Мы представляем надежную, переносимую и прогностическую систему воздействия in vitro для скрининга и мониторинга частиц, передающихся воздушно-капельным путем, относительно их острой легочной цитотоксичности, подвергая культивируемые клетки легких человека в воздушно-жидком интерфейсе (АЛИ).
Здесь мы представляем специально разработанную модульную систему воздействия in vitro, которая позволяет однородное воздействие культивируемых клеток легких человека в АЛИ на газы, частицы или сложные атмосферы (например, сигаретный дым), обеспечивая тем самым реалистичные физиологические воздействие актической поверхности альвеолярной области человека в воздух. В отличие от последовательных моделей воздействия с линейным аэрозолем, модульная конструкция системы радиального потока отвечает всем требованиям для непрерывного генерации и транспортировки испытательной атмосферы в клетки, однородного распределения и осаждения частиц и непрерывное удаление атмосферы. Этот метод воздействия в первую очередь предназначен для воздействия клеток на частицы, передаваемые воздушно-капельным путем, но может быть адаптирован к воздействию жидких аэрозолей и высокотоксичных и агрессивных газов в зависимости от метода генерации аэрозолей и материала модулей воздействия .
В рамках недавно завершенного исследования валидации эта система воздействия была доказана как переносимый, воспроизводимый и прогностический метод скрининга для качественной оценки острой легочной цитотоксичности частиц, передаваемых воздушно-капельным путем, тем самым потенциальное сокращение или замена экспериментов на животных, которые, как правило, обеспечивают эту токсикологические оценки.
Вдыхание токсичных частиц воздушно-капельным путем является проблемой общественного здравоохранения, что приводит к множеству рисков для здоровья во всем мире и многим миллионам смертей ежегодно1,2. Изменение климата, продолжающееся промышленное развитие и растущий спрос на энергию, сельскохозяйственную и потребительские товары способствовали росту легочных заболеваний за последние годы3,4,5,6. Знания и оценка ингаляционных веществ относительно их острой ингаляционной токсичности являются основой для оценки опасности и управления рисками, но эта информация по-прежнему отсутствует для широкого спектра этих веществ7,8. С 2006 года химическое законодательство ЕС REACH (регистрация, оценка, авторизация и ограничение химических веществ) требует, чтобы уже существующие и вновь введенные продукты подвергали токсикологическую характеристику, включая ингаляционный маршрут перед тем, как быть выставленными на рынок. Поэтому REACH фокусируется на альтернативных и бесживотных методах, реализации принципа «3R» (Замена, уточнение и сокращение экспериментов на животных) и использовании соответствующих моделей in vitro9. В последние годы, много различных и адекватных неживотных ингаляционной токсичности модели тестирования (например, в пробирке клеток культур, легких на чипе модели, точность сократить легких ломтики (PCLS)) были разработаны для того, чтобы оценить острую токсичность ингаляции частиц в воздухе5,7,10,11. С точки зрения моделей культуры клеток in vitro, культивируемые клетки могут подвергаться воздействию в условиях погружения или в АЛИ(рисунок 1). Однако достоверность исследований, связанных с воздействием на воду, ограничена в том, что касается оценки токсичности соединений, передающихся воздушно-капельным путем, особенно частиц. Методы воздействия подводных человек не соответствуют ситуации в живо человека; среда культуры клетки покрывая клетки может повлиять на физико-химические свойства и таким образом, токсические свойства испытательного вещества12,13. Модели ингаляции ALI in vitro позволяют прямое воздействие клеток на испытательные вещества без вмешательства среды клеточной культуры с испытательными частицами, таким образом, имитируя воздействие человека с более высоким физиологическим и биологическим сходством, чем погруженные воздействия12,14.
Для регулирующих процессов, таких как REACH, однако, только животные модели доступны в области острой ингаляции токсикологии, так как никаких альтернативных методов in vitro были достаточно проверены и официально приняты до сих пор14. Для этого тестовые модели должны быть проверены в соответствии с требованиями Справочной лаборатории Европейского союза по альтернативам тестированию на животных (EURL-ECVAM) в отношении действия теста15.
Бывшее предварительное исследование проверки и недавно завершенное исследование проверки успешно продемонстрировали область применения системы выдержки CULTEX RFS и ее переносимость, стабильность и воспроизводимость13. Эта система воздействия является системой воздействия на основе клеток in vitro, которая позволяет однородное воздействие клеток на газы, частицы или сложные атмосферы (например, сигаретный дым) в ALI из-за своей концепции распределения радиальных аэрозолей и проведения испытательного аэрозоля в непрерывном потоке над клетками16. Основной модуль этой системы радиального потока состоит из адаптера входе, аэрозоля направляющий модуль с распределением радиального аэрозоля, модуля выборки и розетки, и блокирующего модуля с ручным колесом(рисунок 2). Генерируемые частицы достигают клеток через адаптер ввода и аэрозольный направляющий модуль и откладываются на вставках клеточной культуры, которые расположены в трех радиографически расположенных камерах модуля выборки. Аэрозольный направляющий модуль, а также модуль отбора проб можно нагревать, подключившись к внешней водяной бане17.
В рамках обоих исследований, A549 клетки были использованы для всех экспериментов воздействия. Клеточная линия A549 является увековеченной эпителиальной линией клеток человека, которая очень хорошо характеризуется и используется в качестве модели in vitro для альвеолярных эпителиальных клеток II типа в многочисленных токсикологических исследованиях. Клетки характеризуются ламеллярными телами, производством сурфактанта и рядом воспаления-соответствующих факторов18. Они также показывают свойства бронхиальных эпителиальных клеток из-за их производства слизи19. Кроме того, они могут быть культивированы в ALI. Хотя эта клеточная линия не хватает в создании клеток клеток контактов, выращивание этих клеток является гораздо более удобным, дешевле дорогих и результаты, полученные из них являются донорами-независимыми по сравнению с первичными клетками20.
A549 клетки были посеяны в 6-колодцклеточной культуры вставки (ПЭТ мембрана, 4,67 см2,размер пор 0,4 мм) с плотностью 3,0 х 105 клеток на вставку и культивируется для 24 ч погруженных в условиях. Затем клетки были выставлены в трех независимых лабораториях для очистки воздуха и трех различных доз воздействия (25, 50 и 100 мкг/см2) 20 испытательных веществ в АЛИ. Доза воздействия коррелирует с временем осаждения, что приводит к постоянной скорости частиц 25 мкг/см2,50 мкг/см2 и 100 мкг/см2 на клетки после 15, 30 или 60 мин, соответственно. Отложенные частицы, однако, не были смыты после осаждения, а оставались на клетках в течение 24 ч. Таким образом, время осаждения частиц составляло 15, 30 и 60 мин, но воздействие клеток длилось в общей сложности 24 ч. Скорость осаждения испытательных веществ была определена в предварительных экспериментах по предыдущим методам17.
Жизнеспособность клеток как индикатор токсичности оценивалась 24 ч после осаждения частиц с помощью анализа жизнеспособности клеток. Особое внимание было уделено качеству контроля за чистым воздухом, оптимизации и уточнению протокола воздействия, внутри- и межлабораторной воспроизводимости и созданию модели прогнозирования (ТЧ). Вещества, которые привели к снижению жизнеспособности клеток ниже 50% (PM 50%) или 75% (PM 75%) в любой из трех доз воздействия считалось, что оказывают острую опасность ингаляции. Результаты были затем по сравнению с существующими данными in vivo (на основе по крайней мере одного надежного исследования в соответствии с руководящим принципом испытаний ОЭСР (TG) 403 или TG 43621,22),что привело к общему согласованию 85%, со специфичностью 83% и чувствительностью 88%23.
Помимо измерения жизнеспособности клеток, другие конечные точки, такие как высвобождение цитокинов, изучение клеточного лизата или мембранной целостности с помощью анализа LDH, могут быть оценены, но не были необходимы для исследования проверки. Таким образом, система воздействия (например, CULTEX RFS) была доказана как система прогностического скрининга для качественной оценки острой ингаляционной токсичности исследуемых частиц, передающихся воздушно-капельным путем, что представляет собой перспективный альтернативный метод тестирования на животных. Следующий протокол рекомендуется для экспериментов воздействия на частицы в воздухе с помощью этой системы воздействия.
Многие неживотные модели тестирования токсичности ингаляции были разработаны в последние годы для того, чтобы получить информацию об острой опасности ингаляции ингаляционных частиц и уменьшить и заменить эксперименты на животных в соответствии с принципом 3R25.
<p class="jove…The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Федеральным министерством образования и исследований Германии (Bundesministerium f’r Bildung und Forschung, BMBF, Германия (Grant 031A581, подпроект A-D)) и Немецким исследовательским фондом (Deutsche Forschungsgesellschaft, DFG, Исследовательская учебная группа GRK 2338).
Cells | |||
A549 | ATCC | CCL-185 | |
Cell culture medium and supplies | |||
DMEM | Biochrom, Berlin, Germany | FG 0415 | used as growth medium |
DMEM | Gibco-Invitrogen, Darmstadt, Germany | 22320 | used as exposure medium |
FBS superior | Biochrom, Berlin, Germany | S 0615 | |
Gentamycin (10mg/mL) | Biochrom, Berlin, Germany | A 2710 | |
HEPES 1M | Th. Geyer, Renningen, Germany | L 0180 | |
PBS | Biochrom, Berlin, Germany | L 1825 | |
Trypsin/EDTA (0.05%/0.02%) | Biochrom, Berlin, Germany | L 2143 | |
Cell culture material | |||
CASY Cups | Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany | REF 05651794 | |
Cell culture plates | Corning, Wiesbaden, Germany | 3516 | 6-well plates |
Corning Transwell cell culture inserts | Corning, Wiesbaden, Germany | 3450 | 24mm inserts; 6-well plates; 0.4 µm |
Chemicals | |||
CASYton | Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany | REF 05651808001 | |
Compressed Air (DIN EN 12021) | Linde Gas Therapeutics GmbH, Oberschleißheim, Germany | 2290152 | |
WST-1 | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab155902 | |
Instruments + equipment | |||
CASY Cell Counter | Schärfe System GmbH, Reutlingen, Germany | ||
Circulation thermostat | LAUDA, Lauda-Königshofen, Germany | Ecoline RE 100 | |
CULTEX HyP – Hydraulic Press | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
CULTEX insert sleeve | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
CULTEX RFS – Radial Flow System Type 2 (module for particle exposure) | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
CULTEX RFS – Radial Flow System Type 2 (module for clean air exposure) | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
CULTEX supply | |||
Flow controller 0-30 ml/min (IQ-Flow) | Bronkhorst Deutschland Nord GmbH | ||
Flow controller 0-1,5 l/min (EL-Flow) | Bronkhorst Deutschland Nord GmbH | ||
Filters (large) | Munktell & Filtrak GmbH, Sachsen, Germany | LP-050 | Munktell Sterile Filter; Particle retention efficiency > 99,999% |
Filters (small) | Parker Hannifin Corporation, Mainz, Germany | 9933-05-DQ | Balston disposable filter |
Medium pump | Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Germany | Ismatec IPC High Precision Multichannel Dispenser | digital peristaltic pump |
Microplate Reader Infinite M200 Pro | Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim, Germany | ||
Vakuum pump | KNF, Freiburg, Germany | N86 KT.18 | |
Vögtlin mass flow controller 0,2-10 l/min | TrigasFI GmbH | Vögtlin red-y compact regulator, Typ-Nr.: GCR-C3SA-BA20 | |
Water Bath | LAUDA, Lauda-Königshofen, Germany | Ecoline Staredition RE 104 |