Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

In vitro stimulering og visualisering av ekstracellulære Trap Release i differensiert Human monocytt-avledet makrofager

doi: 10.3791/60541 Published: November 1, 2019

Summary

Presentert her er en protokoll for å oppdage macrophage ekstracellulære felle (MET) produksjon i levende cellekultur ved hjelp mikroskopi og fluorescens farging. Denne protokollen kan videre utvides til å undersøke bestemte MET protein markører ved immunofluorescence farging.

Abstract

Utgivelsen av ekstracellulære feller (ETs) av nøytrofile har blitt identifisert som en medvirkende faktor til utvikling av sykdommer knyttet til kronisk betennelse. De nøytrofile ETs (NETs) består av et maske av DNA, histone proteiner og ulike granule proteiner (dvs. myeloperoxidase, elastase og katepsin G). Andre immunceller, inkludert makrofager, kan også produsere ETs; men i hvilken utstrekning dette skjer i vivo og om macrophage ekstracellulære feller (METs) spiller en rolle i patologiske mekanismer har ikke blitt undersøkt i detalj. For bedre å forstå rollen som METs i inflammatoriske patologi, ble en protokoll utviklet for å visualisere MET utgivelse fra primære menneskelige makrofager in vitro, som også kan utnyttes i immunofluorescence eksperimenter. Dette gjør at ytterligere karakterisering av disse strukturene og deres sammenligning til ETs løslatt fra nøytrofile. Humant monocytt makrofager (HMDM) produserer METs ved eksponering for ulike inflammatoriske stimuli etter differensiering til M1 Pro-inflammatorisk fenotype. Utgivelsen av METs kan bli mikroskopi ved hjelp av en grønn fluorescerende nukleinsyre syre flekk som er impermeant til levende celler (f. eks SYTOX grønn). Bruk av nylig isolerte primære makrofager, slik som HMDM, er fordelaktig i modellering in vivo inflammatoriske hendelser som er relevante for potensielle kliniske anvendelser. Denne protokollen kan også brukes til å studere MET utgivelse fra menneskelige monocytt cellelinjer (f. eks, THP-1) følgende differensiering inn makrofager med phorbol isopropylmyristat acetate eller andre macrophage cellelinjer (f. eks den murine macrophage-lignende J774A. 1 celler).

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Utgivelsen av ETs fra nøytrofile ble først identifisert som en medfødt immunrespons utløst av bakteriell infeksjon1. De består av en DNA ryggrad som ulike granule proteiner med anti-bakterielle egenskaper er bundet, inkludert nøytrofile elastase og myeloperoxidase2. Den primære rollen til nøytrofile ETs (NETs) er å fange patogener og tilrettelegge deres eliminering3. Men i tillegg til den beskyttende rollen ETs i immunforsvaret, har et økende antall studier også oppdaget en rolle i sykdoms patogenesen, spesielt under utviklingen av betennelse-drevne sykdommer (dvs. revmatoid artritt og aterosklerose4). Utgivelsen av ETS kan utløses av ulike Pro-inflammatorisk cytokiner inkludert interleukin 8 (Il-8) og tumor nekrose faktor Alpha (TNFα)5,6, og den lokaliserte opphopning av ETs kan øke vevsskade og fremkalle en Pro-inflammatorisk respons7. For eksempel, ETs har vært innblandet som spiller en årsakssammenheng rolle i utviklingen av aterosklerose8, fremme trombose9, og forutsi kardiovaskulær risiko10.

Det er nå anerkjent at i tillegg til nøytrofile, andre immunceller (dvs. mastceller, eosinofile, og makrofager) kan også frigi ETs på eksponering for mikrobiell eller Pro-inflammatorisk stimulering11,12. Dette kan være spesielt viktig i tilfelle av makrofager, vurderer deres nøkkelrolle i utvikling, regulering, og oppløsning av kroniske inflammatoriske sykdommer. Derfor er det viktig å få en større forståelse av den potensielle forholdet mellom ET Release fra makrofager og betennelse-relaterte sykdomsutvikling. Nyere studier har vist tilstedeværelsen av METs og NETs i intakte menneskelige aterosklerotiske plaketter og organiserte trombi13. På samme måte har METs vært innblandet i å kjøre nyreskader gjennom regulering av inflammatoriske reaksjoner14. Men i motsetning til nøytrofile, er det begrensede data på mekanismer for MET formasjon fra makrofager. Nyere studier med human in vitro-modeller av MET-formasjonen viser noen forskjeller på banene som er involvert i hver celle type (dvs. om fraværet av histone citrullination med makrofager)6. Men, noen har vist at NET Release kan også forekomme i fravær av histone citrullination15.

Det overordnede målet med denne protokollen er å gi en enkel og direkte metode for å vurdere MET utgivelse i en klinisk relevant macrophage modell. Det finnes en rekke forskjellige in vitro macrophage celle modeller som har blitt brukt til å studere METs (dvs. THP-1 menneskelige monocytt cellelinje og ulike murine macrophage cellelinjer)16. Det er noen begrensninger knyttet til disse modellene. For eksempel, differensiering av THP-1 monocytter til makrofager krever vanligvis en grunning trinn, for eksempel tilsetning av phorbol isopropylmyristat acetate (PMA), som selv aktiverer protein kinase C (PKC)-avhengige trasé. Denne prosessen er kjent for å utløse ET Release4 og resulterer i en lav basal oppfylt utgivelse fra THP-1 celler. Andre studier har fremhevet noen forskjeller i bioactivity og inflammatoriske responser montert av makrofager i vivo sammenlignet med PMA-behandlet THP-1 celler17.

Tilsvarende, atferd og inflammatoriske reaksjoner av forskjellige murine macrophage-lignende cellelinjer ikke helt representerer responsen spekteret av primære menneskelige makrofager18. Derfor, i den hensikt å undersøke macrophage ET formasjon i klinisk setting, primære menneskelige monocytt-avledet makrofager (HMDMs) antas å være en mer relevant modell i stedet for monocyttisk eller murine macrophage-lignende cellelinjer.

ET Release fra M1 polarisert HMDMs har blitt demonstrert etter eksponering av disse cellene til en rekke ulike inflammatoriske stimuli, inkludert myeloperoxidase-avledet oksiderende subsyrer syre (HOCl), PMA, TNFα, og IL-86. Beskrevet her er en protokoll for å polariserer HMDMs til M1 fenotype og visualisere påfølgende MET utgivelse ved eksponering for disse inflammatoriske stimuli. PMA brukes som en stimulans av MET utgivelse for å lette sammenligninger til tidligere studier som har brukt nøytrofile. Viktigere, HOCl, IL-8, og TNFα brukes også til å stimulere MET utgivelse, som antas å være bedre modeller av inflammatorisk miljø in vivo. Mikroskopisk metode for visualisering av ET Release innebærer farging av ekstracellulære DNA i levende cellekulturer bruker SYTOX grønn, en ugjennomtrengelig fluorescerende grønn nukleinsyre syre flekken som har blitt brukt i tidligere nøytrofile studier. Denne metoden gir rask og kvalitativ vurdering av ET utgivelse, men det er ikke hensiktsmessig som en frittstående metode for kvantifisering av ET Release grad. Alternative metoder bør brukes hvis kvantifisering er nødvendig for å sammenligne omfanget av ET utslipp som følge av ulike behandlings forhold eller intervensjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den HMDM ble isolert fra menneskelige Buffy pels preparater levert av Blodbanken med etikk godkjenning fra Sydney Local Health District.

1. HMDM kultur

  1. Isolere monocytter fra Buffy coat forberedelser tilberedt fra perifert blod av friske menneskelige donorer ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig forberedelse til å isolere lymfocytter, etterfulgt av motstrøm sentrifugal elutriation19, og 20.
  2. Bekreft tilstedeværelsen av monocytter ved cytospinning og farging med modifisert Giemsa beis for monocytt karakterisering19.
  3. Under sterile forhold, justere tettheten av monocytter til 1 x 106 celler/ml ved hjelp av RPMI-1640 media uten serum. Tilsett 1 mL av denne celle suspensjonen til hver brønn av en 12 brønn vev kultur plate. Kultur i en celle inkubator på 37 ° c i nærvær av 5% CO2 for 2 h for å fremme overholdelse av vevet kultur plate.
  4. Under sterile forhold, fjerne celle Media og erstatte med komplett RPMI-1640 kultur medier som inneholder 10% (v/v) samlet humant serum og 20 mM L-glutamin.
  5. Kultur cellene ved 37 ° c i nærvær av 5% CO2 i en celle inkubator i 8 dager, endre Media hver 2 dager.

2. polarisering av HMDM

  1. Under sterile betingelser, klargjør M1 priming Media ved å legge interferon γ (IFNγ; 20 ng/mL) og lipopolysakkarid (LPS; 1 μg/mL) til den komplette RPMI-1640 kultur Media. Klargjør m2 priming Media ved å legge interleukin 4 (IL-4; 20 ng/mL) til den komplette RPMI-1640 kultur Media.
  2. Under sterile forhold, aspirer medier fra vevet kultur plate brønner som inneholder HMDM, som har blitt sådd og kultivert som beskrevet i del 1.
  3. Vask brønnene nøye med cellene 3x med steril PBS (forvarmet til 37 ° c), med 1 mL alikvoter av PBS.
  4. Tilsett 1 mL av enten M1 eller m2 priming Media til hver brønn som inneholder HMDM (avhengig av hva som er hensiktsmessig for eksperimentet).
  5. Ruge cellene for 48 h ved 37 ° c i nærvær av 5% CO2 i en celle inkubator.

3. stimulering av HMDM for å indusere MET-utgivelse

  1. Under sterile forhold, forberede kulturen medier som inneholder ulike stimulatorer av MET utgivelse (avhengig av hva som er hensiktsmessig for eksperimentet) til den komplette RPMI-1640 Media: PMA (25 nM), humant rekombinant TNFα (25 ng/mL), eller humant rekombinant IL-8 (50 ng/mL ).
  2. For eksperimenter med HOCl stimulering, klargjør du HOCl (200 μM) i HBSS (forvarmet til 37 ° c), umiddelbart før tilsetning til cellene. Kontroller at HOCl ikke er klargjort i fullstendig celle medium.
    Merk: Konsentrasjonen av lagerløsning av HOCl er kvantifisert ved å måle UV absorbansen av løsningen på 292 NM og pH = 116 og bruker en utryddelse koeffisient på 350 M-1cm-121.
  3. Etter polarisering behandling beskrevet i avsnitt 2, aspirer cellen Media fra hver brønn og forsiktig vaske cellene 3x med 1 mL alikvoter av enten: steril PBS (for PMA, TNFα og IL-8) eller HBSS (for HOCl), som har vært forvarmet til 37 ° c.
  4. For eksperimenter med PMA, TNFα, eller IL-8: Tilsett 1 mL av det komplette mediet som inneholder PMA, TNFα eller IL-8 etter å ha fjernet PBS i det siste vaske trinnet.
  5. For eksperimenter med TNFα, ruge cellene i 6 timer ved 37 ° c i nærvær av 5% CO2 i en celle inkubator. For eksperimenter med PMA og IL-8, ruge cellene i 24 timer ved 37 ° c i nærvær av 5% CO2 i en celle inkubator.
  6. For eksperimenter med HOCl, tilsett 1 mL HOCl i HBSS etter at du har fjernet HBSS i det siste vaske trinnet. Deretter ruge cellene i 15 min ved 37 ° c i nærvær av 5% CO2 i en celle inkubator.
    1. Aspirer celle supernatanten forsiktig og vask cellene 3x med 1 mL alikvoter av HBSS som beskrevet i trinn 3,3.
    2. Etter å ha fjernet HBSS fra det siste vaske trinnet, tilsett 1 mL komplett RPMI-1640 kultur Media. Deretter ruge cellene i 24 h ved 37 ° c i nærvær av 5% CO2 i en celle inkubator.

4. visualisering av MET i live Cell kultur

  1. Klargjør SYTOX grønne fargestoff i HBSS ved en konsentrasjon på 40 μM.
  2. På slutten av behandlingene som er beskrevet i avsnitt 3 for å indusere MET-utgivelse, legger du direkte til 25 μL av 40 μM av fargestoffet til hver brønn som inneholder HMDM.
  3. Ruge celler ved romtemperatur (RT) i 5 minutter i mørket.
  4. Plasser HMDM i vevs kultur brønner i mikroskop fasen av et invertert fluorescerende mikroskop for bildebehandling.
  5. Mikroskop prosedyrer
    1. Slå på en bredspektret lysrør kilde, brightfield lyskilde, og invertert mikroskop installert med en høyoppløselig farge digitalkamera (se tabell over materialer).
    2. Roter filter hjulet til "Number 2" posisjon for grønne fluorescens (eksitasjon = 504 NM, utslipp = 523 NM) for Imaging av grønn farget prøvene inneholdt innenfor vev kultur brønner.
    3. Bruke 5x målsettingen, Fokuser bildet med grov fokus, deretter de fine fokus knottene på mikroskopet, til bildet vises skarpt, klart og fokusert når det vises gjennom mikroskop okularet.
    4. Bytt mikroskop til kameramodus.
    5. Start tilknyttet programvare.
    6. Velg Capture -fanen på programvaren.
    7. Klikk på avspillings knappen for å forhåndsvise bildet og justere fin fokus knotten på mikroskopet til bildet vises skarpt, klart og fokusert i forhåndsvisningsvinduet for programvaren.
    8. Klikk på opptaks knappen.
      Merk: Bildet som tas, vises automatisk i den tilhørende programvaren.
    9. I programvaren klikker du på fil | Lagre som den nødvendige bildefiltypen.
    10. På mikroskopet roterer du filter hjulet til "nummer 5"-posisjonen for brightfield bildebehandling og gjentar trinn 4.5.2 – 4.5.9 for å få det tilsvarende brightfield bildet.
    11. Gjenta trinnene 4.5.2 – 4.5.10 som nødvendig for påfølgende bilde anskaffelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Brightfield bilder som viser morfologiske endringer av HMDM som svar på stimuli for celle differensiering er vist i figur 1. M1 polarisert makrofager fra eksperimenter med HMDM eksponert for IFNγ og LPS viste en langstrakt og spindel-lignende celle form, som indikert av de svarte pilene i figur 1 (midtre panel). Til sammenligning, morfologi av m2 polarisert makrofager etter eksponering av HMDM til IL-4 for 48 h var vanligvis rund og flat, som indikert av de svarte pilene i figur 1 (høyre panel).

Muligheten av differensiert HMDM fenotyper å løslate METs ble vist frem av levende celle fluorescens Imaging med SYTOX grønn, som presentert i figur 2. Figur 2a viser kontroll data innhentet fra hver HMDM fenotype inkubert for 24 timer i fravær av noen Pro-inflammatorisk stimuli. I dette tilfellet var det svært begrenset grønn farging, som var forventet, gitt cellen impermeant natur denne flekken. Figur 2b viste positive flekker for METs, som følge av eksponeringen av M1 HMDMs til HOCL, PMA, Il-8, eller TNFα. De METs indikeres av de hvite pilene, vist som grønne striper, som følge av tråder av ekstracellulære DNA. Med HOCl, i tillegg til farging ekstracellulære DNA, var det noen grønne flekker synlig i cellene. Dette mobilnettet flekker ble også observert i noen grad med andre stimuli og antas å reflektere tap av membran integritet som følge av ET-uavhengig celle død som følge av behandlings forhold.

Figur 2b viser også de tilsvarende eksperimentene som ble utført med m2 HMDMs, som ble utsatt for Il-4. I dette tilfellet var det ingen frigjøring av DNA fra cellene, som indikert ved fravær av trådene/striper av ekstracellulære DNA; skjønt, det var noen cellulære opptak av grønne fluorescerende fargestoff med HOCl og TNFα. For komparative formål, Figur 3 viser representative data som indikerer Met utgivelse fra THP-1 makrofager eksponert for TNFα (50 ng/ml) for 4 h. I dette tilfellet bør det bemerkes at en ikke-polarisert populasjon av celler ble brukt, og THP-1 monocytter var differensiert til makrofager av pre-behandling med PMA (50 ng/mL for 72 h) som beskrevet tidligere22.

Figure 1
Figur 1: morfologiske endringer av differensielt polarisert HMDMs. Representative brightfield bilder fra ikke-differensiert og differensiert HMDMs (n ≥ 5). HMDMs ble kultivert med komplett Media som inneholder humant serum og glutamin i 8 dager før grunning til M1 eller m2 fenotype ved eksponering for IFNγ og LPS eller IL-4, henholdsvis for 48 h. Scale bar = 200 μm. Piler angir eksempler på celler som viser morfologiske karakteristikker av M1 eller m2 HMDMs. please Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: METs produsert av M1 HMDMs etter HOCl, PMA, Il-8, og TNFα stimulering. Representative bilder av SYTOX grønn beiset HMDMs fra (A) ikke-stimulert M1 og m2 HMDMs inkubert for 24 h i fravær av noen inflammatoriske stimuli ble brukt som kontroll, viser FRAVÆRET av Met utgivelse. (B) M1 og m2 HMDMs ble behandlet med 1) HOCl (200 μM, 15 min), PMA (25 nM) eller Il-8 (50 ng/ml) med inkubasjons for 24 timer eller 2) TNFα (25 ng/ml) med inkubasjons for 6 timer for å indusere Met-utgivelse. METs ble vist ved tilsetning av SYTOX grønn, som indikert av hvite piler i det øvre panelet fra M1 HMDMs. Ingen METS ble sett i tilsvarende eksperimenter med m2 HMDMs. data er representative for replikere kultur brønner fra n ≥ 3 individuelle donorer. Scale bar = 500 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: METs produsert av ikke-POLARISERT THP-1 makrofager etter TNFα stimulering. Representative bilder av SYTOX grønn-farget TNP-1 makrofager, som ble differensiert ved forbehandling med PMA (50 ng/mL for 72 h) før videre inkubasjons for 4 h i fravær eller tilstedeværelsen av TNFα (50 ng/mL) for å indusere MET utgivelse. METs ble i tillegg SYTOX grønn. Data er representative for replikere kultur brønner fra n ≥ 3 eksperimenter. Scale bar = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Generering og visualisering av MET-formasjonen ved hjelp av M1 differensiert HMDMs representerer en ny in vitro-modell som kan være nyttig for å undersøke den potensielle patologiske rollen til disse macrophage strukturene, spesielt under kronisk inflammatorisk Forhold. Det gir en robust protokoll for stimulering av primære menneskelige makrofager å løslate METs, som også kan benyttes i beslektede studier med menneskelige monocytt eller murine macrophage cellelinjer. Den vellykkede gjennomføringen av denne protokollen for stimulering av MET formasjon av HMDM er avhengig av forsiktig cellekultur og håndtering for å opprettholde god celle levedyktighet. Dette vil øke omfanget og kvaliteten på METs observert. For å gi bedre celle ernæring, den RPMI medier brukes til å opprettholde HMDM bør inneholde humant serum, snarere enn fosterets storfe serum, samt L-glutamin. Hver lagerløsning av denne fullstendig RPMI Media burde bli brukt innen 1 uke. Riktig lagring av Media er også viktig. Mediene skal oppbevares ved 4 ° c i fravær av lys.

I tillegg er det viktig å regelmessig observere og overvåke formen og morfologi av cellene ved mikroskopi under dyrking av HMDM. Eventuelle unormale eller uventede endringer i celle form observert før tilsetning av IFNγ og LPS eller IL-4 (for å polariserer makrofager) kan indikere en reduksjon i celle overlevelse. HMDM bør være tilhenger og ikke sprer. Det er derfor viktig å overvåke cellene for eventuelle endringer i morfologi, celle tetthet, eller tap av overholdelse under normal 8 dagers kultur periode. En dramatisk reduksjon i celle tetthet i løpet av de første 2 dagene etter isolering tyder på at den resulterende HMDMs kanskje ikke er tilstrekkelig levedyktig for senere eksperimenter. En begrensning av å bruke primære menneskelige celler er variasjonen mellom givere, som kan markant påvirke omfanget av MET utgivelse. I tillegg er kvaliteten på Buffy pels preparater mottatt for isolering av monocytter kan variere. Det er viktig å gjenta eksperimenter med minst tre individuelle celle donorer for å sikre at data er representative for større populasjoner av celler.

Det er viktig å merke seg at protokollen beskrevet for HMDM differensiering er optimalisert for celler isolert fra menneskelige Buffy coat forberedelser av motstrøm elutriation, som resulterer i en høy renhet monocytt forberedelse. Validering av polarisering behandlinger (for å bekrefte fenotype) ved flyt flowcytometri og vurdering av uttrykket av M1 markør CD86 og m2 markør CD206 har blitt utført tidligere ved hjelp av denne forberedelsen av HMDM6. Det er verdsatt at denne isolasjons metoden kan ikke være allment tilgjengelig, og at alternative isolasjons metoder (dvs. magnetisk perle sortering) kan være å foretrekke. Hvis det brukes en alternativ kilde til monocytter eller ulike isolasjons protokoller, er det anbefalt med ytterligere Flow flowcytometri eksperimenter for å validere fenotype endring, og noen optimalisering av behandlings forhold for å stimulere MET-utgivelsen kan være nødvendig.

For optimale fluorescens bilder bør eksponeringstid justeres nøye og oppbevares så kort som mulig for å unngå bakgrunns fluorescens og flekker på gjenstander fra plast kultur platene, som har tilhenger belegg. Det er viktig å ta flere bilder fra hver brønn som inneholder celler. Det er en fordel hvis prøvene er blindet før fluorescens mikroskopi analyse. I tillegg til farging ekstracellulære tråder av DNA, er det også bevis for mobilnettet opptaket av SYTOX grønn. Dette antas å reflektere et tap i membran integritet, som kan være på grunn av MET utgivelse, og det kan også avdekke alternative veier av celle død (se også nedenfor). Dette fremhever viktigheten av å utføre flere eksperimenter for å kvantifisere og karakterisere MET-utgivelsen.

For en kvantitativ sammenligning av omfanget av MET utgivelse under ulike behandlings forhold eller etter ulike intervensjoner for å modulere MET utgivelse, er ytterligere analyse nødvendig. Dette kan oppnås ved å utføre qPCR analyse av kjernefysisk og mitokondrie DNA tilstede i cellen supernatanter, som beskrevet tidligere6. Denne metoden kombineres vanligvis med melkesyre dehydrogenase Utgivelses analyser for å kontrollere for cellelyse, som ikke er relatert til MET-versjon6. Den SYTOX grønne flekker kan også bli kvantifisert av en fluorescens plate leser etter DNase behandling for å delvis fordøye METs og slipper dem fra kultur plater. Denne metodikken har blitt brukt mye i tidligere arbeid med nøytrofile garn1,2,23.

Fremtidens anvendelser av denne protokollen forholder seg til å gi muligheter for videre karakterisering av METs ved hjelp av immunhistokjemi. Det vil være mulig å granske protein sammensetningen av METs ved hjelp av denne tilnærmingen med målrettede antistoffer (dvs. mot citrullinert histoner eller MPO) for å få ytterligere innsikt i rollene til disse strukturene i mer komplekse biologiske prøver. Disse eksperimentene vil også være viktig for shedding mer lys på avgrensning av MET utgivelse etter andre former for celle død, for eksempel pyroptosis15. Det er verdt å merke seg at i vår erfaring, METs fra makrofager ikke overholder platene så sterkt som NETs fra nøytrofile, som kan gjøre immunhistokjemi analyse mer utfordrende. Likevel vil dataene fra disse eksperimentene være av interesse, gitt det faktum at makrofager ofte spiller en dominerende rolle i kroniske inflammatoriske sykdommer. Ytterligere karakterisering av disse strukturene er avgjørende for å vurdere sine roller in vivo, som hittil bare har blitt utført i begrenset grad16. Det antas at den beskrevne metoden bruker HMDM å oppnå dette formålet kan være mer klinisk relevant i forhold til andre udødeliggjort cellelinje-avledet macrophage kilder; Selv om disse cellelinjer kan ha nytte i å gi en mer stabil modell for MET karakterisering med mindre potensial for donor variasjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av en varig IMPACT Grant (IPAP201601422) og Novo nordisk Foundation Biomedical Project Grant (NNF17OC0028990). YZ erkjenner også mottak av en australsk Postgraduate Award fra University of Sydney. Vi vil gjerne takke Mr. Pat Pisansarakit og MS Morgan Jones for å få hjelp med monocytt isolasjon og vev kultur.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
120Q broad spectrum fluorescent light source EXFO Photonic Solutions, Toronto, Canada x-cite series
Corning CellBIND Multiple Well Plate (12 wells) Sigma-Aldrich CLS3336 For cell culture
Differential Quik Stain Kit (Modified Giemsa) Polysciences Inc. 24606 Characterisation of monocytes
Hanks balanced salt solution (HBSS) Thermo-Fisher 14025050 For washing steps and HOCl treatment
Hypochlorous acid (HOCl) Sigma-Aldrich 320331 For MET stimulation
Interferon gamma Thermo-Fisher PMC4031 For M1 priming
Interleukin 4 Integrated Sciences rhil-4 For M2 priming
Interleukin 8 Miltenyl Biotec 130-093-943 For MET stimulation
L-Glutamine Sigma-Aldrich 59202C Added to culture media
Lipopolysaccharide Integrated Sciences tlrl-eblps For M1 priming
Lymphoprep Axis-Shield PoC AS 1114544 For isolation of monocytes
Olympus IX71 inverted microscope Olympus, Tokyo, Japan
Phorbol 12- myristate 13-acetate (PMA) Sigma-Aldrich P8139 For MET stimulation
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich D5652 For washing steps
RPMI-1640 media Sigma-Aldrich R8758 For cell culture
SYTOX green Life Technologies S7020 For MET visulaization
TH4-200 brightfield light source Olympus, Tokyo, Japan x-cite series
Tumor necrosis factor alpha Lonza 300-01A-50 For MET stimulation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, (5663), 1532-1535 (2004).
  2. Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans. PLoS Pathogens. 5, (10), 1000639 (2009).
  3. Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs. Nature Reviews in Microbiology. 5, (8), 577-582 (2007).
  4. Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews in Immunology. 18, (2), 134-147 (2018).
  5. Keshari, R. S., et al. Cytokines induced neutrophil extracellular traps formation: implication for the inflammatory disease condition. PLoS One. 7, (10), 48111 (2012).
  6. Rayner, B. S., et al. Role of hypochlorous acid (HOCl) and other inflammatory mediators in the induction of macrophage extracellular trap formation. Free Radical Biology and Medicine. 129, 25-34 (2018).
  7. Gunzer, M. Traps and hyperinflammation - new ways that neutrophils promote or hinder survival. British Journal of Haematology. 164, (2), 189-199 (2014).
  8. Knight, J. S., et al. Peptidylarginine deiminase inhibition reduces vascular damage and modulates innate immune responses in murine models of atherosclerosis. Circulation Research. 114, (6), 947-956 (2014).
  9. Megens, R. T., et al. Presence of luminal neutrophil extracellular traps in atherosclerosis. Thrombosis and Haemostasis. 107, (3), 597-598 (2012).
  10. Doring, Y., Weber, C., Soehnlein, O. Footprints of neutrophil extracellular traps as predictors of cardiovascular risk. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33, (8), 1735-1736 (2013).
  11. Goldmann, O., Medina, E. The expanding world of extracellular traps: not only neutrophils but much more. Frontiers in Immunology. 3, (420), 1-10 (2012).
  12. Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte. Journal of Leukocyte Biology. 97, (6), 1023-1035 (2015).
  13. Pertiwi, K. R., et al. Extracellular traps derived from macrophages, mast cells, eosinophils and neutrophils are generated in a time-dependent manner during atherothrombosis. Journal of Pathology. 247, (4), 505-512 (2019).
  14. Okubo, K., et al. Macrophage extracellular trap formation promoted by platelet activation is a key mediator of rhabdomyolysis-induced acute kidney injury. Nature Medicine. 24, (2), 232-238 (2018).
  15. Boeltz, S., et al. To NET or not to NET:current opinions and state of the science regarding the formation of neutrophil extracellular traps. Cell Death and Differentiation. 26, (3), 395-408 (2019).
  16. Doster, R. S., Rogers, L. M., Gaddy, J. A., Aronoff, D. M. Macrophage Extracellular Traps: A Scoping Review. Journal of Innate Immunology. 10, (1), 3-13 (2018).
  17. Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS One. 5, (1), 8668 (2010).
  18. Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. Journal of Immunology. 172, (5), 2731-2738 (2004).
  19. Brown, B. E., Rashid, I., van Reyk, D. M., Davies, M. J. Glycation of low-density lipoprotein results in the time-dependent accumulation of cholesteryl esters and apolipoprotein B-100 protein in primary human monocyte-derived macrophages. FEBS Journal. 274, 1530-1541 (2007).
  20. Garner, B., Dean, R. T., Jessup, W. Human macrophage-mediated oxidation of low-density lipoprotein is delayed and independant of superoxide production. Biochemical Journal. 301, 421-428 (1994).
  21. Morris, J. C. The acid ionization constant of HOCl from 5 °C to 35 °C. Journal of Phyical Chemistry. 70, 3798-3805 (1966).
  22. Pan, G. J., Rayner, B. S., Zhang, Y., van Reyk, D. M., Hawkins, C. L. A pivotal role for NF-kappaB in the macrophage inflammatory response to the myeloperoxidase oxidant hypothiocyanous acid. Archives of Biochemistry and Biophysics. 642, 23-30 (2018).
  23. Parker, H., Albrett, A. M., Kettle, A. J., Winterbourn, C. C. Myeloperoxidase associated with neutrophil extracellular traps is active and mediates bacterial killing in the presence of hydrogen peroxide. Journal of Leukocyte Biology. 91, (3), 369-376 (2012).
In vitro stimulering og visualisering av ekstracellulære Trap Release i differensiert Human monocytt-avledet makrofager
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, Y., Rayner, B. S., Jensen, M., Hawkins, C. L. In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages. J. Vis. Exp. (153), e60541, doi:10.3791/60541 (2019).More

Zhang, Y., Rayner, B. S., Jensen, M., Hawkins, C. L. In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages. J. Vis. Exp. (153), e60541, doi:10.3791/60541 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter