Summary
Dit protocol staat een tijd opgeloste beschrijving van bacteriële groei onder stressomstandigheden op de eencellige en de celpopulatie niveaus.
Abstract
Analyse van het bacteriële vermogen om te groeien en te overleven onder stressomstandigheden is essentieel voor een breed scala van microbiologie studies. Het is relevant voor het karakteriseren van de respons van bacteriële cellen op stress-inducerende behandelingen zoals blootstelling aan antibiotica of andere antimicrobiële verbindingen, bestraling, niet-fysiologische pH, temperatuur, of zoutconcentratie. Verschillende stress behandelingen kunnen verschillende cellulaire processen verstoren, waaronder celdeling, DNA-replicatie, eiwitsynthese, membraan integriteit of regulering van de celcyclus. Deze effecten zijn meestal geassocieerd met specifieke fenotypes op de cellulaire schaal. Daarom, het begrijpen van de omvang en causaliteit van stress-geïnduceerde groei of levensvatbaarheid tekortkomingen vereist een zorgvuldige analyse van verschillende parameters, zowel op de single-cel en op het niveau van de bevolking. De experimentele strategie die hier wordt gepresenteerd combineert traditionele optische dichtheids bewaking en beplating assays met eencellige analysetechnieken zoals Flowcytometrie en real-time microscopische beeldvorming in levende cellen. Dit Multiscale-Framework maakt een Tijdopgeloste beschrijving mogelijk van de impact van stress condities op het lot van een bacteriële populatie.
Introduction
Het algemene doel van dit protocol is om het gedrag van bacteriële cellen blootgesteld aan stress behandelingen bij de bevolking en op de eencellige niveaus te analyseren. Bacteriële groei en levensvatbaarheid worden traditioneel aangepakt op het niveau van de bevolking met behulp van optische dichtheid monitoring (OD600nm), dat is een proxy van bacteriële celmassa synthese, of door plating assays om te bepalen van de concentratie van levensvatbare cellen in de cultuur (kolonie vormende eenheid per milliliter, kve/ml). Onder normale (onbelaste) groeiomstandigheden zijn OD600nm en CFU/ml metingen strikt gecorreleerd omdat bacteriële verdubbelingstijd rechtstreeks afhangt van de toename van de celmassa1,2. Echter, deze correlatie wordt vaak verstoord onder omstandigheden die van invloed zijn op cel massa synthese3, cel divisie4, of die trigger cel lysis. Een eenvoudig voorbeeld wordt geleverd door stress behandelingen die celdeling remmen, wat resulteert in de vorming van filamenteeuze bacteriële cellen5,6. Filamenteuze cellen verlengen normaal, omdat celmassa synthese niet wordt beïnvloed, maar ze zijn niet in staat om te verdelen in levensvatbare cellen. De optische dichtheid van de cultuur zal dus in de loop van de tijd toenemen in een normaal tempo, maar niet de concentratie van levensvatbare cellen bepaald door beplating assays (kve/mL). In dit geval, zoals in vele andere, optische dichtheid en plating metingen zijn informatief, maar niet te bieden een uitgebreid begrip van de waargenomen stress-geïnduceerde effect. Deze ensemble-assays moeten worden gecombineerd met eencellige analysetechnieken om een diepgaande karakterisering van stress-geïnduceerde groei tekortkomingen mogelijk te maken.
Hier wordt een procedure beschreven die vier complementaire experimentele benaderingen combineert: (1) traditionele beplating assays en elementaire optische dichtheids bewaking om de levensvatbaarheid van de cel en de celmassa synthese te bewaken, respectievelijk; (2) Flowcytometrie om de celgrootte en de DNA-inhouds parameters op een groot aantal cellen te evalueren; (3) microscopie snapshot Imaging om celmorfologie te analyseren; en (4) time-lapse eencellige beeldvorming in microfluïdische kamers voor onderzoek van de temporele dynamiek van het lot van de cel. Dit Multi-Scale kader maakt het interpreteren van de wereldwijde effecten op celgroei en levensvatbaarheid in het licht van het gedrag van individuele cellen. Deze procedure kan worden toegepast om de respons van diverse bacteriesoorten op vrijwel elke stress van belang te ontcijferen, inclusief groei onder bijzondere omstandigheden (d.w.z. groeimedium, pH, temperatuur, zoutconcentratie) of blootstelling aan antibiotica of andere antimicrobiële verbindingen.
Protocol
1. celcultuur, stress-inductie en bemonsteringsprocedure
Opmerking: gebruik steriel cultuur glaswerk, pipetpunten en groeimedium gefilterd op 0,22 μm om achtergrond deeltjes te vermijden. Hier worden celculturen geteeld in laag autofluorescentie-rijk gedefinieerd medium (Zie tabel met materialen)7,8.
- Streep de bacteriestam van belang uit een bevroren glycerol kolf op een Luria-Bouillon (LB) agarose plaat (met selectief antibioticum indien nodig) en inincuberen bij 37 °C 's nachts (17 uur).
Opmerking: het voorbeeld experiment hier gepresenteerd gebruikt Escherichia coli MG1655 Hupa-mcherry. Deze stam produceert de fluorescently gelabelde subeenheid α van de HU nucleoid geassocieerde eiwitten, waardoor lichte microscopie Visualisatie van het chromosoom in levende cellen9. - Inoculeren 5 mL medium met een enkele kolonie en groeien bij 37 ° c met schudden bij 140 rotatie per minuut (rpm) 's nachts (17 uur). Voor een bevredigende beluchting van de geagiteerde cultuur moeten kolven (≥ 50 mL) of grote diameter (≥ 2 cm) reageerbuisjes worden gebruikt.
- De volgende ochtend meet de extinctie bij 600 nm (OD600nm) en Verdun de kweek in een reageerbuisje met vers medium tot een od600nm van 0,01. Het totale volume van de cultuur moet worden aangepast, afhankelijk van het aantal tijdpunten dat tijdens het experiment moet worden geanalyseerd.
- Laad een monster van 200 μL van de kweek in een microplaat (0,2 mL per goed werkend volume met een doorzichtige bodem) en plaats deze in een automatische plaat lezer (Zie tabel met materialen) voor od600nm monitoring tijdens incubatie bij 37 °c.
- Incuberen de inocculeerde reageerbuis bij 37 °C met schudden (140 rpm) tot OD600nm = 0,2, overeenkomend met een volledige exponentiële fase in een rijk medium.
Opmerking: het is van cruciaal belang om de cellen voor ten minste 4 − 5 generaties te laten groeien alvorens een juiste exponentiële groei te bereiken. Het initiële entmateriaal dat in stap 1,3 (OD600nm = 0,01) wordt gebruikt, moet worden aangepast in het geval van groei in armere media (d.w.z. waar de exponentiële fase onder de OD 0,2 wordt bereikt), of als er meer generaties worden gezocht (bijvoorbeeld voor specifieke fysiologische studies of voor uitgebreide stress behandelingen). - Bij OD600nm = 0,2, neem de volgende cultuur monsters die overeenkomen met het t0 tijdpunt (exponentieel groeiende cellen vóór spannings inductie): (1) een monster van 150 μL dat onmiddellijk in het microfluïdische apparaat moet worden geladen voor time-lapse microscopie-beeldvorming (zie rubriek 2); (2) een monster van 200 μL voor de verdunnings-en beplating test (zie rubriek 3); 3) een monster van 250 μL dat op ijs moet worden gezet voor de analyse van de stromings cytometrie (rubriek 4); (4) een monster van 10 μL dat onmiddellijk moet worden afgezet op een agarose-gemonteerde glijbaan voor microscopie momentopname beeldvorming (zie rubriek 5).
- Stel de celkweek in de reageerbuis bloot aan de specifieke stress behandeling die u wilt onderzoeken en incuberen bij 37 °C met schudden (140 rpm).
Opmerking: de cultuur die groeit in de geautomatiseerde plaat lezer voor OD600nm monitoring moet ook worden onderworpen aan de stress behandeling. - Neem op relevante tijdstippen na de stress behandeling (t1, t2, t3, enz.) de volgende celmonsters uit de beklemtoonde cultuur: (1) een monster van 200 μL voor de verdunnings-en plating test (zie rubriek 2); (2) een monster van 250 μL voor het op ijs zetten van de analyse van de stromings cytometrie (punt 3); (4) een monster van 10 μL dat onmiddellijk moet worden afgezet op een agarose-gemonteerde glijbaan voor microscopie momentopname beeldvorming (zie rubriek 4).
Opmerking: elke stress-inducerende behandeling heeft een efficiëntie die afhankelijk is van de dosis en de tijd. Daarom kan het nodig zijn om voorbereidende tests uit te voeren om de dosis en duur van de behandeling te bepalen die moet worden gebruikt voor optimale resultaten. Dit kan worden gedaan door het uitvoeren van OD-bewaking met behulp van een geautomatiseerde plaat lezer (mogelijk geassocieerd met plating assays) van een celcultuur behandeld met een reeks doses en blootstellings tijden. In het experiment hier gepresenteerd, de celcultuur werd behandeld met de celdeling-remmende antibioticum Cephalexin (CEPH.) bij 5 μg/mL eindconcentratie voor 60 min. Cephalexin werd vervolgens weggespoeld door de cellen in een buis van 15 mL te omhulten met behulp van centrifugeren (475 g, 5 min), het supernatant te verwijderen, de celpellet in een gelijk volume vers medium te suspengeren door voorzichtig te pipetteren en over te brengen in een schone buis. De gewassen cellen werden geïnfiltreerd bij 37 °C met schudden (140 rpm) om herstel mogelijk te maken. Het monster werd genomen op t60 (60 min na Cephalexin aanvulling op het ' Cephalexin-60min-behandelde ' monster), t120 (60 min na het wassen), en t180 (120 min na het wassen).
2. uitplatings test
Opmerking: de beplating test zorgt voor het meten van de concentratie van cellen die in staat zijn om een CFU in de cultuur monsters te genereren. Deze procedure onthult de snelheid waarmee één cel in twee levensvatbare cellen verdeelt en maakt het mogelijk om arrestaties van celdeling te detecteren (bijv. verhoging van de bacterie generatie tijd van cellyse).
- Bereid 10-voudige seriële verdunningen tot 10-7 van de 200 μL kweek monster in vers medium. Plaat 100 μL van de juiste verdunning op niet-selectieve LB agarose platen om tussen de 3 − 300 kolonies te verkrijgen na een nachtelijke incubatie bij 37 °C.
Opmerking: seriële verdunning in vers medium moet snel worden uitgevoerd om bacteriële divisies te beperken. Als alternatief kunnen onderzoekers overwegen om een zoutoplossing te gebruiken zonder een koolstofbron om celsplitsingen tijdens het verdunnings proces te voorkomen. - De volgende dag, tellen het aantal kolonies om te bepalen van de concentratie van levensvatbare cellen (kve/mL) in elk cultuur monster. Plot de kve/mL als een functie van de tijd voor onbehandelde en behandelde celculturen.
3. stroom cytometrie
Opmerking: de volgende sectie beschrijft de voorbereiding van celvoorbeelden voor Flowcytometrie-analyse. Deze analysetechniek onthult de verdeling van Celgrootte en DNA-inhoud voor een groot aantal cellen. Indien mogelijk, is het raadzaam om de flow cytometrie monsters onmiddellijk te verwerken. Als alternatief kunnen monsters op ijs worden gehouden (voor maximaal 6 uur) en tegelijkertijd worden geanalyseerd aan het eind van de dag, zodra plating en microscopie beeldvorming zijn uitgevoerd.
- Verdun het kweek monster van 250 μL tot 250 μL bij een concentratie van ~ 15.000 cellen/μL (overeenkomend met een OD600nm ~ 0,06) in vers medium bij 4 °c.
Opmerking: incubatie op ijs zal de groei en morfologische modificatie van de cellen beperken. Als alternatief kan de gebruiker overwegen het uitvoeren van fixatie van de cellen in 75% ethanol, zoals meestal aanbevolen voor flow flowcytometrieonderzoeken10. - Meng voor DNA-kleuring het bacteriële monster met een 10 μg/mL-oplossing van DNA-fluorescerende kleurstof (verhouding 1:1) en inbroed 15 minuten in het donker voordat het monster wordt geanalyseerd.
- Steek het monster in de flow cytometer met een ~ 120.000 cellen/min stroomsnelheid. Verkrijg voorwaarts-verstrooid (FSC) en side-verstrooid (SSC) licht, evenals DNA fluorescerende kleurstof fluorescentie signaal (FL-1) met de juiste instellingen.
- Plot de FSC-en FL-1-celdichtheid histogrammen om de verdeling van de celgrootte en het DNA-gehalte in de celpopulatie weer te geven.
4. snapshot microscopie beeldvorming
Opmerking: het volgende deel beschrijft de voorbereiding van microscopie dia's en beeld verwerving voor populatie momentopname analyse. Deze procedure zal informatie geven over de morfologie van de cellen (cellengte, breedte, vorm) en de intracellulaire organisatie van het nucleïd DNA.
- Verwarm de gethermoverklaarde Microscoop kamer bij 37 °C om de temperatuur te stabiliseren voordat de waarnemingen beginnen. Deze kamer zorgt voor temperatuur modulatie van de Microscoop optiek en sample stage tijdens time-lapse experimenten.
- Bereid de agarose-gemonteerde dia's voor zoals beschreven in Lesterlin en Dubarry7.
- Verwijder de plastic folie van de onderkant van het blauwe frame (Zie tabel met materialen) en laat de uitgeholde plastic film aan de andere kant staan. Plak het blauwe frame op een Microscoop glazen glijbaan.
- Pipetteer ~ 150 μL gesmolten 1% agarose middelzware oplossing en giet binnen het blauwe frame compartiment. Bedek snel met een schone dekslip om de overtollige vloeistof te verwijderen en wacht een paar minuten voor het agarose-pad om bij kamertemperatuur te stollen.
- Wanneer het celmonster klaar is, verwijdert u de Afdeklijst en de plastic folie uit het blauwe frame. Giet 10 μL celmonster op het agarose-pad en kantel de glazen schuif zachtjes om de druppel te verspreiden. Wanneer alle vloeistof is geadsorbeer, plak dan een schone dekslip op het blauwe frame om het monster te verzegelen. De microscopie dia is nu klaar voor microscopie.
- Plaats de dia op de Microscoop en voer beeld verwerving uit met behulp van uitgezonden licht (met een fase contrast doelstelling) en met lichtbron excitatie bij de juiste golflengten (560 Nm voor mCherry).
- Selecteer de weergavevelden die geïsoleerde cellen bevatten om automatische celdetectie tijdens beeldanalyse te vergemakkelijken. Zorg ervoor dat ten minste 300 cellen worden afgebeeld om een robuuste statistische analyse van de celpopulatie mogelijk te maken.
5. microfluidics time-lapse microscopie beeldvorming
Opmerking: het volgende deel verklaart de voorbereiding van de microfluïdische platen (Zie tabel met materialen), celbelasting, microfluïdica-programma en time-lapse-beeld verwerving. Deze beeldvormings procedure onthult het gedrag van afzonderlijke cellen in real-time.
- Verwijder de conserverings oplossing van de microfluïdische plaat en vervang deze door vers medium voorverwarmd tot 37 °c, zoals beschreven in de microfluïdische software gebruikershandleiding.
- Sluit de microfluïdische plaat aan op het verdeelsysteem en klik op de priming -knop.
- Plaats de microfluïdische plaat met het verdeelsysteem op de Microscoop en verwarm bij 37 °C gedurende ~ 2 uur voordat de microscopie-overname wordt gestart.
Opmerking: deze voorverwarmings stap is van cruciaal belang om de verwijding van de microfluïdische kamer te voorkomen, wat de scherpstelling van de Microscoop tijdens het time-lapse-experiment en de overname van het beeld in gevaar zou brengen. - Sluit de microfluïdische plaat af. Vervang het medium van goed 8 met 150 μL cultuur monster en vervang het medium van put 1 tot 5 door het gewenste medium met of zonder het stress-inducerende reagens.
- Verzegel de microfluïdische plaat en plaats deze op de Microscoop.
- Op de microfluïdische software (Zie tabel van de materialen) Voer de cel laden procedure. Controleer of het laden van de cellen bevredigend is door onder de Microscoop in uitgezonden licht te kijken. Voer de cel laden procedure een tweede keer uit als de celdichtheid in de kamer onvoldoende is.
- Voer de focus zorgvuldig uit in de uitgezonden licht modus en selecteer verschillende kijk velden die geïsoleerde bacteriën laten zien. Het is belangrijk om velden te selecteren die niet overbevolkt zijn om de groei van geïsoleerde cellen in de loop van de tijd te kunnen monitoren (~ 10 − 20 cellen per 100 μm2 wordt aanbevolen). Dit zal ook de celdetectie vergemakkelijken tijdens beeldanalyse.
- Op de microfluïdische software, klik op de maak een protocol knop. Program meer de injectie van groeimedium voor 1 − 2 generatie tijd equivalenten zodat de cellen zich kunnen aanpassen (optioneel). Programmeer dan de injectie van het stress-inducerende medium gedurende 10 minuten bij 2 psi, gevolgd door een injectie van 1 psi voor de gewenste duur van de stress behandeling. Als u van plan bent om het herstel van de cellen na stress te analyseren, programmeer de injectie van verse groeimedium voor de gewenste duur.
Opmerking: in het experiment hier gepresenteerd, Cephalexin werd geïnjecteerd voor 10 min bij 2 psi, gevolgd door 50 min bij 1 psi. Vervolgens werd het verse groeimedium gedurende 10 minuten bij 2 psi geïnjecteerd, gevolgd door 3 uur bij 1 psi. - Voer microscopie beeldvorming uit in de timelapse-modus met 1 frame elke 10 min met behulp van fase contrast in verzonden licht en een 560 Nm excitatie lichtbron voor het mcherry-signaal indien nodig.
Opmerking: het is belangrijk om microscopische beeld verwerving te starten op hetzelfde moment als het begin van het microfluïdische injectie protocol.
6. beeldanalyse
Opmerking: in deze sectie worden kort de belangrijkste stappen beschreven voor het verwerken en analyseren van snapshots en time-lapse microscopie beelden. Het openen en visualiseren van microscopie beelden gebeurt met de open source ImageJ/Fiji (https://fiji.sc/)11. Kwantitatieve beeldanalyse wordt uitgevoerd met behulp van de open source ImageJ/Fiji-software samen met de gratis MicrobeJ plugin12 (https://microbej.com). Dit protocol maakt gebruik van de MicrobeJ 5.13 I-versie.
- Open de Fiji-software en de MicrobeJ-plugin.
- Voor Snapshot analyse, laat u alle afbeeldingen die overeenkomen met een Microscoop-dia (één voorbeeld) in de MicrobeJ-laadbalk om afbeeldingen samen te voegen en het verkregen afbeeldings stacks-bestand op te slaan. Voor timelapse-gegevens laat u de afbeeldingsstapel gewoon in de laadbalk van MicrobeJ vallen.
- Voer de geautomatiseerde detectie van de contouren van de cellen uit op basis van de segmentering van het fase contrast beeld en, indien relevant, van de nucleoïden op basis van de segmentatie van het gekleurd DNA fluorescentie signaal. Controleer de nauwkeurigheid van de celdetectie visueel en gebruik de MicrobeJ bewerkingstool voor correctie indien nodig. Sla het verkregen resultaat bestand op.
Opmerking: de instellingen die worden gebruikt voor de detectie van E. coli -cellen worden aangegeven in de tabel met materialen (Zie de kolom opmerkingen/beschrijving van microbej). Voor andere bacteriesoorten (vooral voor niet-staafvormige bacteriën), moet de gebruiker de instellingen voor detectie verfijnen (Zie MicrobeJ-zelfstudie). Voor timelapse-afbeeldingen kan de voorkeur worden gegeven aan het uitvoeren van een semi-automatische detectie van de cellen met behulp van de MicrobeJ-bewerkingstool om te focussen op het lot van afzonderlijke cellen (Zie MicrobeJ-zelfstudie). - Klik op het pictogram resultj om de analyse te voltooien en het venster resultj te verkrijgen. Vanaf dat punt kunnen veel verschillende typen uitvoer grafieken worden gegenereerd. Plot de genormaliseerde histogrammen van de celvorm/lengte en het gemiddelde nucleoïde getal per cel.
Representative Results
De beschreven procedure werd gebruikt om het gedrag van Escherichia coli K12 cellen te analyseren tijdens voorbijgaande blootstelling aan Cephalexin, een antibioticum dat specifiek de celdeling remt (Figuur 1A)13. De hupa-mcherry E. coli stam die het fluorescently gelabelde hu-eiwit in verband met het chromosomale DNA produceert, werd gebruikt om de dynamiek van het chromosoom tijdens deze behandeling te onderzoeken8,9. De exponentieel groeiende Hupa-mCherry E. coli cellen werden geanalyseerd vóór (t0) en 60 min na incubatie met cephalexin (t60). Vervolgens werd het antibioticum weggespoeld en werd het herstel van de celpopulatie na 1 uur (t120) en 2 uur (t180) geanalyseerd (Figuur 1B).
Figuur 1: procedure voor de analyse van de bacteriële respons op stress behandelingen. A) Schematische voorstelling van de methode. (B) cartoon ter illustratie van de celmorfologie tijdens normale groei in rijk medium en tijdens voorbijgaande blootstelling aan Cephalexin (CEPH.), van toevoeging aan (t0) en na het wassen van cephalexin van (t60) tot (t180). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
De parallelle evolutie van OD en CFU/mL is een eerste indicator die helpt om het effect van de stress behandelingen te begrijpen. Deze twee parameters zijn strikt gecorreleerd tijdens onperturbedgroei, maar zijn vaak losgekoppeld en evolueren onafhankelijk onder stress. Celculturen groeien in de aanwezigheid van Cephalexin tentoongesteld vergelijkbare OD600nm toeneemt als de onbelaste culturen (Figuur 2A), waaruit blijkt dat het geneesmiddel niet van invloed op de celmassa synthese. Echter, de concentratie van levensvatbare cellen niet toenemen wanneer Cephalexin aanwezig was als gevolg van strikte remming van celdeling (Figuur 2B). Cellen begonnen opnieuw te delen wanneer Cephalexin werd verwijderd en bereikten uiteindelijk een concentratie gelijk aan de onbeklemtoonde cultuur op (t180). Deze resultaten weerspiegelen het bacteriostatische effect van Cephalexin, wat een volledig reversibele remming van de celdeling induceert. Verschillende spanningen zullen resulteren in verschillende afkoppeling van de OD-en CFU/mL-curven, afhankelijk van het geïnduceerde effect (bijv. wijziging van de celmorfologie zoals filamentatie of uitpuilende, celdood met of zonder lysis). Een niet-limitatieve lijst van mogelijke uitkomst resultaten indicatief voor verschillende stress-geïnduceerde effecten wordt weergegeven in Figuur 2C.
Figuur 2: bacteriële groei monitoring van onbehandelde en cephalexinbehandelde cellen op het bevolkingsniveau. A) optische dichtheids bewaking (OD600nm/ml). B) concentratie van levensvatbare cellen (kve/ml) binnen onbehandelde en Cephalexin-60min-behandelde culturen. Foutbalken geven de standaarddeviatie voor een experimenteel triplicaat aan. C) Schematische voorstelling van mogelijke resultaten en bijbehorende stress-effecten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Analyse van één cel is essentieel voor het nauwkeurig interpreteren van de stressrespons waargenomen op het bevolkingsniveau. Flow cytometrie maakt het mogelijk om de celgrootte en het DNA-gehalte van enkele duizenden cellen14,15 (Figuur 3) te onderzoeken. Blootstelling aan Cephalexin veroorzaakte de parallelle toename van de celgrootte en het DNA-gehalte (t60). Wanneer Cephalexin werd verwijderd, daalde de populatie Celgrootte en het DNA-gehalte geleidelijk om te worden vergelijkbaar met de onbeklemtoonde populatie bij t180. Deze resultaten tonen aan dat Cephalexin geen DNA-replicatie remt en de vorming van filamenteiselcel veroorzakte die verschillende chromosoom equivalenten bevatte. Deze filamenten verdeeld in cellen met normale Celgrootte en DNA-inhoud wanneer de drug werd weggewassen. Flowcytometrie resultaten zouden zeer verschillend zijn voor spanningen die de DNA-synthese remmen, wat leidde tot de vorming van filamenteuze cellen die slechts één niet-replicerende chromosoom bevatten. In dat geval zou de Celgrootte op dezelfde manier toenemen, maar zou het niet geassocieerd zijn met een toename van het DNA-gehalte.
Figuur 3: representatieve Flowcytometrie analyse van onbehandeld en Cephalexin-60min-behandelde cellen. A) de verdeling van de celgrootte HISTOGRAMMEN (FSC-H). B) histogrammen van DNA-inhoud (FL1-SYTO9). n = 120.000 geanalyseerde cellen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Snapshot microscopie Imaging werd gebruikt om de celmorfologie en de intracellulaire organisatie van het DNA te onderzoeken, zoals weergegeven door de lokalisatie van HU-mCherry (Figuur 4A). Cephalexin uitgelokt de vorming van lange cellen met normale celbreedte en geen divisie septa. Deze gladde filamenten bevatten regelmatig verdeelde DNA-structuren, nucleoïden genoemd, die bevestigen dat Cephalexin geen invloed had op chromosoom replicatie en segregatie. Kwantitatieve beeldanalyse bevestigde grotendeels de celgrootte en de DNA-inhoud die eerder werden waargenomen met Flowcytometrie (Figuur 4B, C). De resultaten zouden zeer verschillend zijn voor de spanningen die DNA-schade veroorzaken, die leiden tot de vorming van filamenteuze cellen waarin de replicatie voortduurt, maar de segregatie is aangetast. In dat geval zouden de celgrootte en het DNA-gehalte op dezelfde manier toenemen, maar cellen zouden één ongestructureerde massa van DNA in de haven. Snapshot-afbeeldingen kunnen ook andere soorten afwijkende celvormen of de aanwezigheid van mini-, anucleate-of gelyseerd-cellen (spook cellen) onthullen.
Figuur 4: microscopie snapshot analyse van onbehandeld en Cephalexin-60min-behandelde cellen. A) representatieve microscopie afbeeldingen met fase contrast (grijs) en hu-mcherry-signaal (rood). B) verdeling van de cellengte histogrammen. Schaalbalk = 5 μm. C) histogrammen van het aantalnucleïdper cel. Tussen 800 en 2.000 cellen werden geanalyseerd voor elk monster. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Time-lapse microscopie geassocieerd met de microfluïdische apparatuur16 hielp bij het bepalen van de fenotypes eerder waargenomen en biedt aanvullende inzichten met betrekking tot de ontwikkeling en causaliteit van de groei-deficiëntie. Timelapse-beelden (Figuur 5A en film 1) bevestigden dat de celverlenging (celmassa synthese) en chromosoom replicatie en segregatie niet werden geremd door blootstelling aan Cephalexin. Bovendien, het bleek het proces van herstel wanneer Cephalexin werd verwijderd. Analyse van de filamenteuze cellineage toonde aan dat de celdeling opnieuw start ~ 20 min na het wassen van het medicijn (Figuur 5B). De resulterende verdeelde cellen waren levensvatbaar, omdat ze op hun beurt verdeeld, uiteindelijk leiden tot de vorming van 33 cellen vertonen normale grootte en DNA-inhoud. Dit liet de berekening van een totale generatie tijd van ~ 31 min over de 180 min van het experiment, die vergelijkbaar is met de generatie tijd berekend voor de onbeklemtoonde populatie van CFU/mL metingen (~ 33 min).
Figuur 5: microscopie time-lapse analyse van Cephalexin-60min-behandelde cellen. A) representatieve microscopie afbeeldingen met fase contrast (grijs) en hu-mcherry-signaal (rood). De bewaakte filamenteuze cel wordt aangegeven door de witte omtrek en verdeelde cellen door verschillende kleuren. Schaalbalk = 5 μm.B) Schematische weergave van de filamenteuze celafstamming overeenkomend met panel (A) en film 1. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Film 1: Microfluïdische film van E. coli hu-mcherry behandeld met Cephalexin. Cephalexin werd geïnjecteerd na 60 min, gevolgd door injectie van verse RDM medium voor 3 h. tijd aangegeven in geel (1 frame elke 10 min). Schaalbalk = 5 μm. Klik hier om deze video te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
Discussion
Het is essentieel om aandacht te besteden aan de groei toestand van de cellen tijdens de procedure. Kweek de cellen over meerdere generaties voordat u een volledige exponentiële fase bereikt. Voor het succes van deze methode, is het belangrijk dat alle cellen monsters tegelijkertijd worden verzameld, en het is het beste om slechts één behandelde en één onbehandelde cultuur op hetzelfde moment te analyseren. Celmonsters voor microscopie beeldvorming moeten gedurende de gehele procedure op de experimentele temperatuur worden gehandhaafd. Het is dan essentieel om vóór het begin van het experiment de Microscoop kamer en de microfluïdische kamer voor te verwarmen. Als celmonsters voor flow cytometrie niet gemakkelijk kunnen worden geanalyseerd, kunnen ze op ijs worden gehouden voor maximaal 6 uur. incubatie op ijs zal de groei en morfologische modificatie van de cellen beperken. Als alternatief kan de gebruiker overwegen fixatie van de cellen in ethanol 75% te gebruiken, wat meestal wordt aanbevolen voor flow flowcytometrieonderzoeken10. Als het protocol de stress-inductor van het medium moet wassen, centrifugeer en Pipetteer de cellen zeer zorgvuldig om beschadiging van de potentiële afwijkende cellen te voorkomen.
Beide Flowcytometrie en snapshot-analyse geven toegang tot de celgrootte en de parameters van DNA-inhoud, met snapshots die extra observatie van de celmorfologie bieden. DNA-kleuring met DAPI10 (4 ', 6-diamidino-2-fenylindole) of andere stabiele DNA-kleurstoffen kan worden uitgevoerd als er geen fluorescerende fusie beschikbaar is om de nucleoïden in het organisme van belang te observeren. Als een Flowcytometrie-analyse niet kan worden uitgevoerd, is het belangrijk om een groot aantal cellen te analyseren met microscopie.
Microscopie beeldvorming kan ook worden uitgevoerd met behulp van stammen die fluorescerende fusies uitvoeren naar eiwitten die betrokken zijn bij specifieke trajecten van belang. Dit zou helpen onthullen het effect van stress op een verscheidenheid van cellulaire processen zoals replicatie, transcriptie, celwandsynthese, of celdeling. De methode kan worden toegepast op een reeks bacteriesoorten, waarbij de enige eis is dat de microfluïdische apparatuur verenigbaar moet zijn met de morfologie van de cellen. Standaard microfluïdische platen zijn handig voor staafvormige bacteriën met een celbreedte tussen 0,7 μm en 4,5 μm. Echter, Cocci, ovococci, of andere bacteriële stammen met eigenaardige vormen moeten worden getest. Als de microfluïdische experimenten niet kunnen worden uitgevoerd als gevolg van het niet beschikbaar zijn van de apparatuur of onverenigbare bacteriestammen, kan timelapse-beeldvorming worden uitgevoerd op op agarose gemonteerde dia's voor een maximale duur van 2h.
Het algemene voordeel van deze Multi-Scale analyse is het bieden van een globale visie van het effect van stress inductie op verschillende aspecten van bacteriële groeivermogen (d.w.z. massa synthese, levensvatbaarheid van cellen, celmorfologie, membraan integriteit, DNA-inhoud) en de manier waarop deze evolueren met de tijd in een bacterie populatie die onder stressomstandigheden groeit. Het maakt het ook mogelijk om het herstel van de normale groei op het niveau van de eencellige en de populatie te analyseren. De aanpak is van toepassing op een breed scala aan bacteriesoorten en op vrijwel elke vorm van stress behandeling, zoals blootstelling aan antibiotica of andere antimicrobiële verbindingen, analyse van de invloed van interactie met andere organismen in diepte populaties, of het effect van genetische mutatie.
Disclosures
De auteurs verklaarden geen concurrerende belangen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken F. Cornet voor het leveren van de Hupa-mCherry stam, a. DeDieu voor technische bijstand met cytometrie, en a. Ducret voor hulp bij MicrobeJ. Financiering: C. Lesterlin erkent INSERM-en CNRS-instellingen, evenals het ATIP-Avenir-programma, de Schlumberger-Stichting voor onderwijs en onderzoek (FSER 2019), de ANR-financiering voor het Plasmaed onderzoeksprogramma (ANR-18-CE35-0008) en FINOVI voor financiering aan J. Cayron; La Ligue contre le Cancer voor de financiering van de flow cytometer-apparatuur. Bijdragen van de auteur: C.L. en J.C. ontwierp de procedure en schreef het papier; J.C. voerde de experimenten uit en analyseerde de gegevens.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | BioRad | 1613100 | Certified molecular biology agarose |
| Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer | ThermoFisher scientific | A24858 | Cytometer |
| CellASIC ONIX Microfluidic System | Merck Millipore | CAX2-S0000 | Microfluidic system |
| CellASIC ONIX2 FG | Merck Millipore | ONIX2 1.0.1 | Microfluidic software |
| CellASIC ONIX2 Manifold Basic | Merck Millipore | CAX2-MBC20 | Manifold system |
| CytoOne 96-well plate with lid | Starlab | CC7672-7596 | Microplate with 0,2 mL well working volume and clear flat bottom, for automated plate reader |
| E. coli strain carrying a chromosomal insertion for a hupA-mCherry fusion | Created by P1 transduction of hupA-mCherry in E. coli MG1655 | ||
| Fiji | ImageJ | https://fiji.sc/ | Image software. Cite Schindelin et al. if used in publication |
| Gene Frame | Thermo Scientific | AB-0578 | Blue frame (125 μL, 1,7 x 2,8 cm) |
| Luria-Broth agarose medium | MP Biomedicals | 3002232 | Growth medium for plating assay |
| MicrobeJ | Imagej/Fiji plugin | https://www.microbej.com/ | Microscopy image analysis plugin. Cite Ducret et al. If used in publication; Detection settings: For bacteria : Area (μm2): 0,1-max; Length (μm): 0,5-max; Width (μm): 0,6-max; Range (μm): 0,5-max; Angularity (rad): 0-0,3; 0-max for all other parameters. For nucleoid: Tolerance: 500; Threshold: Local; 0-max for all other parameters |
| Microfluidic Plates CellASIC ONIX | Merck Millipore | B04A-03-5PK | Plate for Microfluidic system |
| Microscope Nikon eclipse Ti | Nikon | Fluorescence microscope | |
| MOPS EZ Rich Defined Medium (RDM) | Teknova | M2105 | Growth rich medium, 10x MOPS Mixture, 0,132 M K2HPO4, 10x AGCU, 5x Supplement EZ, 20% Glucose. Filtered at 0,22 μm |
| SYTO9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain | ThermoFisher scientific | S34854 | DNA fluorescent dye |
| TECAN Infinite M1000 | TECAN | 30034301 | Automated plate reader |
References
- Donachie, W. D., Begg, K. J., Vicente, M. Cell length, cell growth and cell division. Nature. 264 (5584), 328-333 (1976).
- Donachie, W. D., Blakely, G. W. Coupling the initiation of chromosome replication to cell size in Escherichia coli. Current Opinion in Microbiology. 6 (2), 146-150 (2003).
- Patterson, D., Gillespie, D. Effect of Elevated Temperatures on Protein Synthesis in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 112 (3), 1177 (1972).
- Begg, K. J., Donachie, W. D. Cell shape and division in Escherichia coli: experiments with shape and division mutants. Journal of Bacteriology. 163 (2), 615-622 (1985).
- Van De Putte, P., Van Dillewijn, J., Roersch, A. The Selection of Mutants of Escherichia Coli with Impaired Cell Division at Elevated Temperature. Mutation Research. 106, 121-128 (1964).
- Walker, A. R. Initial characterization of temperature-sensitive cell division mutants of Escherichia coli. Biochemical and Biophysical Research Communications. 47 (5), 1074-1079 (1972).
- Lesterlin, C., Duabrry, N. Investigating Bacterial Chromosome Architecture. Chromosome Architecture. 1431, http://link.springer.com/10.1007/978-1-4939-3631-1_6 61-72 (2016).
- Stracy, M., et al. Live-cell superresolution microscopy reveals the organization of RNA polymerase in the bacterial nucleoid. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (32), E4390-E4399 (2015).
- Fisher, J. K., et al. Four-dimensional imaging of E. coli nucleoid organization and dynamics in living cells. Cell. 153 (4), 882-895 (2013).
- Lesterlin, C., Pages, C., Dubarry, N., Dasgupta, S., Cornet, F. Asymmetry of chromosome Replichores renders the DNA translocase activity of FtsK essential for cell division and cell shape maintenance in Escherichia coli. PLoS genetics. 4 (12), e1000288 (2008).
- Schindelin, J., et al. Fiji - an Open Source platform for biological image analysis. Nature Methods. 9 (7), (2019).
- Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis. Nature Microbiology. 1 (7), 16077 (2016).
- Rolinson, G. N. Effect of beta-lactam antibiotics on bacterial cell growth rate. Journal of General Microbiology. 120 (2), 317-323 (1980).
- Boye, E., Løbner-Olesen, A. Flow cytometry: illuminating microbiology. The New Biologist. 2 (2), 119-125 (1990).
- Rieseberg, M., Kasper, C., Reardon, K. F., Scheper, T. Flow cytometry in biotechnology. Applied Microbiology and Biotechnology. 56 (3-4), 350-360 (2001).
- Nolivos, S., et al. Role of AcrAB-TolC multidrug efflux pump in drug-resistance acquisition by plasmid transfer. Science. 364 (6442), 778-782 (2019).
- Chao, Y., Zhang, T. Optimization of fixation methods for observation of bacterial cell morphology and surface ultrastructures by atomic force microscopy. Applied Microbiology and Biotechnology. 92 (2), 381-392 (2011).
