Summary
Hier stellen wir ein Protokoll zur Ablösung von hornhauten Endothelzellen (CEC) von Descemets Membran (DM) unter Verwendung eines Neodym:YAG (Nd:YAG) Lasers als Ex-vivo-Krankheitsmodell für bullöse Keratopathie (BK) vor.
Abstract
Nd:YAG-Laser werden seit mehreren Jahrzehnten zur Durchführung nichtinvasiver intraokularer Operationen wie Capsulotomie eingesetzt. Der prägnante Effekt beruht auf dem optischen Abbau am Laserfokus. Akustische Schockwellen und Kavitationsblasen werden erzeugt, was zu Gewebebrüchen führt. Blasengrößen und Druckamplituden variieren je nach Pulsenergie und Position des Brennpunkts. In dieser Studie wurden enukleierte Schweineaugen vor einem handelsüblichen Nd:YAG-Laser positioniert. Getestet wurden variable Pulsenergien sowie verschiedene Positionen der Brennpunkte hinter der Hornhaut. Die resultierenden Läsionen wurden durch Zwei-Photonen-Mikroskopie und Histologie bewertet, um die besten Parameter für eine exklusive Ablösung von Hornhaut-Endothelzellen (CEC) mit minimalen Kollateralschäden zu bestimmen. Die Vorteile dieser Methode sind die präzise Ablation der KEK, reduzierte Kollateralschäden und vor allem die berührungslose Behandlung.
Introduction
Transparenz der Hornhaut ist wichtig für die Übertragung von Licht auf die Netzhaut und ihre Photorezeptoren1. In dieser Hinsicht ist ein relativer Zustand der Dehydrierung entscheidend, um die Kollagenfasern innerhalb der Hornhautstroma richtig ausgerichtet zu halten. Diese Homöostase wird von hornhauten Endothelzellen (CEC) auf der Descemet-Membran (DM)2aufrechterhalten. Das Endothel ist die innerste Hornhautschicht. Es hat eine wichtige Barriere- und Pumpenfunktion, die für die Hornhauttransparenz3von entscheidender Bedeutung ist. Im Gegensatz zum Epithel ist das Endothel nicht in der Lage,sich 4zu erneuern. Daher stimuliert jede Durcherkrankung oder ein Trauma verursachte Zellschädigung die verbleibenden Endothelzellen, sich zu vergrößern und zu wandern, die resultierenden Defekte zu decken und die Hornhautfunktionalität aufrechtzuerhalten5. Wenn die CEC-Dichte jedoch unter einen kritischen Schwellenwert fällt, führt die Dekompensation des Endothels zu einem Ödem, was zu verschwommenem Sehen und Beschwerden oder sogar starkenSchmerzen4 führt. Trotz der Verfügbarkeit von Medikamenten zur Linderung von Symptomen ist derzeit die einzige definitive Behandlung in diesen Fällen die Hornhauttransplantation, die in Form eines Volldickentransplantats oder einer lamellaren Endotheltransplantation durchgeführt werden kann. Letzteres Verfahren ist als Descemet-Membran-Endothel-Keratoplastik (DMEK) sowie als Descemet-Abisolier-Automatik-Keratoplastik (DSAEK)6erhältlich. Der Schutz der verbleibenden KEK und die Verbesserung ihres Überlebens könnten jedoch ein alternatives Ziel sein, das ein angemessenes Krankheitsmodell benötigt, um potenzielle therapeutische Medikamente zu testen.
Aktuelle CEC-Verlustkrankheitsmodelle konzentrieren sich auf die Zerstörung des Endothels durch Injektion von toxischen Wirkstoffen (z.B. Benzalkoniumchlorid) in die Vorderkammer oder durch mechanischea Briesion der Zellen mit einer invasiven Descemetorhexis-Technik7,8. Während diese Modelle gut etabliert sind, gibt es Nachteile wie allgemeine Entzündungsreaktionen und ungenaue Kollateralschäden. Daher stellen diese Modelle eher die Endstadien der Krankheit dar, wenn die oben genannten chirurgischen Optionen unvermeidlich sind.
Mit Fortschritten in zellulären Behandlungsstrategien wie Stammzellen und Gentherapie könnte die Anwendung dieser zellulären Therapien in frühen Stadien des CEC-Verlusts9nützlich sein. Anschließend brauchen wir ein Modell, das diese früheren Stadien der Krankheit angemessener darstellt. In dieser Hinsicht haben sich die Zellkulturmodelle in den letzten zehn Jahren verbessert, sind aber in ihrer Gültigkeit immer noch begrenzt, da Zellen in vitro nicht annähernd an die Replikation der komplexen Wechselwirkungen herankommen können, die zwischen den verschiedenen Zelltypen innerhalb der Hornhaut10auftreten. Daher sind Ex-vivo- und In-vivo-Krankheitsmodelle nach wie vor sehr gefragt, und die Verbesserung der bestehenden sind von größtem Interesse.
Nichtinvasive, intraokulare Chirurgie durch Photodisruption mit einem Neodym:YAG (Nd:YAG) Laser ist seit seiner Einführung ende der 1970er Jahre weltweit zu einem Routineverfahren für Augenärzte weltweit geworden11. Photodisruption beruht auf nichtlinearer Lichtabsorption, die zur Bildung von Plasma, der Erzeugung akustischer Stoßwellen und der Bildung von Kavitationsblasen führt, wenn sich der Einsatzort in einer flüssigen Umgebung befindet12. Im Allgemeinen tragen diese Prozesse zur beabsichtigten Wirkung eines präzisen Gewebeschneidens bei. Sie können jedoch auch die Quelle unnötiger Kollateralschäden sein, die die lokale Einschließung der Laserchirurgie begrenzen13.
Die Vorhersage der resultierenden mechanischen Effekte hat sich durch die Charakterisierung der Stoßwellenausbreitung und des Kavitationsverlaufs deutlich verbessert. Unser Ziel ist es, die KEK mit möglichst geringen Schäden an umgebendem Gewebe ins Visier zu nehmen, um ein nichtinvasives, lasergestütztes experimentelles Krankheitsmodell für die frühen Stadien des CEC-Verlusts bereitzustellen. Dazu ist es notwendig, die optimalen Pulsenergien und Positionen der Brennpunkte des Lasers zu bestimmen.
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Protocol
Alle Verfahren, an denen Tiergewebe beteiligt ist, folgen den Richtlinien der örtlichen Tierpflege- und Ethikkommission.
1. Vorbereitung der Organkultur und Laserbehandlung
- Erhalten Sie frisch enucleatierte Schweineaugen aus dem lokalen Schlachthof. Halten Sie sie kühl (4 °C) in Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit hoher Glukose, ergänzt mit L-Glutamin, Natriumpyruvat, Penicillin/Streptomycin (1 %), und Schweineserum (10 %), fortan in diesem Artikel als vollmittel bezeichnet.
- Entfernen Sie extrazelluläre Gewebe mit einer Schere und tränken Sie die Augen in 5% Povidon-Jod-Ophthalmologische Lösung für 5 min, bevor Sie sie in sterilisierte Phosphat-gepufferte Saline (PBS) bis zur Verwendung.
- Bildschirmaugen für große vordere Segmentpathologien, wie Hornhautnarben, Ödeme und andere Trübungen mit einem spektral-domänenoptischen Kohärenztomographiegerät (Tabelle der Materialien).
- Positionieren Sie die Augen vor einer Schlitzlampeneinheit, die mit einem Nd:YAG-Laser (Materialtabelle) ausgestattet ist, der eine Wellenlänge von 1.064 nm und einen Brennpunktdurchmesser von 10 m in der Luft hat.
ANMERKUNG: Für eine optimale Positionierung wird ein 3D-gedrucktes Haltegerät verwendet, das entwickelt wurde, um das Auge fest zu halten, ohne zu viel Druck darauf auszuüben (Abbildung 1). - Verwenden Sie eine Vergrößerung von 12x und lenken Sie die Beleuchtung ab, um die einzelnen Hornhautschichten zu visualisieren.
- Stellen Sie die Pulsenergie (z.B. 1,6 mJ) und den Fokuspunkt (z.B. 0,16 mm) für die selektive Ablation von Endothelzellen ein.
- Legen Sie eine klare Hornhautparazenz in der Nähe des Limbus und injizieren viskolastisch (Tisch der Materialien) die vordere Kammer zu stabilisieren.
- Verbrauchen Sie die laserbehandelte zentrale Hornhaut mit einem 8 mm Trephin.
- Die ausgeschnittene Hornhaut in einen Brunnen einer 12-Well-Platte mit der endothelialen Stelle nach oben legen und die Probe in 3 ml Vollmedium bei 37 °C für bis zu 3 Tage bebrüten.
HINWEIS: Potenzielle zytoprotektive Mittel können in diesem Schritt dem Medium hinzugefügt werden.
2. Vorbereitung auf die Histologie
- Bereiten Sie Sorensens Puffer mit einem pH-Wert von 7,4 vor, der 19,6 ml von 133 mM KH2PO4 und 80,4 ml von 133 mM Na2HPO4enthält.
- Entfernen Sie das Medium aus dem Hornhaut-haltigen Brunnen und fixieren Sie das Gewebe für 20 min bei Raumtemperatur (RT) mit methanolfreiem Paraformaldehyd (4%) im Puffer von Sorensen.
- Legen Sie Gewebe in 20% Saccharose in PBS, bis Gewebe sinkt (1 h) und dann in 30% Saccharose in PBS über Nacht bei RT. Achten Sie darauf, den Kontakt mit Blasen und der Luftoberflächenschnittstelle zu vermeiden. Gewebe in optimale Schnitttemperatur (OCT) einbetten und bei -80 °C lagern.
- Schneiden Sie die 10 m dicken Abschnitte mit einem Kryostat bei -27 °C.
HINWEIS: Eine Kamelhaarbürste ist nützlich, um den entstehenden Abschnitt über die Messerklinge zu führen. - Übertragen Sie den Schnitt auf ein Mikroskopschlitten, indem Sie den Dia innerhalb von 1 min nach dem Schneiden auf das Gewebe berühren, um eine Gefriertrocknung des Gewebes zu vermeiden. Bewahren Sie die Dias bei -80 °C auf.
3. Hämatoxylin und Eosin (H&E) Färbung
- Lufttrockene Abschnitte für mehrere Minuten, um Feuchtigkeit zu entfernen.
- Mit gefiltertem 0,1% Mayers Hämatoxylin für 10 min in einem 50 ml Schlauch.
- In einem Coplin-Glas in kühl laufendem ddH2O für 5 min abspülen und 0,5% Eosin 10x eintauchen.
- Tauchen Sie in ddH2O ein, bis das Eosin aufhört zu streifen und dann in 50% (10x) sowie 70% (10x) EtOH eintauchen.
- Gleichgewicht in 95% EtOH (30 s) und 100% EtOH (60 s) vor dem eintauchen in Xylol mehrmals.
- Schließlich montieren und decken Sie die Probe, bevor Sie Bilder mit einem Lichtmikroskop.
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Representative Results
Mit dem hier vorgestellten Verfahren behandelten wir die Augen mit einem Nd:YAG-Laser, der verschiedene Pulsenergien (1,0 x 4,6 mJ) und Positionen von Brennpunkten (Abstand von der hinteren Oberfläche der Hornhaut: 0,0 x 0,2 mm) bewertete, um die optimalen Parameter zu finden. Für jede Konstellation der Laserparameter (12 x 21) wurden mehrere Replikationen (n = 3) ausgewertet.
Zusätzlich zu dem oben genannten Protokoll wurde die Probe vor der Fixierung und H&E-Färbung mit einem Zwei-Photonen-Mikroskop analysiert. Das Zwei-Photonen-Mikroskop verwendete einen soliden, modusgesperrten 80 MHz Ti:Saphir-Laser mit einem Stimmbereich von 690 x 1b040 nm und einer mittleren Laserleistung von >900 mW bei 800 nm als Lichtquelle. Es lieferte Impulse mit einer Breite von ca. 150 fs an die Probe. Die Bilder wurden mit einem Mikroskopobjektiv (20x/0,95) bei einer Wellenlänge von 730 nm und 30 mW Laserleistung aufgenommen.
Zwei-Photonen- sowie Lichtmikroskopie-Bilder wurden unabhängig von 3 Rezensenten überprüft, die für experimentelle Einstellungen geblendet waren und die Bilder drei Kategorien zuordnen mussten: (1) kein Schaden, (2) zu viel Schaden oder (3) rechte Schadenshöhe (Abbildung 2 und Abbildung 3). Auf der Grundlage ihrer Auswertung wurde eine Heatmap berechnet (Abbildung 4). Mit dieser Heatmap ist es möglich, die richtige Konstellation von Laserparametern auszuwählen, um CEC mit minimalen Schäden am umgebenden Gewebe (grün) selektiv abzutun. Die Ergebnisse zeigen, dass der Brennpunkt des Lasers mindestens 0,15 mm hinter dem Hornhautendothel liegen muss, um die niedrigste getestete Pulsenergie (1,0 mJ) zu erhalten. Bei Pulsenergien über 2,9 mJ ist die längste getestete Brennweite (0,2 mm) noch zu nah am Endothel.
Abbildung 1: Versuchsaufbau. (A) Die Augen wurden in einer teilweise 3D-gedruckten Haltevorrichtung fixiert, die eine präzise Ausrichtung in Bezug auf den Laserstrahl ermöglichte. (B) Vor der Laserbehandlung wurde das Gewebe mit einem vorderen Segment optischen Kohärenztomographiegerät untersucht, um auf große vordere Segmentpathologien zu überprüfen. Positionen der Brennpunktleiter sind beispielhaft für 0,0 mm (schwarzes Sternchen), 0,1 mm (rotes Sternchen) und 0,2 mm (blaues Sternchen) gekennzeichnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Zwei-Photonen-Mikroskopie. Die Ergebnisse reichten von keinerlei Schäden (A), umfangreichen Kollateralschäden (B) bis hin zur selektiven Ablation von Endothelzellen (C). Die rote Pfeilspitze zeigt eine gebrochene Descemet-Membran, und grüne Pfeilspitzen weisen auf eine selektive Ablation von CEC-Clustern hin. Maßstabsleiste = 100 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Histologie. Hämatoxylin und Eosinfärbung bestätigten den Schadensbereich von keinerlei Schäden (A), umfangreiche Kollateralschäden (B) bis hin zur selektiven Ablation von Endothelzellen (C). Die rote Pfeilspitze zeigt eine gebrochene Descemet-Membran, und grüne Pfeilspitzen weisen auf eine selektive Ablation von CEC-Clustern hin. Maßstabsleiste = 100 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Eine Heatmap, die die Wahrscheinlichkeit selektiver CEC-Schäden anzeigt. Dabei sind die Pulsenergie sowie die Position des Nd:YAG Laserfokuspunkts zu berücksichtigen. Übermäßiger Schaden wird rot dargestellt, und der gewünschte Teil des Schadens wird grün dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die Ergebnisse dieser Pilotstudie deuten darauf hin, dass ein Nd:YAG-Laser verwendet werden kann, um hornhaut-Endothelzellen selektiv abzuergänzen, wenn geeignete Parameter für Energiedosis und Fokuspunktposition gewählt werden.
Da die endotheliale Funktion wichtig für die Hornhauttransparenz und den Schutz der Hornhaut vor stromalen Ödemen ist, spielen Modelle der endothelialen Dysfunktion eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von Antiödemoderoder-Verfahren. Es gibt mehrere etablierte In-vitro-Modelle zur Nachahmung der in vivo Situation10,14,15, aber wie allgemein bekannt, können In-vitro-Modelle die Einflüsse von Enzymen und Zytokinen oder die Wirkung der Zell-Zell-Interaktion nicht vollständig imitieren. Im Gegensatz dazu bietet dieses neu entwickelte Ex-vivo-Modell des Endothelzellverlusts die Möglichkeit, verschiedene Krankheitszustände und Hornhautdekompensation in der natürlichen Umgebung zu überwachen.
Da die Hornhaut in unserem Modell nach dem Laserverfahren mit einem Trephin ausgeschnitten wird, sich die Physiologie der Hornhaut verändert und der In-vitro-Situation ähnlich ist, werden regionale Wechselwirkungen erheblich behindert. Die lokale Schnittstelle bleibt jedoch intakt und insbesondere die zelluläre Kommunikation zu anderen Zellen innerhalb der Hornhaut bleibt bestehen. Unsere Studie ergab, dass die Hornhaut unter diesen Umständen ihre Funktion für drei Tage in der Kultur aufrechterhält, was genügend Zeit bietet, um potenzielle therapeutische Wirkstoffe zu beobachten und zu bewerten. Andererseits können langjährige Heilungsprozesse nicht untersucht werden.
In unserem Modell haben wir Schweineaugen verwendet, da größere Mengen davon leicht zu erhalten sind. Darüber hinaus imitieren Schweineaugen menschliche Augen sehr gut. Im Gegensatz zu Kaninchen, die regelmäßig zum Experimentieren verwendet werden, haben Schweineaugen eine Bowman-Membran. Dennoch unterscheidet sich die Hornhautdicke des Schweineauges erheblich vom menschlichen Auge. Insbesondere ist der Schweinestroma viel dicker und es gibt keinen Unterschied zwischen zentraler und peripherer Dicke in Schweinehornhäuten16. Es muss auch berücksichtigt werden, dass der menschliche KEK keine Heilungsfähigkeit besitzt, während dieses regenerative Merkmal bei einigen Tieren, wie Schweinen und Kaninchen17,18, berichtet wird. Unsere Studie konzentrierte sich nicht auf Wundheilungsprozesse, aber dieser Unterschied sollte bei der Übersetzung der Ergebnisse berücksichtigt werden. Da die Wundheilung von Tieren CEC nicht mehr als vier Tage beträgt, kann sie in unseren kultivierten Geweben beobachtet werden, selbst wenn sie nur drei Tage dauern.
Vergleicht man unseren Versuchsaufbau mit früheren Studien, so waren die angewandten Energieniveaus ähnlich19. Anstatt sich nur auf das Endothel zu konzentrieren, wurden verschiedene Schwerpunkte bewertet. Daher ist der Hauptunterschied unseres Setups zu früheren Studien sein Potenzial, spezifische Endothelschäden zu induzieren, ohne DM oder Stromgewebe zu beschädigen. Eine genaue Überwachung der Energiedosis und Fokusposition ermöglicht eine selektive CEC-Ablation, ohne Schockwellenschäden an anderen Teilen der Hornhaut zu verursachen. Auch haben wir kein stromales oder subepithelialeÖdem direkt nach der Laserbehandlung20bemerkt.
Eine frühere Studie zeigte, dass Temperaturen von 40 °C zu CEC-Schäden führen können21. Wir haben die induzierte Temperatur nicht gemessen, aber sie könnte für weitere Studien von Interesse sein. Darüber hinaus sollte die Wirkung verschiedener Lasersysteme bewertet werden. Frühere Studien zeigten einen Unterschied zwischen laserinduzierten, umschriebenen CEC-Schäden und anderen CEC-Verletzungen19,22. Dies könnte auch die Vergleichbarkeit mit menschlichem Gewebe und Krankheiten einschränken, da laserinduzierte Schäden von unterschiedlichen Krankheitsentwicklungsprozessen gefolgt zu sein scheinen. Interessanterweise endete die Wundheilung nach Laseranwendung bei der verbrannten DM in früheren Studien19. Die Verletzungsquelle könnte weniger wichtig sein, wenn die DM intakt bleibt.
Höhere Energieniveaus können ein höheres Risiko für längere Verletzungen darstellen22. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Verwendung höherer Energieniveaus (<2,9 mJ) für selektive CEC-Schäden einen engeren Fokusbereich erfordert. Während die Schädigung der KEK in früheren Studien17mechanisch angewendet wurde, hat der hier verwendete laserinduzierte Schaden eine genauere Beschneidung der Läsion und kann leicht in in vivo-Studien verwendet werden.
Es sei darauf hingewiesen, dass nur eine geringe Anzahl von Augen gemäß diesem Protokoll behandelt und untersucht wurde. Wie bereits erwähnt, kann es interindividuelle Unterschiede in der Reaktion auf die Laserbehandlung sowie Unterschiede zwischen den Hornhäuten verschiedener Tierarten geben. Da CEC-Schäden an unterschiedlichen Brennpositionen entstehen können, sollten bestimmte Schwellenwerte nicht überschritten werden, um längere Schäden zu vermeiden.
Schließlich wurden die in dieser Studie erzeugten Läsionen in den zentralen Teil gelegt. Eine frühere Studie mit Schweineaugen zeigte eine beschleunigte Wundheilung in der Hornhautperipherie, was auf die Nähe zu limbalen Stammzellen17 zurückzuführen sein könnte, da sich die Hornhautdicke in den Schweineaugen nicht zwischen den Regionen unterscheidet. In zukünftigen Studien sollte geprüft werden, ob Die Laserparameter beim Wechsel von der Hornhautmitte in die Peripherie angepasst werden sollten.
Abschließend führt unsere Studie ein nichtinvasives Modell für weitere Untersuchungen zur CEC-Dysfunktion ein. Beschränkungen von Ex-vivo- oder In-vivo-Studien in Bezug auf die Verwendung von tierischem anstelle von menschlichem Gewebe bleiben bestehen und müssen bei der Interpretation der Ergebnisse berücksichtigt werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken Christine Örün und Jan A. M. Sochurek für ihre Hilfe bei experimentellen Methoden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BARRON VACUUM TREPHINE | Katena | K20-2058 | |
| Cryostat | Leica | CM 3050S | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose | PAA | E-15009 | |
| Eye holder | Self | N/A | |
| Inverted Microscope | Leica | DMI 6000 B | |
| KH2PO4 | Merck | 529568 | |
| Na2HPO4 | Merck | 1065860500 | |
| Nd:YAG laser | Zeiss Meditec | visuLAS YAG II plus | |
| OCT Tissue Tek | Sakura Finetechnical | 4583 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010056 | |
| Porcine serum | Sigma-Aldrich | 12736C | |
| Spectral-domain optical coherence tomograph | Heidelberg Engineering | Spectralis | |
| Tissue culture plate 12-well | Sarstedt | 833921 | |
| Two-Photon Microscope | JenLab | DermaInspect | |
| Viscoelastic | OmniVision | Methocel |
References
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