Summary
Præsenteret her er en protokol til påvisning af makrofag ekstrellulær fælde (MET) produktion i levende cellekultur ved hjælp af mikroskopi og fluorescens farvning. Denne protokol kan udvides yderligere til at undersøge specifikke MARKEDSført protein markører ved immunofluorescens farvning.
Abstract
Frigivelsen af ekstracellulære fælder (ETs) med neutrofiler er blevet identificeret som en medvirkende faktor til udviklingen af sygdomme relateret til kronisk inflammation. Neutrofileter (NETs) består af et net af DNA, Histon proteiner og forskellige granulater (dvs. myeloperoxidase, elastase og cathepsina G). Andre immunceller, herunder makrofager, kan også producere ETs; men i hvilket omfang dette sker in vivo, og om makrofag ekstracellulære fælder (METs) spiller en rolle i patologiske mekanismer er ikke blevet undersøgt i detaljer. For bedre at forstå rollen af METs i inflammatoriske patologier blev der udviklet en protokol til visualisering af markedsført frigivelse fra primære humane makrofager in vitro, som også kan udnyttes i immunofluorescens eksperimenter. Dette giver mulighed for yderligere karakterisering af disse strukturer og deres sammenligning med ETs frigivet fra neutrofiler. Humane monocyte-afledte makrofager (HMDM) producerer METs ved udsættelse for forskellige inflammatoriske stimuli efter differentiering til M1 Pro-inflammatorisk fænotype. Frigivelsen af METs kan visualiseres ved mikroskopi ved hjælp af en grøn fluorescerende nukleinsyre pletter, der er imperment til levende celler (f. eks SYTOX grøn). Brug af frisk isolerede primære makrofager, såsom HMDM, er fordelagtigt i modellering in vivo inflammatoriske hændelser, der er relevante for potentielle kliniske anvendelser. Denne protokol kan også anvendes til at studere mødte frigivelse fra humane monocyt cellelinjer (f. eks, THP-1) efter differentiering i makrofager med phorbols myristate acetat eller andre makrofag cellelinjer (f. eks murine makrofag-lignende J774A. 1 celler).
Introduction
Frigivelsen af ETs fra neutrofiler blev først identificeret som en medfødte immunrespons udløst af bakteriel infektion1. De består af en DNA-rygrad, som forskellige granulat proteiner med antibakterielle egenskaber er bundet til, herunder neutrofilelastase og myeloperoxidase2. Den primære rolle for neutrofileter (NETs) er at fange patogener og lette deres eliminering3. Men ud over den beskyttende rolle af ETs i immunforsvaret, et stigende antal undersøgelser har også opdaget en rolle i sygdoms patogenese, især under udviklingen af betændelse-drevne sygdomme (dvs. reumatoid arthritis og åreforkalkning4). Frigivelsen af ETS kan udløses af forskellige pro-inflammatoriske cytokiner, herunder interleukin 8 (Il-8) og tumor nekrose faktor Alpha (tnfα)5,6, og den lokaliserede ophobning af ETS kan øge vævsskader og fremkalde en Pro-inflammatorisk respons7. For eksempel, ETs har været impliceret som spiller en kausal rolle i udviklingen af åreforkalkning8, fremme trombose9, og forudsige hjerte-kar-risiko10.
Det er nu anerkendt, at ud over neutrofiler, andre immunceller (dvs., mastceller, eosinofile, og makrofager) kan også frigive ETS på udsættelse for den mikrobielle eller pro-inflammatoriske stimulation11,12. Dette kan være særlig vigtigt i tilfælde af makrofager, i betragtning af deres centrale rolle i udviklingen, reguleringen, og løsning af kroniske inflammatoriske sygdomme. Derfor er det vigtigt at få en større forståelse af det potentielle forhold mellem ET udslip fra makrofager og betændelse-relaterede sygdomsudvikling. Nylige undersøgelser har vist tilstedeværelsen af METs og NETs i intakt menneskelige aterosklerotiske plaques og organiseret trombi13. På samme måde har METs været impliceret i at køre nyreskade gennem reguleringen af inflammatoriske responser14. Men i modsætning til neutrofiler er der begrænsede data om mekanismerne for MARKEDSført dannelse fra makrofager. Nylige undersøgelser med humane in vitro-modeller af MARKEDSført dannelse viser nogle forskelle i de veje, der er involveret i hver celletype (dvs. med hensyn til fraværet af Histon citrulklination med makrofager)6. Men, nogle har vist, at netto frigivelse kan også forekomme i fravær af Histon citrulination15.
Det overordnede mål med denne protokol er at tilvejebringe en enkel og direkte metode til vurdering af frigivelse af markedsøkonomisk behandling i en klinisk relevant makrofag-model. Der er en række forskellige in vitro-makrofag cellemodeller, der er blevet brugt til at studere METs (dvs. den humane monocyt cellelinje i THP-1 og forskellige murine makrofag cellelinjer)16. Der er nogle begrænsninger forbundet med disse modeller. For eksempel, differentieringen af THP-1 monocytter til makrofager normalt kræver en priming trin, såsom tilsætning af phorbols myristate acetat (PMA), som selv aktiverer protein kinase C (PKC)-afhængige veje. Denne proces er kendt for at udløse ET Release4 og resulterer i en lav basal met frigivelse fra THP-1 celler. Andre undersøgelser har fremhævet nogle forskelle i Bioaktivitet og inflammatoriske reaktioner, som er monteret af makrofager in vivo sammenlignet med PMA-behandlede THP-1-celler17.
Tilsvarende, adfærd og inflammatoriske reaktioner af forskellige murine makrofag-lignende cellelinjer ikke helt repræsentere respons spektrum af primære humane makrofager18. Med henblik på at undersøge makrofag ET dannelse i kliniske omgivelser menes primære humane monocyte-afledte makrofager (Hmdm'er) at være en mere relevant model snarere end monocytiske eller murine makrofag-lignende cellelinjer.
ET udslip fra M1 polariserede Hmdm'er er blevet påvist efter eksponering af disse celler for en række forskellige inflammatoriske stimuli, herunder den myeloperoxidaseafledte oxidant hypochlorøse syre (HOCl), PMA, TNFα og IL-86. Beskrevet her er en protokol til polarisere HMDMs til M1 fænotype og visualisere efterfølgende MØDTE frigivelse ved udsættelse for disse inflammatoriske stimuli. PMA anvendes som et incitament for markedsført frigivelse til at lette sammenligninger med tidligere undersøgelser, der har brugt neutrofiler. Vigtigere, HOCl, IL-8, og TNFα bruges også til at stimulere MET frigivelse, som menes at være bedre modeller af det inflammatoriske miljø in vivo. Den mikroskopiske metode til visualisering af ET-udslip indebærer farvning af det ekstracellulære DNA i levende cellekulturer ved hjælp af SYTOX grøn, en uigennemtrængelig fluorescerende grøn nukleinsyre bejdsning, der er blevet anvendt med succes i tidligere neutrofilundersøgelser. Denne metode giver mulighed for hurtig og kvalitativ vurdering af ET udslip, men det er ikke hensigtsmæssigt som en stand-alone metode til kvantificering af ET Release omfang. Der bør anvendes alternative metoder, hvis der kræves kvantificering for at sammenligne omfanget af ET udslip, der skyldes forskellige behandlingsforhold eller indgreb.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
HMDM blev isoleret fra Human Buffy coat præparater leveret af Blood bank med etik godkendelse fra Sydney Local Health District.
1. HMDM-kulturen
- Isoler monocytterne fra Buffy coat præparater fremstillet af det perifere blod af raske humane donorer ved hjælp af en kommercielt tilgængelig forberedelse til at isolere lymfocytter, efterfulgt af modstrøms centrifugal elutriation19, 20.
- Bekræft tilstedeværelsen af monocytter ved cytospinning og farvning med modificeret Giemsa plet til monocyt karakterisering19.
- Under sterile forhold, justere tætheden af monocytter til 1 x 106 celler/ml ved hjælp af rpmi-1640 medier uden serum. Tilsæt 1 mL af denne cellesuspension til hver brønd af en 12 brønd vævskultur plade. Kultur i en celle inkubator ved 37 °C ved tilstedeværelse af 5% CO2 i 2 timer for at fremme tilslutningen til vævskultur pladen.
- Under sterile forhold skal du fjerne celle mediet og udskifte det med komplette RPMI-1640-kultur medier, der indeholder 10% (v/v), samlet humant serum og 20 mM L-glutamin.
- Kultur cellerne ved 37 °C i nærværelse af 5% CO2 i en celle inkubator i 8 dage, ændre medierne hver 2 dage.
2. polarisering af HMDM
- Under sterile forhold forberedes M1-priming-mediet ved tilsætning af interferon γ (IFNγ; 20 ng/mL) og lipopolysaccharid (LPS; 1 μg/mL) til det komplette RPMI-1640-kultur medie. Forbered m2-priming-mediet ved at tilsætte interleukin 4 (IL-4; 20 ng/mL) til det komplette RPMI-1640-kultur medie.
- Under sterile forhold aspirerer du medier fra vævskultur pladens brønde, der indeholder HMDM, som er seedet og dyrket som beskrevet i punkt 1.
- Vask forsigtigt brøndene, der indeholder cellerne 3x med steril PBS (forvarmet til 37 °C), ved hjælp af 1 mL aliquoter af PBS.
- Der tilsættes 1 mL af enten M1-eller m2-priming-mediet til hver brønd indeholdende HMDM (alt efter hvad der er relevant for forsøget).
- Cellerne inkubates i 48 h ved 37 °C i nærværelse af 5% CO2 i en celle inkubator.
3. stimulering af HMDM for at inducere MARKEDSført frigivelse
- Under sterile forhold forberedes dyrkningsmediet med forskellige stimulatorer af markedsført frigivelse (alt efter hvad der er relevant for forsøget) til det komplette RPMI-1640-medie: PMA (25 nM), humant rekombinant TNFα (25 ng/mL) eller humant rekombinant IL-8 (50 ng/mL ).
- Ved forsøg med HOCl stimulation forberedes HOCl (200 μM) i HBSS (forvarmet til 37 °C) umiddelbart før tilsætning til cellerne. Sørg for, at HOCl ikke er forberedt i komplette celle medier.
Bemærk: Koncentrationen af stamopløsningen af HOCl kvantificeres ved måling af opløsningens UV-absorbans ved 292 nm og pH = 116 og ved anvendelse af en ekstinktionskoefficient på 350 M-1cm-121. - Efter den polariserings behandling, der er beskrevet i afsnit 2, aspirerer du celle mediet fra hver brønd og vasker forsigtigt cellerne 3x med 1 mL aliquoter af enten: steril PBS (for PMA, TNFα og IL-8) eller HBSS (for HOCl), som er blevet forvarmet til 37 °C.
- Til forsøg med PMA, TNFα eller IL-8: Tilsæt 1 mL af det komplette medie, der indeholder PMA, TNFα eller IL-8 efter fjernelse af PBS i det sidste vaske trin.
- Til forsøg med TNFα Inkuber cellerne i 6 timer ved 37 °C i nærværelse af 5% CO2 i en celle inkubator. Til forsøg med PMA og IL-8 Inkuber cellerne i 24 timer ved 37 °C i nærværelse af 5% CO2 i en celle inkubator.
-
Til forsøg med HOCl tilsættes 1 mL HOCl i HBSS efter fjernelse af HBU'ERNE i det sidste vaske trin. Derefter Inkubér cellerne i 15 min ved 37 °C i nærværelse af 5% CO2 i en celle inkubator.
- Aspirer forsigtigt cellen supernatanten og vask cellerne 3x med 1 mL aliquoter af HBSS som beskrevet i trin 3,3.
- Efter fjernelse af HBSS fra det sidste vaske trin tilsættes 1 mL komplet RPMI-1640 kultur medier. Derefter Inkubér cellerne i 24 timer ved 37 °C i nærværelse af 5% CO2 i en celle inkubator.
4. visualisering af MET i levende cellekultur
- Forbered SYTOX grøn farvestof i HBSS i en koncentration på 40 μM.
- Ved afslutningen af de behandlinger, der er beskrevet i afsnit 3 for at inducere MARKEDSført frigivelse, tilsættes direkte 25 μL 40 μM af farvestoffet til hver brønd indeholdende HMDM.
- Inkuber celler ved stuetemperatur (RT) i 5 minutter i mørke.
- HMDM placeres i vævskultur brønde på mikroskop stadiet af et inverteret fluorescerende mikroskop til billeddannelse.
-
Mikroskop procedurer
- Tænd for en bredspektret fluorescerende lyskilde, lysfelt-lyskilde og inverteret mikroskop installeret med et digitalt farvekamera med høj opløsning (Se tabel over materialer).
- Drej filter hjulet til "nummer 2" positionen for grøn fluorescens (excitation = 504 nm, emission = 523 nm) til billeddannelse af de grønne bejdsede prøver indeholdt i vævskultur brøndene.
- Ved hjælp af 5x mål, fokusere billedet med grove fokus, så det fine fokus knopper på mikroskopet, indtil billedet vises skarp, klar, og fokuseret, når de ses gennem mikroskopet okular.
- Skift mikroskop til kameraets tilstand.
- Start den tilknyttede software.
- Vælg fanen Optag på softwaren.
- Klik på knappen Afspil for at få vist billedet og justere fine Focus-knappen på mikroskopet, indtil billedet vises skarpt, klart og fokuseret i software eksempelvinduet.
- Klik på knappen Optag .
Bemærk: Det optagne billede vil automatisk blive vist i den medfølgende software. - I softwaren, klik på fil | Gem som den ønskede billedfiltype.
- På mikroskopet skal du rotere filter hjulet til "nummer 5"-positionen for lysfelt Imaging og gentage trin 4.5.2-4.5.9 for at få det tilsvarende billede i lysfelt.
- Gentag trinene 4.5.2-4.5.10 efter behov for efterfølgende billed erhvervelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Brightfield-billeder, der viser de morfologiske ændringer af HMDM som reaktion på stimuli for Celledifferentiering, vises i figur 1. M1 polariserede makrofager fra eksperimenter med HMDM eksponeret for IFNγ og LPS viste en aflang og spindel-lignende celle form, som indikeret af de sorte pile i figur 1 (midterste panel). Til sammenligning var morfologien af m2 polariserede makrofager efter eksponering af HMDM til IL-4 for 48 h typisk rund og flad, som indikeret af de sorte pile i figur 1 (længst til højre panel).
Muligheden for differentierede HMDM-fænotyper til frigivelse af METs blev visualiseret af levende celle fluorescens Imaging med SYTOX Green, som vist i figur 2. Figur 2a viser de kontroldata, der er indhentet fra hver hmdm-fænotype, som inkuberet i 24 timer, hvis der ikke er nogen pro-inflammatoriske stimuli. I dette tilfælde var der meget begrænset grøn farvning, som det var forventet, givet cellen imperment karakter af denne plet. Figur 2b viste positiv farvning for METs, som følge af eksponeringen for M1-Hmdm'er til HOCL, PMA, Il-8 eller tnfα. METs er indikeret med de hvide pile, vist som grønne striber, som følge af strengene af ekstracellulær DNA. Med HOCl, ud over farvning ekstracellulære DNA, der var nogle grønne pletter tilsyneladende i cellerne. Denne cellulære farvning blev også observeret til en vis grad med de andre stimuli og menes at afspejle tab af membran integritet som følge af ET-uafhængig celledød som følge af behandlingen betingelser.
Figur 2b viser også de tilsvarende eksperimenter udført med m2 HMDMs, som blev EKSPONERET for Il-4. I dette tilfælde var der ingen frigivelse af DNA fra cellerne, som indikeret af fraværet af strengene/striber af ekstracellulær DNA; selv om, der var nogle cellulære optagelse af grønne fluorescerende farvestof med HOCl og TNFα. Til sammenligningsformål viser figur 3 repræsentative data, der indikerer, at de er blevet overført fra THP-1-makrofager, som er eksponeret for TNFα (50 ng/ml) i 4 timer. I dette tilfælde skal det bemærkes, at en ikke-polariseret population af celler blev anvendt, og THP-1 monocytter blev differentieret til makrofager ved forbehandling med PMA (50 ng/mL for 72 h) som beskrevet tidligere22.
Figur 1: morfologiske ændringer af differentielt polariserede Hmdm'er. Repræsentative lysfelt-billeder fra ikke-differentierede og differentierede hmdm'er (n ≥ 5). Hmdm'er blev dyrket med komplette medier indeholdende humant serum og glutamin i 8 dage før priming til M1 eller m2 fænotype ved udsættelse for henholdsvis IFNγ og LPS eller IL-4 for 48 h. Scale bar = 200 μm. Pile indikerer eksempler på celler, der viser morfologiske egenskaber for M1 eller m2 Hmdm'er. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: METs produceret af M1 Hmdm'er efter HOCl, PMA, Il-8 og TNFα stimulation. Repræsentative billeder af SYTOX grønne bejdsede Hmdm'er fra (A) ikke-stimuleret M1 og m2 hmdm'er inkuberet i 24 timer i fravær af inflammatoriske stimuli blev brugt som kontrol, hvilket viser FRAVÆRET af markedsført frigivelse. B) M1 og m2 Hmdm'er blev behandlet med 1) hocl (200 μM, 15 min.), PMA (25 nm) eller Il-8 (50 ng/ml) med inkubation for 24 h eller 2) TNFα (25 ng/ml) med inkubation i 6 timer for at INDUCERE markedsført frigivelse. METs blev visualiseret ved tilsætning af SYTOX grøn, som indikeret af hvide pile i det øverste panel fra M1 HMDMs. Der blev ikke set nogen METS i de tilsvarende eksperimenter med m2 Hmdm'er. data er repræsentative for replikate kultur brønde fra n ≥ 3 individuelle donorer. Scale bar = 500 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: METs fremstillet af ikke-polariserede THP-1-makrofager efter TNFα-stimulation. Repræsentative billeder af SYTOX-grøn farvede TNP-1-makrofager, som blev differentieret ved forbehandling med PMA (50 ng/mL for 72 h) før yderligere inkubation i 4 timer i fravær eller tilstedeværelse af TNFα (50 ng/mL) for at inducere MARKEDSført frigivelse. METs blev visualiseret ved tilsætning af SYTOX grøn. Data er repræsentative for replikate kultur brønde fra n ≥ 3 eksperimenter. Scale bar = 100 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Generering og visualisering af MARKEDSført dannelse ved hjælp af M1-differentierede Hmdm'er er en ny in vitro-model, der kan være nyttig til at undersøge den potentielle patologiske rolle for disse makrofagstrukturer, især under Kronisk inflammatorisk Betingelser. Det giver en robust protokol til stimulering af primære humane makrofager at frigive METs, som også kan udnyttes i relaterede undersøgelser med humane monocyt eller murine makrofag cellelinjer. Den vellykkede gennemførelse af denne protokol til stimulering af markedsført dannelse af HMDM er afhængig af omhyggelig cellekultur og håndtering for at opretholde en god cellelevedygtighed. Dette vil øge omfanget og kvaliteten af METs observeret. For at give bedre celle ernæring, de RPMI medier, der anvendes til at vedligeholde HMDM bør indeholde humant serum, snarere end føtal kvægserum, samt L-glutamin. Hver stamopløsning af dette komplette RPMI-medie skal anvendes inden for 1 uge. Korrekt opbevaring af medierne er også vigtigt. Mediet skal opbevares ved 4 °C i fravær af lys.
Derudover er det vigtigt regelmæssigt at observere og overvåge cellernes form og morfologi ved mikroskopi under dyrkning af HMDM. Enhver unormal eller uventet ændring i celle form observeret før tilsætning af IFNγ og LPS eller IL-4 (at polarisere makrofager) kan indikere en reduktion i cellens overlevelsesrate. HMDM bør være overholder og ikke formere. Det er derfor vigtigt at overvåge cellerne for eventuelle ændringer i morfologi, celletæthed, eller tab af overholdelse i den normale 8 dage kultur periode. Et dramatisk fald i celletætheden i de første 2 dage efter isolationen tyder på, at de resulterende Hmdm'er muligvis ikke er tilstrækkeligt rentable til efterfølgende forsøg. En begrænsning af brugen af primære humane celler er variationen mellem donorer, som kan have markant indflydelse på omfanget af frigivelse af markedsøkonomisk behandling. Desuden kan kvaliteten af Buffy coat præparater modtaget til isolering af monocytter variere. Det er vigtigt at gentage eksperimenter med mindst tre individuelle celledonorer for at sikre, at data er repræsentative for større populationer af celler.
Det er vigtigt at bemærke, at den protokol, der er beskrevet for hmdm-differentiering, er blevet optimeret for celler isoleret fra humane Buffy coat præparater ved modstrøms elutriation, hvilket resulterer i en høj renhed monocyt forberedelse. Validering af polariserings behandlinger (for at bekræfte fænotype) ved flowcytometri og vurdering af ekspression af M1 markør CD86 og m2 markør CD206 er blevet udført tidligere ved hjælp af dette præparat af HMDM6. Det er værd at bemærke, at denne isolationsmetode ikke kan være alment tilgængelig, og at alternative isolations metoder (dvs. magnetisk perle sortering) kan være at foretrække. Hvis der anvendes en alternativ kilde af monocytter eller forskellige isolations protokoller, anbefales yderligere flow cytometri-eksperimenter for at validere fænotype ændring, og nogle optimering af behandlingsbetingelserne for at stimulere frigivelse af markedsøkonomisk behandling kan være påkrævet.
For optimale fluorescensbilleder skal eksponeringstid justeres omhyggeligt og holdes så kort som muligt for at undgå baggrunds fluorescens og farvning af artefakter fra plast kultur pladerne, som har overflader. Det er vigtigt at tage flere billeder fra hver brønd indeholdende celler. Det er fordelagtigt, hvis prøverne er blændet før Fluorescens mikroskopi analyse. Ud over farvning ekstracellulære tråde af DNA, der er også beviser for cellulære optagelse af SYTOX grøn. Dette menes at afspejle et tab i membran integritet, som kan være på grund af MET frigivelse, og det kan også afsløre alternative veje af celledød (Se også nedenfor). Dette understreger vigtigheden af at udføre yderligere eksperimenter for at kvantificere og yderligere karakterisere MET Release.
For en kvantitativ sammenligning af omfanget af MARKEDSført frigivelse under forskellige behandlingsbetingelser eller efter forskellige indgreb for at moduere MARKEDSført frigivelse, yderligere analyse er påkrævet. Dette kan opnås ved at udføre qPCR analyse af nukleare og mitokondrie DNA til stede i cellen supernatants, som beskrevet tidligere6. Denne metode er normalt kombineret med laktat dehydrogenase frigivelse assays til kontrol for celle lysis ikke relateret til MET Release6. Den grønne farvning af SYTOX kan også kvantificeres af en fluorescens plade læser efter DNase-behandling for delvist at fordøje METs og frigive dem fra kultur pladerne. Denne metode har været anvendt i udstrakt grad i tidligere arbejde med neutrofilnet1,2,23.
De fremtidige anvendelser af denne protokol vedrører tilvejebringelse af muligheder for yderligere karakterisering af METs ved hjælp af immun histokemi. Det vil være muligt at sonde protein sammensætningen af METs ved hjælp af denne tilgang med målrettede antistoffer (dvs. mod citrullinerede histoner eller MPO) for at få yderligere indsigt i rollerne af disse strukturer i mere komplekse biologiske prøver. Disse eksperimenter vil også være vigtige for at kaste mere lys over afgrænsningen af MARKEDSført frigivelse efter andre former for celledød, såsom pyroptosis15. Det er værd at bemærke, at i vores erfaring, er METs fra makrofager ikke holde sig til pladerne så stærkt som net fra neutrofiler, hvilket kan gøre immunhistochemistry analyse mere udfordrende. Ikke desto mindre vil data fra disse eksperimenter være af interesse, i betragtning af at makrofager ofte spiller en dominerende rolle i kroniske inflammatoriske sygdomme. Yderligere karakterisering af disse strukturer er afgørende for at vurdere deres roller in vivo, som hidtil kun er blevet gennemført i begrænset omfang16. Det menes, at den beskrevne metode ved hjælp af hmdm til at opnå dette formål kan være mere klinisk relevant i forhold til andre udødeliggjort celle line-afledte makrofag kilder; selv om, disse cellelinjer kan have nytte i at give en mere stabil model for MET karakterisering med mindre potentiale for donor variation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af et vedvarende IMPACT tilskud (IPAP201601422) og Novo Nordisk Foundation Biomedical Project Grant (NNF17OC0028990). YZ anerkender også modtagelsen af en australsk postgraduate Award fra University of Sydney. Vi vil gerne takke Mr. pat piansarakit og MS Morgan Jones for hjælp med monocyt isolation og vævskultur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 120Q broad spectrum fluorescent light source | EXFO Photonic Solutions, Toronto, Canada | x-cite series | |
| Corning CellBIND Multiple Well Plate (12 wells) | Sigma-Aldrich | CLS3336 | For cell culture |
| Differential Quik Stain Kit (Modified Giemsa) | Polysciences Inc. | 24606 | Characterisation of monocytes |
| Hanks balanced salt solution (HBSS) | Thermo-Fisher | 14025050 | For washing steps and HOCl treatment |
| Hypochlorous acid (HOCl) | Sigma-Aldrich | 320331 | For MET stimulation |
| Interferon gamma | Thermo-Fisher | PMC4031 | For M1 priming |
| Interleukin 4 | Integrated Sciences | rhil-4 | For M2 priming |
| Interleukin 8 | Miltenyl Biotec | 130-093-943 | For MET stimulation |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | 59202C | Added to culture media |
| Lipopolysaccharide | Integrated Sciences | tlrl-eblps | For M1 priming |
| Lymphoprep | Axis-Shield PoC AS | 1114544 | For isolation of monocytes |
| Olympus IX71 inverted microscope | Olympus, Tokyo, Japan | ||
| Phorbol 12- myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | For MET stimulation |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D5652 | For washing steps |
| RPMI-1640 media | Sigma-Aldrich | R8758 | For cell culture |
| SYTOX green | Life Technologies | S7020 | For MET visulaization |
| TH4-200 brightfield light source | Olympus, Tokyo, Japan | x-cite series | |
| Tumor necrosis factor alpha | Lonza | 300-01A-50 | For MET stimulation |
References
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans. PLoS Pathogens. 5 (10), 1000639 (2009).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs. Nature Reviews in Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews in Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
- Keshari, R. S., et al. Cytokines induced neutrophil extracellular traps formation: implication for the inflammatory disease condition. PLoS One. 7 (10), 48111 (2012).
- Rayner, B. S., et al. Role of hypochlorous acid (HOCl) and other inflammatory mediators in the induction of macrophage extracellular trap formation. Free Radical Biology and Medicine. 129, 25-34 (2018).
- Gunzer, M. Traps and hyperinflammation - new ways that neutrophils promote or hinder survival. British Journal of Haematology. 164 (2), 189-199 (2014).
- Knight, J. S., et al. Peptidylarginine deiminase inhibition reduces vascular damage and modulates innate immune responses in murine models of atherosclerosis. Circulation Research. 114 (6), 947-956 (2014).
- Megens, R. T., et al. Presence of luminal neutrophil extracellular traps in atherosclerosis. Thrombosis and Haemostasis. 107 (3), 597-598 (2012).
- Doring, Y., Weber, C., Soehnlein, O. Footprints of neutrophil extracellular traps as predictors of cardiovascular risk. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (8), 1735-1736 (2013).
- Goldmann, O., Medina, E. The expanding world of extracellular traps: not only neutrophils but much more. Frontiers in Immunology. 3 (420), 1-10 (2012).
- Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte. Journal of Leukocyte Biology. 97 (6), 1023-1035 (2015).
- Pertiwi, K. R., et al. Extracellular traps derived from macrophages, mast cells, eosinophils and neutrophils are generated in a time-dependent manner during atherothrombosis. Journal of Pathology. 247 (4), 505-512 (2019).
- Okubo, K., et al. Macrophage extracellular trap formation promoted by platelet activation is a key mediator of rhabdomyolysis-induced acute kidney injury. Nature Medicine. 24 (2), 232-238 (2018).
- Boeltz, S., et al. To NET or not to NET:current opinions and state of the science regarding the formation of neutrophil extracellular traps. Cell Death and Differentiation. 26 (3), 395-408 (2019).
- Doster, R. S., Rogers, L. M., Gaddy, J. A., Aronoff, D. M. Macrophage Extracellular Traps: A Scoping Review. Journal of Innate Immunology. 10 (1), 3-13 (2018).
- Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS One. 5 (1), 8668 (2010).
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).
- Brown, B. E., Rashid, I., van Reyk, D. M., Davies, M. J. Glycation of low-density lipoprotein results in the time-dependent accumulation of cholesteryl esters and apolipoprotein B-100 protein in primary human monocyte-derived macrophages. FEBS Journal. 274, 1530-1541 (2007).
- Garner, B., Dean, R. T., Jessup, W. Human macrophage-mediated oxidation of low-density lipoprotein is delayed and independant of superoxide production. Biochemical Journal. 301, 421-428 (1994).
- Morris, J. C. The acid ionization constant of HOCl from 5 °C to 35 °C. Journal of Phyical Chemistry. 70, 3798-3805 (1966).
- Pan, G. J., Rayner, B. S., Zhang, Y., van Reyk, D. M., Hawkins, C. L. A pivotal role for NF-kappaB in the macrophage inflammatory response to the myeloperoxidase oxidant hypothiocyanous acid. Archives of Biochemistry and Biophysics. 642, 23-30 (2018).
- Parker, H., Albrett, A. M., Kettle, A. J., Winterbourn, C. C. Myeloperoxidase associated with neutrophil extracellular traps is active and mediates bacterial killing in the presence of hydrogen peroxide. Journal of Leukocyte Biology. 91 (3), 369-376 (2012).
