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Medicine

使用激光多普勒流测量测量大鼠脑血流自动调节的评估

Published: January 19, 2020 doi: 10.3791/60540
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1
1Department of Physiology, Medical College of Wisconsin
* These authors contributed equally

Summary

本文演示了使用激光多普勒流量测量来评估大脑循环在动脉血压降低期间自动调节其血流的能力。

Abstract

在研究大脑血流调节机理时，可以使用激光多普勒流量测定仪（LDF）获得对微循环血流的相对测量。本文演示了一种封闭的颅骨制备，允许在不穿透头骨或安装腔室或脑窗的情况下评估脑血流。为了评估自动调节机制，可以同时使用LDF，同时利用通过分级出血控制血压降低的模型。这使得实时跟踪血流的相对变化，以响应循环血量的戒断所产生的动脉血压降低。这种范例是研究脑血流在动脉血压降低期间自动调节的宝贵方法，并且，在协议稍作修改后，作为出血性休克的实验模型也很有价值。除了评估自动调节反应外，LDF 还可用于监测皮质血流，用于调查调节脑血流和各种实验的影响的代谢、造血、内皮、体液或神经机制脑血流的介入和病理状况。

Introduction

大脑循环中的自动调节机制在维持大脑平衡和正常功能方面起着至关重要的作用。脑血流的自动调节受心率、血速、灌注压力、脑阻力动脉直径、微循环阻力等多种因素的影响，这些因素对维持大脑总脑血流在全身血压生理范围内的作用。当动脉压力增加时，这些机制收缩动脉和阻力动脉，以防止颅内压力的危险增加。当动脉血压降低时，局部控制机制使动脉稀释，以保持组织灌注和O2分娩。各种病理状况，如高帽病、创伤性或全球缺氧性脑损伤，以及糖尿病微血管病1、2、3、4、5、6，可能会破坏大脑自动调节其血流的能力。例如，慢性高血压将有效的自动调节范围向高压力7、8、9转移，高盐（HS）饮食不仅干扰脑微循环10的正常内皮依赖性扩张，而且会削弱脑循环中自动调节机制在动脉压力降低时扩张和维持组织灌注的能力。大脑自动调节也损害在达尔盐敏感大鼠时，他们被喂食HS饮食12。

在动脉压力降低期间，尽管灌注压力降低，但脑阻力动脉和动脉的扩张最初使脑血流恢复控制值。随着动脉压力的进一步降低，脑血流在较低压力（自动调节反应的高原阶段）保持恒定，直到血管不再扩张以保持血流量在较低压力下。器官能够维持正常血流的最低压力称为自动调节 （LLA） 的下限。在LLA以下的压力下，脑血流量从静息值中显著减少，并且随着动脉灌注压力的每次降低，脑血流以线性方式减少。如高血压7、8、9所观察到的LLA向上移位，在动脉灌注压力降低（例如心肌梗死、缺血性中风或循环休克）的情况下，可能会增加缺血损伤的风险和严重程度。

LDF已被证明是评估微循环中血流的极有价值的方法，在各种情况下，包括大脑循环11、14、15的血流的自动调节。除了评估自动调节反应，LDF可用于监测皮质血流时，调查代谢，造血，内皮，体液，或神经机制，调节大脑血流和各种实验干预和病理条件对脑血流的影响10，16，17，18，19，20，21。

LDF测量反射激光的变化，以响应运动粒子的数量和速度，在这种情况下，红血球（RBC）。对于脑血管自动调节的研究，动脉血压通过注射α-肾上腺素激动剂来增加动脉压力而改变（因为大脑循环本身对α-阿德雷涅克血管收缩剂激动剂不敏感）12、15或通过控制血量戒断来降低动脉压力11、14。在本研究中，LDF用于演示降压对健康大鼠大脑自动调节的影响。虽然文献中已经描述了开闭头骨方法，但本文展示了一个封闭的头骨准备，允许在不穿透头骨或安装室或脑窗的情况下评估脑血流。

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Protocol

威斯康星医学院机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 批准了本文中描述的所有协议，所有程序都符合国家卫生研究院 （NIH） 实验室动物福利办公室 （OLAW） 的要求。法规。

1. 实验动物和准备录音

  1. 使用重达250~300克的8~12周大雄性斯普拉格-道利大鼠。对于这些实验，喂食大鼠的标准饮食包括0.4%纳氯、200克/千克碱、3克/千克DL-蛋氨酸、497.77克/千克蔗糖、150克/千克玉米淀粉、50克/公斤玉米油、50克/公斤纤维素、2克/公斤胆碱酸酯、35克/千克矿物混合物和10克/千克维生素混合。
  2. 使用数据采集软件或任何类似的记录方法记录动脉血压和 LDF 读数。
  3. 将动脉压力传感器连接到记录系统的一个通道，将 LDF 探头连接到记录系统上的另一个通道。
  4. 在测量之前，校准激光多普勒探头以设定运动标准，并确保激光多普勒流量计提供稳定的输出。
  5. 准备准备手术和实验所需的额外设备：解剖显微镜、啮齿动物呼吸机、端潮CO2监测仪、固定大鼠头部的立体仪器以及用于在皮环上定位LDF探头并保持其稳定位置的微操作器。

2. 外科准备

  1. 用3.5%异苯二苯和30%O2补充剂在诱导室中称量大鼠并麻醉动物。
  2. 从感应室中取出动物，用30%O2补充剂代替麻醉面膜，提供1.5~3%异苯二苯。
  3. 将大鼠放在保持在37°C的循环水毯上，用脚趾捏检查反射，以确保有退能反射。在双眼涂上无菌性眼膏，防止角膜干燥。
  4. 下颌骨顶部、腹颈区域和股骨三角形。从这些区域去除任何松散的头发，用酒精清洁。
  5. 将大鼠置于加热垫上，并用循环温水泵将动物的体温保持在37°C，并用医用胶带将其暂时固定到垫子上。
  6. 安装气管管管（PE240聚乙烯管）通过颈部的腹腔切口，如其他地方26所述。
  7. 将气管管连接到末端潮汐 CO2监视器和呼吸机，提供 2.5-3.0% 异氟胶（取决于动物大小）和 30% O2吸入补充剂。确保设置和监测呼吸速率、吸气时间和分钟通气量，以确保在整个实验中，过期的末端潮汐 CO2约为 35 mmHg。
    注：这通常以大约48~60次呼吸/分钟、1.70~2.30 mL的潮汐量和250~300克大鼠的灵感时间为0.50~0.60秒实现。
  8. 在等向NaCl溶液中填充两个PE50聚乙烯管扣，加入1U/mL肝素，以防止凝固并保持导管的聚碳酸性。填充后，用手术剪刀将每个导管的开端斜角，以方便插入动脉。
  9. 如其他地方27所述，将左右股动脉的导管进行分管，以便持续监测一导管中的动脉压力，并从另一导管中抽血。
    1. 在解剖显微镜下小心地将动脉与周围组织分离后，将动脉的远端缝合，并在动脉的中间和近端周围放置两个额外的缝合线，而不会拧紧结。
    2. 使用近端缝合作为提升结扎，以防止在切口后从动脉出血，以插入导管（步骤 2.11）。
  10. 将从导流板制成的 V 形导线插入动脉下方，以便遮挡容器，直到套管牢固。
  11. 在解剖显微镜下，使用Vannas剪刀在远端结扎附近的股动脉上做一个小切口。将切口的切口插入切口，并将其推进到股动脉中。拧紧中间连结上的结，将管紧固定到位，这样当提起连结或回形针被移除时，不会因动脉压力而脱落。
  12. 拧紧中间连字后，松开提升连字上的张力和/或取出回形针，并拧紧近端连字。
  13. 用细缝合线（3+0 真丝）或手术钉关闭切口。或者，根据切口的大小，在切口部位上放置潮湿的纱布。

3. 用于 LDF 测量的骷髅变薄

  1. 在导管到位后，立即将动物置于一个胸腔位置，并将头部固定在立体装置中，小心不要拔下导管或气管管。
  2. 使用手术剪刀在覆盖颅骨的皮肤中做椭圆形切口。使用棉签去除任何结缔组织，确保颅骨清洁干燥。在头皮切口周围放置一小块拉长和滚动的纸巾，以阻止任何出血。
  3. 在解剖显微镜下，使用 Dremel 工具或具有 2.15 mm 钻头的牙科钻头，在左体感觉皮质的骨骼区域（大约 0.5-1 厘米，取决于大鼠的大小）中薄一小段骨。
    注意：缓慢小心地薄骨，以避免穿透头骨。执行此步骤时，应自由应用盐水溶液，以防止区域过热。
  4. 一旦头骨变薄，区域呈粉红色外观和/或血管可视化，用矿物油覆盖区域，并使用微操作器将激光多普勒探头置于暴露的脑微循环上，使探头的尖端正好接触矿物油池的顶部（图1）。
    注：在没有任何外部振动会干扰激光多普勒读数且探头在整个实验过程中牢固地固定在同一目标区域的区域进行 LDF 测量至关重要。

4. 评估脑血管自动调节

  1. LDF 探头固定到位后，在开始实验前留出 30-45 分钟的平衡周期。平衡期后，每 30 秒测量平均动脉压力 （MAP） 和激光脑血流 （LCBF） 2 分钟，并平均值以获得出血前血压和 LCBF 的基线值。
  2. 要评估脑血管自动调节对动脉压力降低的反应，测量LCBF和MAP后连续从股动脉11提取1.5 mL的血液。要保留导管专利，请确保每次抽血后注入的肝素溶液（100 U/mL，以等同盐水表示）大约等于导管体积。
    注：当注入肝素溶液以保持导管控制时，重要的是将肝素溶液的体积与导管的体积尽可能匹配，以防止动物收到过多的肝素，这可能导致不必要的出血。
  3. 每次取血后，让大鼠平衡2分钟，之后MAP和LCBF每30秒记录2分钟。 重复血量提取，直到动物达到大约20毫米汞柱的MAP。
  4. 通过确定从出血前 MAP 到 LLA 的血压范围（步骤 4.5 和 5.3，下文），确定有效的自动调节范围。
  5. 通过确定 LCBF 在血量戒断后仍返回到出血前控制值的 20% 以内的最低压力，确定LLA，或者通过识别在自动调节的高原阶段和 LLA 以下确定的回归线的交点，LCBF 随着每次连续采血而减少（步骤 5.3，下图）。
    注：定义LLA和自动调节高原的标准可能因实验室（例如，Takada等人28与Jones等人29）以及降低动脉血压的程序（例如，提取特定量的血液与控制出血达到特定的动脉压力水平）11不同。
  6. 在实验结束时，根据IACUC的批准，在麻醉的手术平面下，通过制造双边肺气肿对动物实施安乐死。
  7. 动物被安乐死后在组织中获得的LDF值将为实验设置提供零基线流动值。

5. 统计分析

  1. 执行线性回归分析，以评估 LDF 值与其相应的动脉压力之间的相关性。使用动物安乐死后获得的基线 LDF 读数，以确保没有影响测量流量的非特定 LDF 信号。
  2. 使用自动调节高原上方和下方的回归线之间的交点计算 LLA。要使用此方法计算 LLA，请将两个回归方程组合起来，并求解动脉压力的结果方程。
  3. 在比较不同的实验组时，使用线性回归分析计算每个动物的LLA上方和下方的LDF与动脉压力关系的斜率，并将其总结为该实验组中动物的均值= SEM。

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Representative Results

图2总结了10只雄性斯普拉格-道利大鼠喂食标准实验室的试验结果。在这些实验中，平均LCBF在前三次血量戒断后保持在出血前值的20%以内，直到平均动脉压力达到LLA。随后在LLA以下压力下抽取血量导致LCBF逐渐减少，表明脑循环不再能够产生足够的血管扩张水平，以维持在较低的灌注压力下脑血流恒定。

图 3总结了高原相中的平均动脉压力和 LCBF 之间的关系（MAP >65 mmHg）与 CBF 自动调节的补偿相 （MAP <65 mmHg）。在LLA或高于LLA的压力时，LCBF与动脉压力（r2 = 0.0246;p = 0.3534）之间没有显著的相关性，表明LCBF在自动调节曲线的高原范围内与动脉压力无关。在LLA之下，LCBF/动脉压力关系为负斜率，LCBF与动脉压力显著相关（r2 = 0.7907;p = 8.7 x 10±25）。

Figure 1
图1：将激光多普勒探头放置在麻醉大鼠的薄头骨上。具有LDF探头的立体仪器中的大鼠，位于头骨的薄区域，用微操作器保持到位。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2：脑血流自动调节，以因出血引起的动脉血压下降。汇总了大鼠的血量戒断和 （A） 平均动脉压力 （MAP） 和 （B） 激光脑血流 （LCBF） 之间的关系，大鼠喂食标准饮食，并连续抽取血量。数据以平均值显示为 n = 6+10 后每次血量戒断。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图3：平均动脉压力与激光脑血流的关系。显示自动调节响应（n = 37 观测值）的高原阶段和响应的补偿阶段（n = 70 观测值）期间的关系，其中动脉压力低于 LLA （+65 mmHg）。LCBF在自动调节的去补偿阶段（r2 = 0.7907;p = 8.7 x 10=25）与 MAP 高度相关，但在自动调节的高原阶段（r2 = 0.0246;p = 0.3534）没有。请点击此处查看此图的较大版本。

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Discussion

使用激光多普勒流量测定 （LDF） 评估组织血流反应。如上所述，LDF 信号与微循环中移动粒子的数量和速度成正比，在这种情况下为 RBC。不同器官的LDF读数与电磁流量计和放射性微球30等既定方法评估的全器官血流密切相关，与评价可点化动脉制剂10、31、32、33、34和原位微循环制剂35、36活性音调节的研究基本一致。

在进行大脑自动调节研究，并可能在其他血管病床上进行自动调节时，一个考虑因素是麻醉对自动调节反应的潜在影响。虽然大脑自动调节存在于当前的研究和我们组11的早期研究中，并且与HS饮食对脑阻力动脉31、32、37的血管扩张器反应的已知影响一致，大鼠 据报道，皮奥勒35和仓鼠脸颊袋36的原位动脉麻醉具有强血管扩张器作用38，引起心血管抑制据报道，在小鼠40、41中，也导致脑血管自调节损失，因此一些研究者单独使用α-氯盐麻醉41或与聚氨酯42联合研究脑自调节。

RBC 的数量和速度在微循环床内、个体之间以及个体受试者内随时间而变化。因此，LDF不提供器官或其微循环、不同器官之间或微循环不同区域的血液流动的绝对值。因此，必须牢牢固定 LDF 探头，使其保持在相同的位置，并且在整个实验中不会受到任何振动。为了准确评估大脑血流的变化，大鼠的头部被定位在立体仪器中，LDF探头被放置在颅骨薄区域的微操作器中，以防止运动伪影，并保持探头相对于所研究区域的位置（图1）。探针离开其初始位点的任何移动都会产生由组织不同区域的血流决定的信号，从而阻碍比较。虽然LDF没有提供绝对血流的测量，但当正确执行时，它仍然是评估整个血管床30水平上血流调节的一种方便和有价值的方法，并且LDF流量相对于控制值的相对增加或减少的幅度可以进行统计比较。

脑血流的自动调节。脑循环通常可以承受动脉血压的较大变化，当动脉压力升高时引起血管收缩，当动脉压力通过自动调节机制降低动脉压力时，血管扩张。这些机制对于防止全身血压升高时颅内压力的危险增加以及当动脉压力降低时维持足够的组织灌注和氧气供应至关重要。目前的实验侧重于自动调节机制在动脉压力降低时保持脑血流恒定的能力（而不是随着MAP的增加，大脑循环保持恒定血流的能力），尽管LDF非常有价值，并且被广泛用于后者的研究。该实验设计的另一个宝贵应用是研究出血期间和各种形式的循环休克43、44、45、46的微血管血流。

在出血引起的动脉压力降低期间，LCBF 的自动调节通过比较每次戒血后 2 分钟的 LDF 流量和 MAP 与出血前控制 MAP 和 LCBF 在戒血前测量的 LCBF 进行比较。此时，自动调节机制将起到扩张微血管作用，以在较低的灌注压力下保持血流。LLA 被确定为最低 MAP，其中自动调节机制仍然能够恢复血液流动，尽管灌注压力降低。在低于LLA的动脉压力下，自动调节机制已经达到极限，不能再扩张脑血管，足以防止脑血流进一步减少。LLA通过后，每次抽血达到新压力11后，LCBF从出血前值显著和逐步降低。通过比较LCBF与LLA前后的动脉压力关系和自动调节的高原阶段宽度（定义为出血前MAP和LLA之间的动脉压力范围）来评估脑血管自动调节对动脉血压降低的有效性。例如，最近一项评估HS饮食对大脑自调节的影响的研究发现，在动脉压力持续下降至低至40-50 mmHg值的大鼠中，用低盐（LS;0.4%NaCl）饮食喂养的大鼠的脑血流量维持在恒定水平。这一发现与先前对健康大鼠LLA的估计一致，16，47。然而，脑血流的高原阶段自动调节在诺氏体Sprague-Dawley大鼠喂食短期（3天）和慢性（4周）高盐（HS;4%NaCl）饮食逐渐减少，动脉压力连续减少，表明HS饮食消除了高原阶段的血流调节，通常存在于健康不通的大鼠，并不利于脑循环的能力，以保持组织灌注在血压下降11。研究发现，在喂食HS饮食的大鼠中，大脑血流在降低血压时受损的自动调节与研究结果显示，饮食盐的增加会损害抗性动脉的松弛31、32、33、34、37和动脉35、36的诺莫斯特大鼠和仓鼠。

除了提供有关微循环自动调节其血流的能力的宝贵见解外，LDF 测量还可用于各种应用，提供常规方法（如微球和电磁流探头）无法动态估计的血流控制。例如，LDF 测量在评估微循环对血管活性刺激（如 ACh 输注和其他血管活性剂的给给作用剂 31、32、33、34、37、高动脉 pCO210、缺氧 17、48、神经血管耦合以响应感觉刺激 21、49、功能）的反应时极为有价值高血症在大脑20，并评估组织对出血性下压力和各种循环休克43，44，45，46的组织反应。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

作者衷心感谢卡利·科扎克、梅根·斯图普夫和杰克·布力斯在完成这项研究和准备手稿方面给予的出色帮助。资助：NIH #R01-HL128242、#R21-OD018309和#R21-OD024781。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-0 braided black silk suture Midwest Vet 193.73000.2
Arterial Pressure Transducer Merit Medical 041516504A
Automated Data Acquisition Systems (WINDAQ & BIOPAC system) DATAQ Instruments
Blood Pressure Display Unit Stoelting 50115
Circulating warm water pump Gaymar Industries T-pump
End-tidal CO2 monitor Stoelting Capstar-100
Heparin Sodium Midwest Vet 191.46720.3
Kimwipe Fisher Scientific 06-666A
Laser Doppler Flow Meter Perimed PeriFlux 5000 LDPM
Laser Doppler Refill Motility Standard Perimed PF1001
Polyethylene Tubing (PE240) (for trachea cannula) VWR 63018-828
Polyethylene Tubing (PE50) (for femoral catheters) VWR 63019-048
Rodent Ventilator Cwe/Stoelting SAR-830/P
Saline Midwest Vet 193.74504.3
Sprague-Dawley Outbred Rats Variable N/A Rats were ordered from various companies
Standard Rat Chow Dyets, Inc. 113755
Stereotaxic Instrument Cwe/Stoelting Clasic Lab Standard

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使用激光多普勒流测量测量大鼠脑血流自动调节的评估
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Allen, L. A., Terashvili, M., Gifford, A., Lombard, J. H. Evaluation of Cerebral Blood Flow Autoregulation in the Rat Using Laser Doppler Flowmetry. J. Vis. Exp. (155), e60540, doi:10.3791/60540 (2020).

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