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Évaluation de la toxicité par inhalation aigue des particules aéroportées en exposant les cellules pulmonaires humaines cultivées à l’interface air-liquide

Published: February 23, 2020 doi: 10.3791/60572
Automatic Translation
1, 2, 3, 2, 5, 3,4, 2, 2, 1, 3,4, 1,2
1Bundeswehr Institute of Pharmacology and Toxicology, 2Walther Straub Institute of Pharmacology and Toxicology, University of Munich, 3Cultex Laboratories GmbH, 4Cultex Technologies GmbH (formerly Cultex Laboratories GmbH), 5seh consulting + services

Summary

Nous présentons un système robuste, transférable et prédictif d’exposition in vitro pour le criblage et la surveillance des particules aéroportées concernant leur cytotoxicité pulmonaire aigue en exposant les cellules pulmonaires humaines cultivées à l’interface air-liquide (ALI).

Abstract

Ici, nous présentons un système modulaire d’exposition in vitro spécialement conçu qui permet l’exposition homogène des cellules pulmonaires humaines cultivées à l’ALI aux gaz, aux particules ou aux atmosphères complexes (par exemple, la fumée de cigarette), fournissant ainsi des aspects physiologiques réalistes l’exposition de la surface apaïque de la région alvéolienne humaine à l’air. Contrairement aux modèles d’exposition séquentielle avec guidage linéaire d’aérosol, la conception modulaire du système d’écoulement radial répond à toutes les exigences pour la génération et le transport continus de l’atmosphère d’essai aux cellules, une distribution homogène et le dépôt de particules et l’élimination continue de l’atmosphère. Cette méthode d’exposition est principalement conçue pour l’exposition des cellules aux particules en suspension dans l’air, mais peut être adaptée à l’exposition d’aérosols liquides et de gaz hautement toxiques et agressifs selon la méthode de production d’aérosols et le matériau des modules d’exposition. .

Dans le cadre d’une étude de validation récemment terminée, ce système d’exposition a été prouvé comme une méthode de dépistage transférable, reproductible et prédictive pour l’évaluation qualitative de la cytotoxicité pulmonaire aigue des particules en suspension dans l’air, potentiellement réduire ou remplacer les expériences animales qui fourniraient normalement cette évaluation toxicologique.

Introduction

L’inhalation de particules toxiques en suspension dans l’air est un problème de santé publique, entraînant une multitude de risques pour la santé dans le monde entier et plusieurs millions de décès par an1,2. Le changement climatique, le développement industriel en cours et la demande croissante d’énergie, d’agriculture et de produits de consommation ont contribué à l’augmentation des maladies pulmonaires au cours des dernières années3,4,5,6. La connaissance et l’évaluation des substances inhalables concernant leur toxicité par inhalation grave constituent la base de l’évaluation des risques et de la gestion des risques, mais cette information fait encore défaut pour un large éventail de ces substances7,8. Depuis 2006, la législation de l’UE sur les produits chimiques REACH (Enregistrement, Évaluation, Autorisation et Restriction des produits chimiques) exige que les produits déjà existants et nouvellement introduits subissent une caractérisation toxicologique, y compris la voie d’inhalation, avant d’être mis sur le marché. Par conséquent, REACH met l’accent sur les méthodes alternatives et sans animaux, la mise en œuvre du principe « 3R » (Remplacement, raffinement et réduction des expériences animales) et l’utilisation de modèles in vitro appropriés9. Au cours des dernières années, de nombreux modèles d’essais de toxicité par inhalation non animale différents et adéquats (p. ex., cultures cellulaires in vitro, modèles de poumons sur puce, tranches de poumoncoupées de précision (PCLS)) ont été développés afin d’évaluer la toxicité par inhalation aigue des particules en suspension dans l’air5,7,10,11. En ce qui concerne les modèles de culture cellulaire in vitro, les cellules cultivées peuvent être exposées dans des conditions immergées ou à l’ALI (Figure 1). Cependant, la validité des études d’exposition submergée est limitée en ce qui concerne l’évaluation de la toxicité des composés en suspension dans l’air, en particulier les particules. Les techniques d’exposition submergée ne correspondent pas à la situation in vivo humaine; le milieu de culture cellulaire couvrant les cellules peut affecter les propriétés physico-chimiques et donc, les propriétés toxiques d’une substance d’essai12,13. Les modèles d’inhalation in vitro ALI permettent l’exposition directe des cellules aux substances d’essai sans interférence du milieu de culture cellulaire avec des particules d’essai, imitant ainsi l’exposition humaine avec une similitude physiologique et biologique plus élevée que les expositions submergées12,14.

Pour les processus réglementaires tels que REACH, cependant, seuls les modèles animaux sont disponibles dans le domaine de la toxicologie par inhalation aigue, car aucune autre méthode in vitro n’a été suffisamment validée et officiellement acceptée jusqu’à présent14. À cette fin, les modèles d’essai doivent être validés conformément aux exigences du Laboratoire de référence de l’Union européenne pour les principes d’alternatives à l’expérimentation animale (EURL-ECVAM) sur la validité des tests15.

Une ancienne étude de pré-validation et une étude de validation récemment terminée ont démontré avec succès la zone d’application du système d’exposition À la RFS DELET et sa transférabilité, sa stabilité et sa reproductibilité13. Ce système d’exposition est un système d’exposition cellulaire in vitro qui permet une exposition homogène des cellules aux gaz, aux particules ou aux atmosphères complexes (p. ex. fumée de cigarette) à l’ALI en raison de son concept de distribution d’aérosols radiaux et de la conduction de l’aérosol d’essai dans un flux continu sur les cellules16. Le module de base de ce système d’écoulement radial se compose de l’adaptateur d’entrée, du module de guidage d’aérosol avec une distribution d’aérosols radiaux, du module d’échantillonnage et de prise, et d’un module de verrouillage avec une roue à main (Figure 2). Les particules générées atteignent les cellules par l’intermédiaire de l’adaptateur d’entrée et du module de guidage des aérosols et sont déposées sur les inserts de culture cellulaire, qui sont situés dans les trois chambres d’exposition radialement disposées du module d’échantillonnage. Le module de guidage des aérosols ainsi que le module d’échantillonnage peuvent être chauffés en se connectant à un bain d’eau externe17.

Dans le cadre des deux études, les cellules A549 ont été utilisées pour toutes les expériences d’exposition. La lignée cellulaire A549 est une lignée cellulaire épithéliale immortalisée par l’homme qui est très bien caractérisée et a été utilisée comme modèle in vitro pour les cellules épithéliales alvéoliennes de type II dans de nombreuses études toxicologiques. Les cellules sont caractérisées par des corps lamellar, la production de surfactant et un certain nombre de facteurs inflammation-pertinents18. Ils montrent également des propriétés des cellules épithéliales bronchiques en raison de leur production de mucus19. En outre, ils peuvent être cultivés à l’ALI. Bien que cette lignée cellulaire est déficiente dans la construction de contacts cellule-cellule, la culture de ces cellules est beaucoup plus pratique, moins coûteux et les résultats dérivés de celui-ci sont indépendants des donneurs par rapport aux cellules primaires20.

Les cellules A549 ont été enseventées dans des inserts de culture cellulaire de 6 puits (membrane DE PET, 4,67 cm2, taille de pore 0,4 mm) avec une densité de 3,0 x 105 cellules par insert et cultivées pendant 24 h dans des conditions immergées. Les cellules ont ensuite été exposées dans trois laboratoires indépendants à l’air pur et à trois doses d’exposition différentes (25, 50 et 100 'g/cm2) de 20 substances d’essai à l’ALI. La dose d’exposition est corrélée au temps de dépôt, ce qui entraîne un taux de particules constants de 25 g/cm2,50 g/cm2 et 100 g/cm2 sur les cellules après 15, 30 ou 60 min, respectivement. Les particules déposées, cependant, n’ont pas été lavées après dépôt, mais sont restées sur les cellules pendant 24 h. Les temps de dépôt des particules étaient donc de 15, 30 et 60 min, mais l’exposition des cellules a duré 24 h au total. Le taux de dépôt des substances d’essai a été déterminé dans des expériences préliminaires selon les méthodes précédentes17.

La viabilité cellulaire comme indicateur de toxicité a été évaluée 24 h après dépôt de particules à l’aide d’un exemple de viabilité cellulaire. Un accent particulier a été mis sur la qualité des contrôles de l’air pur, l’optimisation et le raffinement du protocole d’exposition, la reproductibilité intra- et inter-laboratoire et l’établissement d’un modèle de prévision (PM). Substances qui ont entraîné une diminution de la viabilité cellulaire en dessous de 50 % (PM 50 %) ou 75% (PM 75%) à l’une des trois doses d’exposition ont été considérées comme exerçant un risque aigu d’inhalation. Les résultats ont ensuite été comparés aux données in vivo existantes (basées sur au moins une étude fiable selon les lignes directrices des tests de l’OCDE (TG) 403 ou TG 43621,22), conduisant à une concordance globale de 85%, avec une spécificité de 83% et une sensibilité de 88%23.

Outre la mesure de la viabilité cellulaire, d’autres critères d’évaluation tels que la libération de cytokine, l’examen du lysate cellulaire ou l’intégrité de la membrane par l’analyse DeLH peuvent être évalués, mais n’ont pas été requis pour l’étude de validation. Ainsi, le système d’exposition (p. ex., LE RFS DE L’ESSAI DE CULTEX) a été prouvé comme un système de dépistage prédictif pour l’évaluation qualitative de la toxicité par inhalation aigue des particules testées dans l’air, ce qui représente une méthode alternative prometteuse à l’expérimentation animale. Le protocole suivant est recommandé pour les expériences d’exposition aux particules en suspension dans l’air à l’aide de ce système d’exposition.

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Protocol

REMARQUE : Le protocole d’une expérience d’exposition couvre une période de trois jours.

Jour 1

1. Préparations générales et culture des cellules

REMARQUE : La ligne épithéliale d’adénocarcinome humain d’adénocarcinome A549 a été employée pour des expériences d’exposition. Les cellules doivent être manipulées dans des conditions stériles. D’autres lignées cellulaires qui conviennent à la culture à l’ALI peuvent être utilisées.

  1. Préparer le milieu de croissance (le milieu essentiel minimum (DMEM) de Dulbecco, complété par 10 % de sérum bovin fœtal (SGF) et de 5 g/mL de gentamycine) et le milieu d’exposition (DMEM, complété par une gentamycine de 5 g/mL et une concentration finale de 100 mM de HEPES).
  2. Culture Cellules A549 dans le milieu de croissance à 37 oC dans une atmosphère humidifiée contenant 5% de CO2.
  3. Cultiver des cellules dans un flacon de culture cellulaire de 75 cm2 (T-75) dans 14 ml de milieu de croissance jusqu’à une confluence de 80-90% avant de se diviser (tous les 2-3 jours) et un passage de 35.
  4. Calculer le volume de suspension et le nombre requis d’inserts de culture cellulaire (trois inserts de culture cellulaire comme contrôle d’incubateur et insertions de culture cellulaire pour l’exposition à l’air pur et aux particules) et les plaques de culture cellulaire.
  5. Avant la trypsinisation et l’ensemencement des cellules, ajouter 2,5 ml de milieu de croissance tempéré à chaque puits d’une plaque de 6 puits. Placez les inserts de culture cellulaire sans cellules soigneusement à l’intérieur des puits et ajoutez 1 ml de milieu de croissance à chaque insert de culture cellulaire. Incuber les plaques de 6 puits pendant au moins 30 min dans l’incubateur (37 oC, 5 % CO2).

2. Trypsinisation des cellules

  1. Tempère phosphate tamponné saline (PBS) et milieu de croissance à 37 oC et la trypsine/EDTA (0,05 %/ 0.02%) solution à température ambiante.
  2. Aspirez le milieu de culture cellulaire du flacon de culture cellulaire et lavez soigneusement les cellules avec 8 ml de PBS préchauffé.
  3. Retirez le PBS, ajoutez 2 ml de la trypsine/EDTA (0,05%/ 0.02%) solution aux cellules et incuber pendant 6 min maximum dans l’incubateur à 37 oC. Contrôler le processus de détachement au microscope.
  4. Neutraliser l’activité de la trypsine en ajoutant 8 ml de milieu de croissance préchauffé, détacher les cellules en tapant doucement latéralement sur le flacon et resuspendre les cellules en faisant des pipes répétées de haut en bas.
  5. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 50 ml. Déterminer le numéro de cellule pour la suite (p. ex., ensemencement des cellules, passage des cellules).

3. Détermination du numéro de cellule

REMARQUE : La concentration cellulaire a été déterminée à l’aide d’un compteur cellulaire ou de chambres de comptage.

  1. Diluer 100 l de la suspension de culture cellulaire dans une tasse remplie de 10 ml de solution isotonique. Inclinez la tasse lentement sans trembler.
  2. Déterminer le nombre de cellules/mL viables et la viabilité cellulaire en fonction des paramètres de mesure propres aux cellules des cellules A549.

4. Ensemencement des cellules sur des membranes microporeuses dans les inserts de culture cellulaire

REMARQUE : Le système d’exposition est équipé d’adaptateurs spéciaux pour permettre l’utilisation d’inserts commerciaux de différents fournisseurs et de différentes tailles. Pour ces expériences d’exposition, des plaques de 6 puits et les inserts de culture cellulaire correspondants ont été utilisés. Toutes les étapes de travail doivent être effectuées dans des conditions stériles.

  1. Fournir un milieu de croissance préchauffé dans des conditions de culture cellulaire stérile (flux laminaire).
  2. Préparer un volume suffisamment élevé de la suspension cellulaire avec une concentration cellulaire de 3,0 x 105 cellules/mL.
  3. Après avoir tempéré les plaques pendant 30 min, aspirer le milieu dans la culture cellulaire insère et graines 1 ml de cellules A549 avec une densité de 3,0 x 105 cellules/mL dans chaque insert de culture cellulaire. Distribuez la suspension de la cellule par basculement doux.
  4. Incuber les inserts de culture cellulaire avec la suspension cellulaire pendant 24 h (37 oC et 5 % CO2).

5. Pressage des substances d’essai

REMARQUE : Les substances d’essai ont été pressées dans des gâteaux en poudre à l’aide d’une presse hydraulique entièrement contrôlable. Le paquet de presse peut appliquer une force maximale de 18 kN, qui est affichée comme la pression actuelle de l’huile (dans la barre) du paquet de presse. Les conditions de presse (pression pressante, temps de pressage) des substances d’essai inconnues doivent être établies et caractérisées dans les tests préliminaires. Selon les propriétés de presse d’une substance, différents paramètres pressants et différents types de piston pressant peuvent être utilisés.

CAUTION : Portez de l’équipement de protection lorsque vous pressez des substances toxiques ou dangereuses.

  1. Définir le temps de pression via le contrôle du temps sur le côté avant de la presse.
  2. Ouvrez l’alimentation en air comprimé à la soupape à air comprimé. Régler la pression d’air comprimé à environ 2 barres (indiquée par une jauge de pression sur le côté avant) à l’aide du régulateur de pression sur le côté avant de la presse ou sur la soupape d’air comprimé de l’alimentation en air comprimé. Sortez le tiroir, appuyez sur le bouton Appuyez sur et lisez la pression sur le commutateur de pression numérique.
    1. Lisez juste la pression au régulateur de pression si la pression est trop élevée ou trop basse.
  3. Assemblage du récipient de substance et de s’assurer que le cylindre de verre est correctement centré (Figure supplémentaire 1). Remplir le contenant de substance avec une petite quantité de la substance d’essai. Insérez le piston dans le contenant de substance et tournez-le légèrement d’avant en arrière pour répartir uniformément la poudre dans le récipient.
  4. Placez le contenant de substance avec le piston dans le tiroir et appuyez sur le bouton Appuyez sur. Le piston hydraulique de la presse se déplace sur le piston et exerce une pression sur la substance d’essai pour le temps de pressage ensemble. Ouvrez le tiroir et retirez le piston.
  5. Répétez les étapes 5.3 et 5.4 jusqu’à ce que le contenant de substance soit au moins à moitié plein.
  6. Après l’achèvement des travaux de pressage, retirer le contenant de substance du tiroir et le retourner à l’envers pour enlever les particules lâches et déposées.
  7. Si le contenant de substance n’est pas nécessaire le même jour, fermez le contenant de substance avec le parafilm afin d’empêcher la substance d’essai de sécher ou d’absorber l’humidité.

Jour 2

6. Assemblage du système d’exposition et raccordement de l’équipement périphérique

REMARQUE : Une vue plus détaillée est fournie à la figure 3, à la figure 2 et à la figure 3 supplémentaire. Assembler les deux modules et le générateur d’aérosols selon les instructions du fabricant.

  1. Placez le système d’exposition sur une surface solide et uniforme, avec l’approvisionnement en eau tourné vers l’avant. Connectez les contrôleurs de débit de masse avec le générateur d’aérosols et une bouteille à trois cous reliée au module pour une exposition à l’air pur.
  2. Connectez le contrôleur de débit et la pompe à vide. Connectez les tubes des contrôleurs de débit avec le connecteur de tube sur les pièces jointes du module de guidage d’aérosol. Connectez les tubes de l’autre côté des contrôleurs de débit avec la pompe à vide. Assurez-vous que le flux va du module à travers les contrôleurs de flux à la pompe à vide.
  3. Connectez le bain d’eau avec l’approvisionnement en eau de chauffage. L’approvisionnement en eau va du bain d’eau à l’inlet d’eau sur le module de guidage d’aérosol. Connectez la sortie d’eau du module de guidage des aérosols avec l’inlet d’eau du module d’échantillonnage. Fermez le cercle avec une connexion de la sortie d’eau du module d’échantillonnage au bain d’eau.
  4. Placez le générateur d’aérosols, y compris l’elutriateur, près du module d’exposition et connectez les lignes excédentaires de l’élutriateur et le module d’exposition et d’air pur avec de grands microfiltres, et l’aspiration des chambres d’exposition avec de petits microfiltres (p. ex., filtres jetables). L’élutriateur sert de réservoir pour l’atmosphère de particules générées et retient les particules plus grandes que les environs 7 m, tandis que les particules plus petites sont transportées vers le module d’exposition.
  5. Connectez l’ordinateur utilisé pour contrôler la génération d’aérosols au port USB du haut du générateur d’aérosols via un câble USB et l’alimentation électrique au port d’alimentation. Connectez la prise d’alimentation AC de l’unité d’alimentation à une prise (220-240 V).
  6. Connectez les tuyaux pour l’alimentation moyenne et l’enlèvement avec deux pompes. Au lieu d’utiliser une pompe pour l’approvisionnement moyen, le milieu peut également être rempli manuellement.

7. Préparation à l’exposition à l’air pur et aux particules

  1. Allumez la pompe à vide, les contrôleurs d’écoulement et le bain d’eau (37 oC) pendant une période d’échauffement d’au moins 30 min.
  2. Ouvrez l’alimentation en air comprimé. Définir les contrôleurs de débit de masse à 8 L/min pour la ligne d’approvisionnement du générateur d’aérosols et à 3 L/min pour la ligne d’approvisionnement de la bouteille à trois cous. Fermez les onglets des contrôleurs de débit de masse.
    REMARQUE : Ces valeurs peuvent varier en fonction des caractéristiques de la substance d’essai.
  3. Ajuster les contrôleurs de débit via l’ordinateur pour réguler le débit du module (1,5 L/min) et l’aspiration de la chambre (30 ml/min).

8. Test de fuite du système d’écoulement radial

REMARQUE : La vérification des fuites doit être effectuée sous vide et pour les deux modules (module d’exposition et d’air pur) afin de s’assurer que le module a été réassemblé correctement.

  1. Retirez l’adaptateur d’inlet et le réflecteur de condensat du module de guidage des aérosols. Fermez les trois aérosols d’alimentation du module de guidage des aérosols avec des bouchons et les connexions d’approvisionnement moyen au module d’échantillonnage avec des volets factices.
  2. Connectez les lignes de vide sans filtre avec le connecteur tube du module de guidage des aérosols. Fermez le module à l’aide de la roue à main et mesurez la valeur des contrôleurs de débit. Les valeurs devraient diminuer quelques minutes après la fermeture en dessous de 5 ml/min.
  3. Après la vérification de l’imperméabilité, retirez tous les bouchons et les volets factices, insérez l’adaptateur d’entrée et le réflecteur de condensat dans le module de guidage d’aérosol et connectez les tuyaux pour l’approvisionnement moyen et l’enlèvement.

9. Génération d’aérosols

  1. Démarrer l’ordinateur et le logiciel (Figure supplémentaire 4). Démarrez le logiciel de générateur d’aérosols en cliquant doublement sur le bouton de démarrage du générateur d’aérosols sur le bureau de l’ordinateur. Une fenêtre de message s’affiche et demande si les paramètres doivent être réinitialisés ou non. Cliquez oui si le logiciel est démarré pour la première fois ce jour-là. Définir les valeurs de la position de glissement et de la position de la raquette aux valeurs par défaut. Cliquez sur Non pour conserver les valeurs de la position de diapositive et de la position de la limite ou la diapositive n’est pas en position de départ.
  2. Visser un grattoir de substance dans le tuyau, qui est situé dans l’ouverture centrale du dessus du générateur d’aérosols.
    REMARQUE : Selon les caractéristiques de la presse, des types distincts de grattoir sépeutur peuvent être utilisés.
  3. Utilisez le bouton Mode Homing si le grattoir de substance n’est pas dans la position la plus basse.
  4. Placez le contenant de substance avec le matériau d’essai pressé à l’envers sur le grattoir à substance. Assurez-vous que le verre du contenant de substance fait face à l’avant. Assurez-vous que les deux trous dans le contenant de substance s’adaptent sur les deux broches du dessus du générateur d’aérosols. Placez la plaque de verrouillage dans la fente sur le récipient de substance et serrez la vis noire.
  5. Modifier les valeurs de l’alimentation (0,24 à 20 mm/h) et de la rotation (1 à 800 tours/h) aux paramètres souhaités. La concentration de particules peut être modifiée en augmentant ou en diminuant la valeur d’alimentation ou le débit de gaz porteur.
  6. Utilisez les flèches vers le bas pour pousser vers le bas la glissière avec le contenant de substance jusqu’à ce que le grattoir de substance soit près de la substance pressée.
  7. Ouvrez l’alimentation en air comprimé au générateur d’aérosols d’un robinet du contrôleur de débit de masse et démarrez la génération d’aérosols en cliquant sur le bouton Démarrer. Définir le taux d’alimentation à 15-20 mm/h pour éviter de longs temps d’attente.
  8. Contrôlez la bonne génération de particules en observant le nuage de poussière fine avec une petite lampe de poche (positionnée par le bas derrière le tube de verre de l’Elutriator). Modifiez la valeur de Feed vers les réglages souhaités lorsque la première vapeur d’aérosol atteint en permanence l’elutriateur et cliquez sur le bouton Stop.

10. Expériences d’exposition

  1. Démarrez l’approvisionnement moyen avec un milieu d’exposition préchauffé et remplissez les modules d’échantillonnage jusqu’à ce que les tuyaux d’abaissement soient couverts pendant l’ouverture du module. Utilisez la pompe moyenne ou remplissez le milieu manuellement (25 ml par chambre d’exposition individuelle).
  2. Insérer des inserts de culture cellulaire aveugle (inserts sans cellules) dans le module d’exposition. Pomper le milieu d’exposition vers le bas jusqu’à ce que les tuyaux d’abaissement sont couverts avec le milieu et le côté inférieur des inserts sont en contact avec le milieu.
  3. Démarrez le générateur d’aérosols, fermez le module d’exposition et connectez le module d’exposition à la sortie du module d’exposition du générateur d’aérosols. Donnez au générateur d’aérosols un délai d’au moins 20-30 minutes avant le début des expositions afin de permettre une génération stable de particules.
  4. Préparer les plaques post-incubation pour les commandes de l’incubateur et les inserts de culture cellulaire exposée pendant la période de plomb. Ajouter 1,5 ml de milieu de croissance par puits et incuber les plaques dans l’incubateur (37 oC, 5 % CO2).
  5. Après le délai, scellez la sortie du module d’exposition de l’elutriator à l’avance à l’avance et retirez les inserts abat-jour. Remplissez le milieu d’exposition (à l’aide de la pompe ou manuellement) jusqu’à ce que les tuyaux d’abaissement soient recouverts de milieu. Maintenant, ouvrez également l’approvisionnement en air comprimé au module d’air pur avec le robinet du contrôleur de débit de masse (3 L/min)
  6. Retirez les inserts de culture cellulaire des plaques de 6 puits à l’aide d’une pince à épiler. Verser soigneusement le milieu de croissance de la culture cellulaire s’insère en renversant les inserts et en aspirer et jeter le liquide résiduel à l’aide d’une pipette. Placez les inserts dans les chambres d’exposition des deux modules, le module d’exposition et d’air pur.
  7. Fermez les modules et commencez les expériences d’exposition en connectant le module d’exposition à la sortie du module d’exposition du générateur d’aérosols et au module d’air pur à l’approvisionnement en gaz du transporteur simultanément.
    REMARQUE : La concentration de particules peut être modifiée en augmentant/diminuant la valeur d’alimentation, le débit de gaz porteur ou le moment de l’exposition.
  8. Débranchez les modules d’exposition et d’air pur après la fin de l’expérience et scellez la sortie du module d’exposition.
  9. Arrêtez l’alimentation en air comprimé et le générateur d’aérosols en cliquant sur le bouton Stop.
  10. Ouvrez le module d’exposition et d’air pur et transférez les inserts de culture cellulaire sur les plaques préparées après l’incubation à l’aide d’une pince à épiler. Incuber les plaques de 6 puits pendant 24 h (37 oC, 5 % CO2) à l’ALI.
    REMARQUE : Répétez les étapes 10.5 -10.10 si d’autres expériences d’exposition sont prévues.
  11. Soulevez les inserts de culture cellulaire, qui sont utilisés comme contrôles d’incubateur à l’ALI dans les mêmes conditions que la culture cellulaire exposée insère et les incube pendant 24 h (37 oC, 5 % CO2) à l’ALI.
  12. Utilisez le bouton Mode Homing pour enlever le contenant de substance. Fermez le logiciel de générateur d’aérosols en cliquant sur le X dans le coin supérieur droit et éteignez l’ordinateur.
  13. Après avoir terminé toutes les expériences d’exposition, nettoyez le générateur d’aérosols et les deux modules d’exposition. Fermer le contenant de substance avec du parafilm si la substance d’essai sera encore utilisée dans les prochains jours.

Jour 3

11. Viabilité cellulaire

REMARQUE : La viabilité cellulaire a été déterminée 24 h après dépôt de particule en mesurant l’activité mitochondriale en utilisant l’analyse WST-1. L’assay a été effectué selon le protocole du fabricant. La viabilité des cellules peut également être déterminée en utilisant d’autres tests de viabilité cellulaire (p. ex., XTT).

  1. Tempérer le milieu de croissance à 37 oC et décongeler la solution WST-1 protégée de la lumière. Préparer un nombre approprié de nouvelles plaques de 6 puits avec un milieu de croissance de 2,5 ml par puits et incuber les plaques dans l’incubateur.
  2. Préparer la dilution Du TSM-1 en diluant une quantité suffisante de WST-1 1:7 dans le milieu de croissance
  3. Insérer la culture cellulaire insère 24 h après l’exposition dans les nouvelles plaques préparées 6 puits. Ajoutez 1 ml de la solution WST-1 fraîchement préparée à chaque insert de culture cellulaire. Basculer soigneusement les plaques afin de répartir la solution de façon homogène sur les cellules. Incuber les plaques de 6 puits avec les inserts de culture cellulaire pendant 1 h (37 oC, 5 % CO2).
  4. Transférer 100 l du supernatant dans des tripliciats de chaque 6 puits à une assiette de 96 puits. Mesurer l’absorption à 450 nm avec une longueur d’onde de référence de 650 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques.

12. Statistiques

  1. Normaliser la viabilité cellulaire des contrôles individuels de l’incubateur à 100%.
  2. Exprimez la viabilité des cellules exposées par rapport aux contrôles individuels de l’incubateur. La cytotoxicité des substances d’essai a été comparée aux contrôles respectifs d’incubateur et utilisée comme indicateur de toxicité.

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Representative Results

Le CULTEX RFS est un système d’exposition in vitro modulaire spécialement conçu qui permet l’exposition directe et homogène des cellules de l’ALI. Dans le cadre d’une ancienne étude de pré-validation, l’applicabilité générale de ce système d’exposition et sa transférabilité, sa stabilité et sa reproductibilité ont été démontrées avec succès. Dans le cadre d’un récent projet de recherche financé par le Ministère fédéral allemand de l’éducation et de la recherche, le système d’exposition a été validé avec succès et établi comme modèle de prévision (PM) pour les risques aigus d’inhalation des composés testés. Comme la qualité des contrôles de l’air pur s’est avérée être un paramètre critique au cours de l’étude de pré-validation, plusieurs optimisations de protocole et de méthode (par exemple, changement des inserts de culture cellulaire, stabilisation du pH du milieu d’exposition en augmentant la concentration de HEPES à 100 mM) ont été mises en œuvre au début de l’étude de validation, conduisant à des résultats très stables et reproductibles et à une amélioration substantielle des données de viabilité de l’air pur dans chacun des trois laboratoires (Figure 4). Les cellules A549 ont ensuite été exposées à l’ALI à trois doses d’exposition différentes (25, 50 et 100 'g/cm2) de 20 substances d’essai présélectionnées et codées dans les trois laboratoires indépendants, et la cytotoxicité (utilisée comme indicateur de toxicité) a été comparée aux contrôles respectifs de l’incubateur. Treize substances codées ont ainsi été testées dans des tripliques, sept substances codées en tant qu’expériences uniques. Les substances d’essai ont été considérées comme exerçant un risque aigu d’inhalation lorsque la viabilité des cellules a diminué en dessous de 50 % (PM 50 %) 75 % (PM 75 %).

Comme le montre de façon exemplaire la figure 5, l’exposition des cellules A549 à différentes substances d’essai n’a montré aucune toxicité moyenne ou forte. Comme toutes les expériences ont été menées indépendamment dans trois laboratoires, les données ont été analysées concernant la reproductibilité à l’intérieur et entre les laboratoires et la prévisibilité du système d’exposition. Selon le PM appliqué (PM 50% ou PM 75%), la reproductibilité interne et entre-laboratoire s’est étendue de 90-100%, démontrant la robustesse et la transférabilité de cette méthode. Comme toutes les substances testées disposaient de données de référence in vivo pertinentes (basées sur au moins une étude fiable selon le TG 403 ou le TG 436 de l’OCDE à l’aide d’un protocole Traditionnel LC50 et d’un protocole de concentration x temps (C x t), la comparaison de les données in vivo et in vitro ont révélé une concordance globale de 85 % (17/20) avec une spécificité de 83 % (10/12) et une sensibilité de 85 % (7/8) (tableau 1). Seules deux substances ont été classées comme faussement positives et une comme faussement négative.

En résumé, nos résultats de l’étude de validation présentent une méthode de criblage transférable, reproductible et prédictive pour l’évaluation qualitative de la cytotoxicité pulmonaire aigue des particules aéroportées sélectionnées.

Figure 1
Figure 1 : Exposition des cellules à l’ALI ou dans des conditions immergées. Les cellules A549 peuvent être exposées avec une substance d’essai (flèches et points bleus) à l’ALI (à gauche) par une inlet du système d’exposition ou avec la substance d’essai diluée dans le milieu d’exposition (points bleus) créant des conditions de submerse (droite). Les lignes pointillées rouges représentent les niveaux de remplissage du milieu d’exposition (rouge vif) dans la configuration expérimentale respective. Ce chiffre a été modifié à partir de Tsoutsoulopoulos et coll.24. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Le module d’exposition. Aperçu schématique du module de base du système d’écoulement radial composé de l’adaptateur d’entrée, du module de guidage d’aérosol, du module d’échantillonnage et de prise et d’un module de verrouillage avec une roue à main. Ce chiffre a été modifié à partir d’Aufderheide et coll.17. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Aperçu du système d’exposition. Les composants sont les deux modules d’exposition pour l’air pur et l’exposition aux particules, le générateur d’aérosols, y compris l’élutriateur et l’unité de contrôle correspondante, et les pompes moyennes. Ce chiffre a été modifié à partir d’Aufderheide et coll.17. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Données sur la viabilité de l’air pur après optimisation de la méthode d’essai. L’exposition des cellules à l’air pur n’a entraîné aucune diminution de la viabilité cellulaire au fil du temps, ce qui a entraîné une amélioration substantielle des données sur la viabilité de l’air pur par rapport à l’étude de prévalidation. Toutes les commandes à l’air pur ont été mises en commun pour chaque laboratoire (Lab 1-3) et le temps d’exposition (n - 46 par laboratoire et point dans le temps). Les données sont affichées sous forme de parcelles de boîte avec une ligne médiane et la portée indiquée par les moustaches. Ce chiffre a été modifié à partir de Tsoutsoulopoulos et coll.23. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Exposition des cellules A549 à différentes substances d’essai. (A) L’exposition des cellules A549 au carbure de tungstène(IV) n’a montré aucune diminution de la viabilité cellulaire pour les trois doses d’exposition différentes et semblait être non toxique (n - 3 par dose de laboratoire et d’exposition). (B) L’exposition des cellules à l’anhydride tétrabromophthalal a donné lieu à tous les laboratoires dans une toxicité modérée présentant une bonne courbe de réponse de dose (n - 1 par dose de laboratoire et d’exposition). (C) Zinc dimethyldithiocarbamate a montré une forte toxicité, conduisant à une diminution de la viabilité cellulaire déjà après une dose déposée de 25 g/cm2 (n - 3 par laboratoire et dose d’exposition). Les barres d’erreur représentent les écarts types. Ce chiffre a été modifié à partir de Tsoutsoulopoulos et coll.23. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Résultats de référence in vivo Résultats in vitro
Substance TG de l’OCDE Réglementation CLP Toxicité PM50% PM75% (en) Conforme in vivo / in vitro
Carbure de tungstène(IV) 403 n. c 0 0 0 Oui
Tungstène(IV) carbide nano - n. c. 0 0 0 Oui
N,N'-ethylenebis (N-acetylacetamide) EPA OPPTS 870.1300 n. c. 0 0 0 Oui
Dioxyde de silicium 403 n. c. 0 0 0 Oui
Diammonium hydrophophat-phosphate 403 n. c. 0 0 0 Oui
Fluorophosphate de Disodium 403 n. c. 0 0 0 Oui
Oxyde de néodyme 436 n. c. 0 0 0 Oui
Monopersulfate d’hydrogène de potassium 403 n. c. 0 0 0 Oui
Cyclohepta-pentylose 403 n. c. 0 0 0(2x) / 1(1x) (Oui)
Vanadium(III) oxyde 403 n. c. 0 0 0(2x) / 1(1x) (Oui)
Pyrophosphate de tétrapotassium 403 n. c. 0 1 1 non
Anhydride tétra-bromophthal 403 (similaire) n. c. 0 1 1 non
Chlorure de cetylpyridinium 403 Tox aigu. 2 1 1 1 Oui
Sel de sodium N-Lauroylsarcosine 403 Tox aigu. 2 1 1 1 Oui
Zinc dimethyldithio-carbamate 403 Tox aigu. 2 1 1 1 Oui
Hydroxyde de cuivre(II) 403 Tox aigu. 2 1 1 1 Oui
Sélénite de zinc 436 Tox aigu. 3 1 1 1 Oui
Métavanadate de sodium 403 Tox aigu. 4 1 1 1 Oui
Pentaoxide de Divanadium 403 Tox aigu. 4 1 1 1 Oui
Telluride cadmium 403 Tox aigu. 4 (n. c.) 1 0 0 non
n. c. - non classé; 0 - non toxique; 1 - toxique; Classification, étiquetage et emballage cLP

Tableau 1 : Conformément aux résultats in vivo et in vitro. Sur 20 substances, 10 substances ont été classées comme correctement négatives, et sept substances correctement comme positives, ce qui a conduit à une concordance de 85% (17/20). Ce tableau a été modifié à partir de Tsoutsoulopoulos et coll.23. (Test no 403 : Toxicité par inhalation aigue, essai no 436 : Toxicité par inhalation aigue - Méthode de classe toxique aigue; Tox aigu. 2 - Fatal, Aigu Tox. 3 - toxique, Tox aigu. 4 - nocif).

Supplementary Figure 1
Figure supplémentaire 1 : Assemblage du contenant de substances. Photo tirée du manuel d’utilisation de CULTEX DG (Dust Generator). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Supplementary Figure 2
Figure supplémentaire 2 : Module de guidage aérosol du système d’exposition. A) Vue supérieure et b) vue du bas du module de guidage aérosol. Photo tirée du manuel d’utilisation de CULTEX RFS (Radial Flow System). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Supplementary Figure 3
Figure supplémentaire 3 : Le générateur d’aérosols. A) Aperçu schématique du générateur d’aérosols, composé du dessus du générateur d’aérosols et de l’elutriator. Vue détaillée de B) le dessus du générateur d’aérosols et C) l’Elutriator. Photo tirée du manuel d’utilisation de CULTEX DG (Dust Generator). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Supplementary Figure 4
Figure supplémentaire 4 : Le logiciel de commande de générateur d’aérosol. Photo tirée du manuel d’utilisation de CULTEX DG (Dust Generator). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

De nombreux modèles d’essais de toxicité par inhalation non animale ont été développés ces dernières années afin d’obtenir des informations sur le risque aigu d’inhalation de particules inhalables et de réduire et de remplacer les expériences animales selon le principe 3R25.

En termes de modèles de culture cellulaire, l’exposition des cellules peut se faire dans des conditions immergées ou à l’ALI. L’exposition des cellules dans des conditions immergées peut affecter les propriétés physico-chimiques et, par conséquent, les propriétés toxiques d’une substance d’essai12. Les modèles in vitro d’inhalation d’ALI, cependant, imitent la situation d’exposition humaine avec une similitude biologique et physiologique plus élevée que l’exposition submergée et sont donc mieux adaptés pour analyser la toxicité aigue d’inhalation des particules en suspension dans l’air. L’importance du RFS DEL DEL de CULTEX par rapport à d’autres modules d’exposition existants n’est pas seulement l’exposition des cellules dans des conditions D’ALI, mais aussi la distribution et le dépôt très homogènes des particules. Contrairement aux modèles d’exposition séquentielle avec guidage linéaire des aérosols, la conception modulaire de cette méthode d’exposition permet une ligne d’approvisionnement radiale conduisant à un dépôt très homogène de particules sur les cellules17.

Le point le plus important pour les expériences d’exposition réussies est la qualité stable et congruente des commandes d’air pur. Une attention particulière doit être accordée au fait que la viabilité des contrôles de l’air pur n’est pas affectée au fil du temps et aussi proche que possible à 100% par rapport aux contrôles d’incubateur correspondants. Les facteurs qui jouent un rôle important en ce qui concerne la viabilité de l’air pur sont le choix d’inserts appropriés de culture cellulaire, la valeur du pH du milieu d’exposition et la composition de l’air pur. En termes d’insertions de culture cellulaire, une bonne qualité et une forte densité de pores doivent être garanties. Cela assure un meilleur approvisionnement moyen et une humidité relative plus élevée à l’intérieur de la culture cellulaire inserts, protégeant les cellules de la dessiccation26. En utilisant des inserts de culture cellulaire avec des ouvertures latérales de paroi, des manches d’insertion spéciales doivent être employées afin d’éviter la fuite des particules d’essai par les ouvertures latérales de mur qui pourraient mener à une contamination possible du milieu d’exposition. Un décalage de la valeur du pH supérieur à 8 peut déjà avoir un effet toxique sur les cellules et donc conduire à une altération de la viabilité cellulaire27. Cela se produit en particulier dans les temps de dépôt de particules prolongées (par exemple, 60 min) si l’air pur contient moins de 5% de CO2 ou la concentration HEPES du milieu d’exposition est trop faible qui doit être évitée.

Une question cruciale du protocole est le pressage des substances d’essai. Les substances d’essai doivent être suffisamment comprimées à un gâteau en poudre dans le récipient de substance afin de permettre une exposition stable de particules. Ainsi, les substances doivent être caractérisées dans des expériences préliminaires concernant leurs propriétés de presse et afin d’obtenir des informations sur quel piston de presse, type de lame de raclage ou taux d’alimentation doivent être utilisés.

La pression de pression maximale de la presse hydraulique, cependant, est de 10 kN, ce qui représente en même temps la limite de charge pour le cylindre de verre et donc, une limitation du processus de pressage. Le contenant de substance ne peut pas résister à des forces de pressage plus élevées que 10 kN. Une force de pressage plus élevée pourrait offrir le pressage des substances cristallines et ainsi, étendre l’applicabilité de cette presse, mais nécessiterait des contenants de substances plus robustes.

En outre, ce système d’exposition, principalement conçu pour l’étude des expositions aux particules en suspension dans l’air, peut être adapté à l’exposition d’aérosols liquides et de gaz hautement toxiques et agressifs selon la méthode de production d’aérosols et le matériau des modules d’exposition. L’échange du générateur d’aérosols avec un nébuliseur de membrane et l’utilisation d’un module d’exposition en acier inoxydable ont permis l’exposition des cellules aux aérosols liquides hautement toxiques24.

Un autre problème critique est l’effet de surcharge. La viabilité cellulaire peut être affectée non seulement par les propriétés toxicologiques d’une substance d’essai, mais aussi par la quantité d’une substance déposée sur les cellules. Ce système d’exposition montre en effet une similitude substantielle avec les conditions physiologiques dans la région alvéolienne humaine, mais ne contient aucun mécanisme de dégagement pour enlever les particules. Il est donc très important que la viabilité de la cellule ne soit pas altérée en raison d’un trop grand nombre de particules.

Le protocole décrit l’exposition homogène des cellules pulmonaires humaines cultivées à l’ALI aux particules en suspension dans l’air. La reproductibilité, sa robustesse et sa transférabilité rendent le système d’exposition actuel applicable en tant que méthode de dépistage in vitro pour l’évaluation qualitative des particules inhalables en ce qui concerne leur toxicité par inhalation. Étant donné qu’aucune autre méthode in vitro n’a été suffisamment validée jusqu’à présent, la toxicité pulmonaire aigue est encore évaluée en exposant les animaux (p. ex., les chambres du corps entier, le nez ou les méthodes buccales seulement). Toutes les lignes directrices communément acceptées de l’OCDE pour la toxicité par inhalation aigue (p. ex. TG 403, TG 433 et TG 436) sont basées sur des modèles animaux actuellement21,22,28,29. Une orientation future sera donc de demander à l’Organisation de coopération et de développement économiques (OCDE) l’acceptation comme ligne directrice de test in vitro pour la toxicité de l’inhalation aigue.

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Disclosures

Les auteurs AT, KG, AB, SH, HM, TG, HT et DS n’ont rien à divulguer. La société Cultex Technology GmbH (anciennement Cultex Laboratories GmbH) produit des instruments (par exemple, CULTEX RFS, CULTEX DG) utilisés dans cet article. NM a été employé de Cultex Laboratories GmbH au cours de cette étude. OK est un employé de Cultex Technology GmbH (anciennement Cultex Laboratories GmbH). Le brevet PCT/EP2009/007054 pour l’appareil est retenu par le fondateur de la Cultex Technology GmbH Prof. Dr. Ulrich Mohr (anciennement Cultex Laboratories GmbH).

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par le Ministère fédéral allemand de l’éducation et de la recherche (Bundesministerium f’r Bildung und Forschung, BMBF, Allemagne (Grant 031A581, sous-projet A-D)) et par la Fondation allemande de la recherche (Deutsche Forschungsgesellschaft, DFG, Groupe de formation à la recherche GRK 2338).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells
A549 ATCC CCL-185
Cell culture medium and supplies
DMEM Biochrom, Berlin, Germany FG 0415 used as growth medium
DMEM Gibco-Invitrogen, Darmstadt, Germany 22320 used as exposure medium
FBS superior Biochrom, Berlin, Germany S 0615
Gentamycin (10mg/mL) Biochrom, Berlin, Germany A 2710
HEPES 1M Th. Geyer, Renningen, Germany L 0180
PBS Biochrom, Berlin, Germany L 1825
Trypsin/EDTA (0.05%/0.02%) Biochrom, Berlin, Germany L 2143
Cell culture material
CASY Cups Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany REF 05651794
Cell culture plates Corning, Wiesbaden, Germany 3516 6­-well plates
Corning Transwell cell culture inserts Corning, Wiesbaden, Germany 3450 24mm inserts; 6-­well plates; 0.4 µm
Chemicals
CASYton Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany REF 05651808001
Compressed Air (DIN EN 12021) Linde Gas Therapeutics GmbH, Oberschleißheim, Germany 2290152
WST-1 Abcam, Cambridge, United Kingdom ab155902
Instruments + equipment
CASY Cell Counter Schärfe System GmbH, Reutlingen, Germany
Circulation thermostat LAUDA, Lauda-Königshofen, Germany Ecoline RE 100
CULTEX HyP - Hydraulic Press Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX insert sleeve Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX RFS - Radial Flow System Type 2 (module for particle exposure) Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX RFS - Radial Flow System Type 2 (module for clean air exposure) Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX supply
Flow controller 0-30 ml/min (IQ-Flow) Bronkhorst Deutschland Nord GmbH
Flow controller 0-1,5 l/min (EL-Flow) Bronkhorst Deutschland Nord GmbH
Filters (large) Munktell & Filtrak GmbH, Sachsen, Germany LP-050 Munktell Sterile Filter; Particle retention efficiency > 99,999%
Filters (small) Parker Hannifin Corporation, Mainz, Germany 9933-05-DQ Balston disposable filter
Medium pump Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Germany Ismatec IPC High Precision Multichannel Dispenser digital peristaltic pump
Microplate Reader Infinite M200 Pro Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim, Germany
Vakuum pump KNF, Freiburg, Germany N86 KT.18
Vögtlin mass flow controller 0,2-10 l/min TrigasFI GmbH Vögtlin red-y compact regulator, Typ-Nr.: GCR-C3SA-BA20
Water Bath LAUDA, Lauda-Königshofen, Germany Ecoline Staredition RE 104

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References

  1. Faber, S. C., McCullough, S. D. Through the Looking Glass: In vitro Models for Inhalation Toxicology and Interindividual Variability in the Airway. Applied In vitro Toxicology. 4 (2), 115-128 (2018).
  2. Ambient air pollution: a global assessment of exposure and burden of disease. , World Health Organization. http://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/250141/9789241511353-eng.pdf?sequence=1 (2018).
  3. De Matteis, S., et al. Current and new challenges in occupational lung diseases. European Respiratory Review. 26 (146), 1-15 (2017).
  4. LANUV Nordrhein-Westfalen. Gesundheitliche Risiken von Nanomaterialien nach inhalativer Aufnahme. , (2009).
  5. Bérubé, K., et al. In vitro Models of Inhalation Toxicity and Disease. The report of a FRAME workshop. Alternatives To Laboratory Animals. 37 (1), 89-141 (2009).
  6. Lopez, A. D., Murray, C. C. The global burden of disease, 1990-2020. Nature Medicine. 4 (11), 1241-1243 (1998).
  7. Clippinger, A. J., et al. Alternative approaches for acute inhalation toxicity testing to address global regulatory and non-regulatory data requirements: An international workshop report. Toxicology In vitro. 48, 53-70 (2018).
  8. Agrawal, M. R., Winder, C. Frequency and Occurrence of LD50 Values for Materials in the Workplace. Journal Of Applied Toxicology. 16 (5), 407-422 (1996).
  9. Amtsblatt der Europäischen Union. Verordnung (EG) Nr. 1907/2006 des Europäischen Parlaments und des Rates. Europäische Union. 860, (2006).
  10. Huh, D., et al. Reconstituting Organ-Level Lung Functions on a Chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
  11. Fisher, R. L., et al. The Use of Human Lung Slices in Toxicology. Human and Experimental Toxicology. 13 (7), 466-471 (1994).
  12. Lenz, A. G., et al. Inflammatory and Oxidative Stress Responses of an Alveolar Epithelial Cell Line to Airborne Zinc Oxide Nanoparticles at the Air-Liquid Interface. Biomed Research International. 12, (2013).
  13. Steinritz, D., et al. Use of the CULTEX Radial Flow System as an in vitro exposure method to assess acute pulmonary toxicity of fine dusts and nanoparticles with special focus on the intra- and inter-laboratory reproducibility. Chemico-Biological Interactions. 206 (3), 479-490 (2013).
  14. Lacroix, G., et al. Air-Liquid Interface In vitro Models for Respiratory Toxicology Research. Applied In vitro Toxicology. 4 (2), 91-106 (2018).
  15. Eskes, C., Whelan, M. Validation of Alternative Methods for Toxicity Testing. 418, Springer International Publishing. (2016).
  16. Rach, J., Budde, J., Möhle, N., Aufderheide, M. Direct exposure at the air-liquid interface: Evaluation of an in vitro approach for simulating inhalation of airborne substances. Journal Of Applied Toxicology. 34 (5), 506-515 (2014).
  17. Aufderheide, M., Halter, B., Möhle, N., Hochrainer, D. The CULTEX RFS: A comprehensive Technical Approach for the In vitro Exposure of Airway Epithelial Cells to the Particulate Matter at the Air-Liquid Interface. Biomed Research International. 15, (2013).
  18. Lieber, M., Todaro, G., Smith, B., Szakal, A., Nelson-Rees, W. A continuous tumor-cell line from a human lung carcinoma with properties of type II alveolar epithelial cells. International Journal Of Cancer. 17 (1), 62-70 (1976).
  19. Carterson, A. J., et al. A549 lung epithelial cells grown as three-dimensional aggregates: Alternative tissue culture model for Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infection And Immunity. 73 (2), 1129-1140 (2005).
  20. Kim, K. J., Borok, Z., Crandall, E. D. A useful in vitro model for transport studies of alveolar epithelial barrier. Pharmaceutical Research. 18 (3), 253-255 (2001).
  21. OECD. Test No. 403: Acute Inhalation Toxicity. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , OECD Publishing. Paris. (2009).
  22. OECD. Test No. 436: Acute Inhalation Toxicity – Acute Toxic Class Method. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , OECD Publishing. Paris. (2009).
  23. Tsoutsoulopoulos, A., et al. Validation of the CULTEX Radial Flow System for the assessment of the acute inhalation toxicity of airborne particles. Toxicology In vitro. 58, 245-255 (2019).
  24. Tsoutsoulopoulos, A., et al. A novel exposure system generating nebulized aerosol of sulfur mustard in comparison to the standard submerse exposure. Chemico-Biological Interactions. 298, 121-128 (2019).
  25. Russell, W. M. S., Burch, R. L. The principles of humane experimental technique. , Johns Hopkins School of Public Health. http://altweb.jhsph.edu/pubs/books/humane_exp/het-toc (1959).
  26. Tsoutsoulopoulos, A., et al. Optimization of the CULTEX radial flow system for in vitro investigation of lung damaging agents. Toxicology Letters. 244, 28-34 (2016).
  27. Osman, J. J., Birch, J., Varley, J. The response of GS-NS0 myeloma cells to pH shifts and pH perturbations. Biotechnology and Bioengineering. 75 (1), 63-73 (2001).
  28. OECD. Test Guideline 433: Acute Inhalation Toxicity – Acute Toxic Class Method. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , OECD Publishing. Paris. (2018).
  29. OECD. Guidance Document on Inhalation Toxicity Studies. , OECD Publishing. Paris. (2018).

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Médecine Numéro 156 Toxicité pulmonaire aigue in vitro système d’exposition interface air-liquide validation cytotoxicité particules en suspension dans l’air
Évaluation de la toxicité par inhalation aigue des particules aéroportées en exposant les cellules pulmonaires humaines cultivées à l’interface air-liquide
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Tsoutsoulopoulos, A., Gohlsch, K., Möhle, N., Breit, A., Hoffmann, S., Krischenowski, O., Mückter, H., Gudermann, T., Thiermann, H., Aufderheide, M., Steinritz, D. Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface. J. Vis. Exp. (156), e60572, doi:10.3791/60572 (2020).

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