i hele analysen. Dette vil bidrage til en bedre repræsentation af den rumlige fordeling af den mikrogliale befolkning. For klynge analyse blev 12 μm valgt som en afstands tærskel baseret på vores tidligere analyser. Men hvis der er fire eller flere forskellige celler med en NND under 12 μm, kan alle disse celler tage del i en enkelt klynge eller repræsentere to klynger af to celler. Dette gjorde det nødvendigt at vende tilbage til billederne og bekræfte det faktiske antal klynger.

I modsætning til tæthed og fordeling, hvor ROI er bestemt af neuroanatomiske funktioner ved hjælp af en hjerne Atlas, udvælgelsen af mikrogliale celler til morfologi analyse er baseret på evnen til at analysere cellen. Alle de celler, der kan analyseres, skal vælges til analyse i en Z-stak, før du flytter til en anden Z-stak for at forhindre valg bias. Årsager til at udelukke celler omfatter problemer med immun farvning eller vævs skæring, behandling (f. eks. rive) eller montering (f. eks. bobledannelse). Ideelt set bør hjerne sektioner med sådanne spørgsmål systematisk udelukkes fra billeddannelse og analyse. Det er også vigtigt at bemærke, at farvningen for TMEM119 og IBA1 ikke viser 100% overlap (figur 2A − C). Da TMEM119 ikke tillader visualisering af proceskontinuitet (såvel som IBA1), gør det det vanskeligt at vurdere, hvor en celle slutter, og hvor en anden starter. Således er morfologi analysen udført ved hjælp af IBA1 Channel. Derudover bør alle spor og prikker gemmes og visualiseres til fremtidig revision, hvilket giver mulighed for at øge gennemsigtigheden og reproducerbarhed af resultater.

Denne protokol giver værdifulde oplysninger om microglia og infiltrerende makrofager. Eksempler på dens anvendelser omfatter påvisning af tegn på neuroinflammation gennem ændringer i microglia i forskellige hjerneområder, studere de anti-inflammatoriske virkninger af en forbindelse, og studere faktorer, der forstyrrer den korrekte funktion af microglia. I betragtning af, at denne protokol tillader påvisning af infiltrerende makrofager i hjernen og differentiering af disse celler fra microglia, yderligere applikationer omfatter: bestemmelse, hvis rekrutteringen af makrofager sker i en bestemt fornærmelse eller med brugen af andre teknikker (dvs. genetiske værktøjer), og bekræfter og undersøger konsekvenserne af fraværet af perifere makrofager i hjernen under fornærmelse. Husk, at Fluorescens mikroskopi på sin egen ikke er tilstrækkelig til at bekræfte infiltration inde i hjernen parenchyma. Når IBA1 +/TMEM119CELLER observeres i nærheden af ventriklerne eller perivaskulære rum, kræves der højere rumlige opløsnings teknikker såsom elektronmikroskopi for at bekræfte deres lokalisering i parentchyma. Mens ændringer i tæthed, fordeling og morfologi er gode indikatorer for mikrogliale og makrofag roller, denne tilgang er mest kraftfuld, når de kombineres med funktionelle undersøgelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi er taknemmelige for Nathalie Vernoux for hendes vejledning og hjælp til eksperimenterne. Vi vil også gerne takke DRs. Emmanuel Planel og Serge Rivest for brugen af deres fluorescens og confokale mikroskoper, hhv. Dette arbejde blev delvist finansieret af stipendier fra det mexicanske råd for videnskab og teknologi (CONACYT; til F. G. I), Fondation famille-Choquette og centre thématique de Recherche en Neuro Sciences (CTRN; to K.P.), fonds de Recherche du Québec-Santé (til M.B.), og Shastri Indo-Canadian Institute (til K.B.), samt en opdagelse tilskud fra Natural Sciences og Engineering Research Council of Canada (NSERC) til M.E.T. M.E.T. besidder en Canada forskning stol (tier II) af Neuroimmune plasticitet i sundhed og terapi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse Invitrogen/Thermofisher A21202
Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit Invitrogen/Thermofisher A11011
Biolite 24 Well multidish Thermo Fisher 930186
Bovine serum albumin EMD Millipore Corporation 2930
Citric acid Sigma-Aldrich C0759-500G
DAPI Nuceleic acid stain Invitrogen/Thermofisher MP 01306
Fine Brush Art store
Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01
Gelatin from coldwater fish skin Sigma-Aldrich G7765
Microscope coverglass Fisher Scientific 1254418
Microslides positively charged VWR 48311-703
Monoclonal mouse Anti-IBA1 Millipore MABN92
Na2H2PO4·H2O BioShop Canada Inc. SPM306, SPM400
Na2HPO4 BioShop Canada Inc. SPD307, SPD600
NaBH4 Sigma-Aldrich 480886
NaCl Fisher Scientific S642500
Normal donkey serum (NDS) Jackson ImmunoResearch laboratories Inc. 017-000-121
Normal goat serum (NGS) Jackson ImmunoResearch laboratories Inc. 005-000-121
Parafilm-M Parafilm PM-999
Rabbit monoclonal Anti-TMEM119 Abcam ab209064
Reciprocal Shaking bath model 25 Precision Scientific -
Transfer pipette
Tris buffer hydrochloride BioShop Canada Inc. TRS002/TRS004
Triton-X-100 Sigma-Aldrich T8787
Tween 20 Sigma-Aldrich P7949-100ML

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).
  2. Milior, G., et al. Fractalkine receptor deficiency impairs microglial and neuronal responsiveness to chronic stress. Brain, Behavior, and Immunity. 55, 114-125 (2016).
  3. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in Vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
  4. Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., Khoury, J. E. Microglia in neurodegeneration. Nature Neuroscience. 21 (10), 1359 (2018).
  5. Tay, T. L., Savage, J. C., Hui, C. W., Bisht, K., Tremblay, M. È Microglia across the lifespan: from origin to function in brain development, plasticity and cognition. The Journal of Physiology. 595 (6), 1929-1945 (2017).
  6. Tremblay, M. È, Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial Interactions with Synapses Are Modulated by Visual Experience. PLoS Biology. 8 (11), (2010).
  7. Jakovljevic, M., et al. Induction of NTPDase1/CD39 by Reactive Microglia and Macrophages Is Associated With the Functional State During EAE. Frontiers in Neuroscience. 13, (2019).
  8. Taylor, A. M. W., et al. Microglia Disrupt Mesolimbic Reward Circuitry in Chronic Pain. The Journal of Neuroscience. 35 (22), 8442-8450 (2015).
  9. Poliani, P. L., et al. TREM2 sustains microglial expansion during aging and response to demyelination. The Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 2161-2170 (2015).
  10. Lu, S. M., et al. HIV-1 Tat-Induced Microgliosis and Synaptic Damage via Interactions between Peripheral and Central Myeloid Cells. PLoS ONE. 6 (9), e23915 (2011).
  11. Rodríguez, J. J., et al. Increased densities of resting and activated microglia in the dentate gyrus follow senile plaque formation in the CA1 subfield of the hippocampus in the triple transgenic model of Alzheimer's disease. Neuroscience Letters. 552, 129-134 (2013).
  12. Rasmussen, S., et al. Persistent activation of microglia is associated with neuronal dysfunction of callosal projecting pathways and multiple sclerosis-like lesions in relapsing-remitting experimental autoimmune encephalomyelitis. Brain. 130 (11), 2816-2829 (2007).
  13. Walker, F. R., et al. Dynamic structural remodelling of microglia in health and disease: a review of the models, the signals and the mechanisms. Brain, Behavior, and Immunity. 37, 1-14 (2014).
  14. Ohsawa, K., Imai, Y., Kanazawa, H., Sasaki, Y., Kohsaka, S. Involvement of Iba1 in membrane ruffling and phagocytosis of macrophages/microglia. Journal of Cell Science. 113 (17), 3073-3084 (2000).
  15. Yamasaki, R., et al. Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system. Journal of Experimental Medicine. 211 (8), 1533-1549 (2014).
  16. Wohleb, E. S., et al. Peripheral innate immune challenge exaggerated microglia activation, increased the number of inflammatory CNS macrophages, and prolonged social withdrawal in socially defeated mice. Psychoneuroendocrinology. 37 (9), 1491-1505 (2012).
  17. Shemer, A., et al. Engrafted parenchymal brain macrophages differ from microglia in transcriptome, chromatin landscape and response to challenge. Nature Communications. 9, (2018).
  18. Geissmann, F., et al. Development of monocytes, macrophages and dendritic cells. Science (New York, N.Y). 327 (5966), 656-661 (2010).
  19. Minogue, A. M. Role of infiltrating monocytes/macrophages in acute and chronic neuroinflammation: Effects on cognition, learning and affective behaviour. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 79, 15-18 (2017).
  20. Ginhoux, F., et al. Fate Mapping Analysis Reveals That Adult Microglia Derive from Primitive Macrophages. Science (New York, N.Y). 330 (6005), 841-845 (2010).
  21. Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).
  22. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), E1738-E1746 (2016).
  23. Mizutani, M., et al. The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood. Journal of Immunology. 188 (1), 29-36 (2012).

Tags

Immunologi og infektion mus hjerne microglia myeloide celler neuroimmunologi immunofluorescens IBA1 TMEM119 mikroskopi

Erratum

Formal Correction: Erratum: Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain
Posted by JoVE Editors on 10/12/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain. An author name was updated.

The name was corrected from:

Maude Bordelau

to:

Maude Bordeleau

Immunofluorescens farvning ved hjælp af IBA1 og TMEM119 til Mikroglial tæthed, morfologi og perifer myeloid celle infiltration analyse i muse hjernen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

González Ibanez, F., Picard,… More

González Ibanez, F., Picard, K., Bordeleau, M., Sharma, K., Bisht, K., Tremblay, M. È. Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain. J. Vis. Exp. (152), e60510, doi:10.3791/60510 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter