Summary
这里介绍了使用BODIPY 493/503（一种脂滴特异性荧光染料）对果蝇幼虫中的卵虫细胞进行解剖和脂滴染色的详细方法。
Abstract
脂质对动物发育和生理平衡至关重要。脂质代谢紊乱会导致各种发育缺陷和疾病，如肥胖和脂肪肝。通常，脂质储存在脂液滴中，这是细胞中的多功能脂质储存细胞。脂液滴在不同组织和不同条件下的大小和数量各不相同。据报道，脂液滴通过调节其生物发生和降解受到严格控制。在果蝇黑色素组，卵细胞是脂质代谢的重要组织，最近被确定为人类肝脏模拟脂质动员对压力的反应。然而，调节卵细胞中脂滴代谢的机制仍然难以捉摸。为了解决这个问题，最重要的是开发一种可靠而敏感的方法，直接可视化在发育和压力条件下的卵细胞脂滴动态变化。利用亲脂BODIPY 493/503，一种脂液滴特异性荧光染料，这里描述的是一个详细的方案，用于在果蝇幼虫的卵虫细胞中解剖和随后的脂液滴染色，以应对饥饿。这允许通过共聚焦显微镜对不同条件下的脂质滴动力学进行定性分析。此外，这种快速且高度可重复的方法也可用于基因筛选，用于识别涉及卵细胞和其他组织脂滴代谢的新型遗传因子。
Introduction
脂质是细胞生存所必需的。除了它们作为细胞膜系统的组成部分的传统角色外，脂质在单个动物的生命周期中，在能源供应和信号转导中也起着至关重要的作用。因此，脂质代谢必须符合严格的规定，以保持细胞的生理血质。众所周知，脂质代谢调节不良会导致各种疾病，如糖尿病和脂肪肝。尽管脂质代谢在动物健康中非常重要，但脂质代谢调节机制在很大程度上仍不为人所知。
自从托马斯·摩根教授开始将其用于涉及遗传学和其他基本生物学问题的研究中，果蝇已经广泛使用多年。在过去的几十年里，新的证据表明，果蝇是研究许多脂质代谢相关疾病的优秀模型生物体，如肥胖1，3。特别是，果蝇与人类共享高度保守的代谢基因，并拥有类似的相关组织/器官和细胞类型进行脂质代谢。
例如，负责三乙基甘油储存的果蝇脂肪体，其功能类似于人体脂肪组织。最近，一组专门的肝细胞状细胞（即欧细胞），已报告是人体肝脏的功能模拟，已被证明参与脂肪酸和碳氢化合物代谢在果蝇4，5。与哺乳动物肝脏类似，卵虫细胞通过激活幼虫和成年果蝇的脂滴形成来应对饥饿，导致卵虫细胞4、6、7、8的脂滴积累。从解剖学上讲，卵核细胞紧密地附着在侧表皮的基底内表面，每个腹部半部分大约六个细胞簇，这使得从表皮中分离出卵细胞簇变得不可行。因此，在解剖和染色期间，必须将卵细胞附着在表皮上。
脂质以脂滴的形式储存，这是细胞9中具有单层膜的细胞器。脂液滴存在于不同物种10的几乎所有细胞类型中。脂滴动力学，包括其大小和数量，会因环境压力因素而发生变化。这被认为是对压力（如衰老和饥饿7，8）的代谢状态的反映。因此，开发一种可行、可靠的方法，在发育过程中和压力条件下定性确定卵细胞中的脂滴动力学，具有十分重要的意义。特别是，在第三星幼虫中，在饲料条件下，卵虫细胞含有很少或根本没有可检测到的脂滴，但它们确实含有大量大脂滴后营养剥夺4。为了验证这种方法的有效性，建议在饥饿条件下在卵细胞中进行脂滴染色。
目前，几种亲脂染料可用于脂滴染色，如非荧光染料苏丹黑和油红O和荧光染料尼罗河红和BODIPY 493/50311。苏丹黑和油红O通常用于组织胆碱酯和三乙基甘油，可以很容易地通过光显微镜检测。然而，相对较高的背景染色和相对较低的分辨率是其在脂滴动力学定性分析中的应用的两个限制因素。为了克服非荧光染料的局限性，尼罗河红和BODIPY 493/503被用作脂滴染色的理想替代品。据报道，尼罗河红也可以检测出一些未酯化的胆固醇，这使得BODIPY 493/503在细胞脂液滴中具有更具体的染料，在某种程度上是12、13、14。
首先，为了满足对卵细胞中脂滴进行快速和灵敏分析的需要，该协议提出了一种可行且高度可重复的固定基脂滴特异性染色方法，使用BODIPY 493/503作为染色染料。在本报告中，对卵细胞进行了解剖，BODIPY 493/503用于在卵细胞中进行脂滴染色，其中脂液滴通过共聚焦显微镜检测。此过程的简便性和可负担性使其非常适合在流式细胞仪等其他应用中进行修改和进一步使用。
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Protocol
1. 产卵
- 为产卵准备标准的玉米粉食品。
注：有关此处使用的标准玉米粉食品的配方和烹饪程序，请参阅之前发布的详细信息15。 - 在50 mL离心管中加入6 mL蒸馏水，将活性干酵母加入4克活性干酵母，制备新鲜酵母糊。使用铲子混合和制作糊状物。
- 将玉米粉食品填充到瓶子中，用铲子将大约 1 克酵母糊涂在玉米粉食品表面，制作出产蛋瓶。
- 将所需基因型的苍蝇放入产蛋瓶中，并将其放入恒定温度为25°C、湿度为60%的培养箱中。
注：理想的十字架通常包括150只处女苍蝇和至少75只雄性。在产蛋瓶上放置一个防光箱，使苍蝇保持黑暗，将提高繁殖率。 - 在收集卵子之前，让苍蝇产卵1小时，以便去除所有留在雌性卵架中的老鸡蛋。
- 让苍蝇在新的产卵瓶中产卵1小时，然后把大人从瓶子里取出来。
注：控制产卵时间，尽量减少发育范围，以便在精确控制的发育阶段获得幼虫。 - 允许卵子在25°C下发育成孵化器中的第三只星幼虫，其光/暗周期为12小时/12小时。
2. 对幼虫的饥饿治疗
注：如上所述，在第三星幼虫中，在正常喂养条件下，卵细胞中可检测到的脂质液滴很少或根本没有，但在饥饿等应激条件下，在卵细胞中可以诱发大量大脂滴。为了进一步验证这种方法，有必要预处理这些幼虫，以诱导卵细胞中的脂滴生物发生。在这里，选择12小时、24小时和36小时的饥饿时间作为范例。特别是，短暂的饥饿期（例如3小时）足以诱导卵细胞中可检测到的脂液滴。饥饿持续时间可能因特定的实验目标和设置而异。
- 腾出房间进行饥饿和控制治疗。
- 对于饥饿治疗室：将适当大小的滤纸放入 6 厘米培养皿中，将 1 mL 的移液器放在滤纸上。
- 对于控制治疗室：将5 mL的布卢明顿标准玉米粉食品放入培养皿中。
- 使用铲子轻轻挖出含有幼虫的食物的顶层，这些幼虫仍在食物中挖洞，然后转移到装满5 mL PBS的培养皿中。轻轻搅拌PBS中的幼虫，去除幼虫中的食物污染，使其尽可能清洁。
- 使用小型画笔收集40个相同近似大小的星中幼虫。随机地将它们分类到饥饿或控制室，每个有20个幼虫。
- 将腔室置于25°C的培养室中，湿度为60%，允许进行12小时、24小时和36小时的处理。
注：对于饥饿室中的幼虫，每12小时加入1mL的PBS，以避免幼虫脱水。
3. 解剖大核细胞
- 使用小画笔挑选适当年龄的幼虫（治疗后12小时、24小时或36小时），然后将其转移到装有5 mL冰冷PBS的新培养皿中清洗。
注：在控制室中处理幼虫时，重复步骤 2.2，以消除任何食品污染。 - 用冰冷的PBS填充解剖板，并使用钳子轻轻地将幼虫转移到解剖板中。将解剖板置于立体显微镜下，执行以下解剖步骤。
注：冰冷的温度将有助于减缓幼虫的运动，并便于解剖。 - 将幼虫腹侧向上转动，背侧向下转动，并使用钳子轻轻保持到位。通过前端的咽部放置解剖销，将另一个销穿过后端的尖刺，将幼虫固定到解剖板。
注：背侧最容易被气管的背干识别。 - 使用 Vannas 弹簧剪刀从前部到后端通过表皮（纵向）切开。
- 使用钳子去除表皮的内部组织。
注：拆卸气管分支时必须小心，以避免对在表皮内表面进行局部的卵细胞的损害。 - 用钳子，取回解剖销并将表皮转移到1.5 mL微离心管中，在冰上填充PBS。
- 按照上述步骤继续解剖其他幼虫。
4. 脂滴染色
- 在室温 （RT） 下，在固定缓冲液中孵育解剖表皮 30 分钟。
注：固定缓冲液在PBS中含有4%的甲醛（PFA）。 - 拆下固定缓冲液，然后快速冲洗。要进行快速洗涤，在去除 PFA 后，在 RT 处将 1 mL 的 PBS 添加到管中，轻轻重新悬浮组织，然后丢弃 PBS。
警告：固定缓冲液包含PFA，对人体健康有害。正确处置固定缓冲液作为危险废物非常重要。 - 用 PBS 将样品清洗 3 次，每次 5 分钟，以洗掉所有可能的 PFA 残留物。
- 在旋转器上的RT上用BODIPY 493/503（1微克/mL;见材料表）孵育表皮。
注：从此步骤开始，用一块铝箔包裹微型离心管，以保护样品免受光线照射，并尽量减少可能的照片漂白。 - 取出 BODIPY 493/503 染色溶液，用 PBS 将样品清洗 3 次，每次 10 分钟，以完全去除残留染料。
5. 安装和成像
- 将 6 μL 的安装介质放在干净的显微镜幻灯片上。
注：安装介质根据其抗褪色特性用于更长的检测时间。 - 使用钳子拾取一个表皮，并用抹布轻轻取出残留的 PBS。
- 将表皮放在安装介质中并调整其方向，使其包含卵核细胞的内部表面位于底部，外部表面位于顶部。
- 轻轻地将盖玻片放在表皮上。
注：如有必要，用擦拭器清除盖玻片下泄漏的任何额外安装介质。为了便于成像，用钳子轻轻向下推盖玻片，以便在显微镜下观察滑轨时，可以在单个平面上轻松成像欧细胞簇。或者，在安装组织时，将表皮通过中间线切成两个半表皮，以避免整个表皮的卷起。 - 在盖玻片边缘周围涂抹透明指甲油以密封。
- 将幻灯片放入防光样品盒中，让指甲油在 RT 处干燥，这可能需要 5-10 分钟。
- 继续进行微观分析。使用共聚焦显微镜拍摄图像（使用优化的 GFP 或 FITC 滤波器设置放大 63 倍，激发 = 488 nm，发射 = 503 nm），以最小化背景获取清洁和敏感的信号。
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Representative Results
成功执行这个程序应导致清除脂滴染色，揭示血脂液滴的数量和大小在卵细胞。图1A，A'，A'显示，在不同发育阶段正常喂养幼虫的卵细胞中，可检测到的脂液滴（绿点）很少。图1B，B'，B''显示，在12小时（B）、24小时（B'）和36小时（B'）饥饿期时，欧细胞中的脂液滴（绿点）量增加。应该指出，96小时后，喂食的幼虫（A）似乎显示一些脂滴积累在卵虫细胞，这可能是由于其快速的生长速度。在这一阶段处理幼虫时，研究人员应给予更多的关注。
图1：脂滴染色的代表性图像。使用BODIPY 493/503在果蝇幼虫的卵虫细胞发育和饥饿的一段时间内显示图像。（A，A'，A'）食虫细胞簇群在饲料幼虫中的脂滴染色（绿点）（B，B'，B''）在12小时（B）、24小时（B'）和36小时（B'））饥饿期后，在有代表性的卵细胞簇图像中的脂滴染色（绿点），从年龄为84小时的幼虫开始。所有图像均以相同的放大倍率拍摄。比例尺 = 20 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
在上述协议中，此协议中有几个关键步骤，其中产卵周期就是其中之一。作为脂质动员组织，欧细胞对营养状态6、8高度敏感。产卵时间延长可能导致幼虫被叫，增加食物竞争，导致结果不准确。本议定书中使用的1小时产卵期允许幼虫在没有营养竞争的情况下发育。由于产卵时间较长，可能导致的幼虫数量要大得多，也可能影响卵细胞中的脂质滴量和形态（例如，大小、数量和形态）。
此外，延长产卵期也会导致幼虫种群发育阶段差异很大。在这种情况下，研究人员在使用影响胚胎或幼虫发育的突变体时应小心谨慎，因为它们对脂滴模式的影响可能受发育缺陷的继发效应的影响。时间过程表明，脂液滴在从早期第三星幼虫（84 h）到晚期第三星幼虫（120小时）的发育过程中很少在喂食条件下的卵细胞中检测到。此外，与成人中卵细胞的琥珀色素沉着不同，幼虫卵细胞是无色的5。因此，在解剖卵虫细胞时应给予更多的注意，以避免对卵细胞的潜在损害，特别是在去除周围组织（即气管分支）时。此外，脂液滴是单层膜细胞器，对Triton X-1009等洗涤剂敏感。因此，请务必确保该协议中使用的缓冲液不含洗涤剂。
如上所述，有几种染料用于测定果蝇和其他物种的脂滴量和模式变化。其中，BODIPY 493/503 可能最适合与其他荧光（如尼罗河红）或非荧光染料（如油红 O）相比，用于脂滴特异性染色;然而，更新颖和先进的染料正在开发中。例如，LipidSpot 488 及其衍生物是一系列新开发的荧光染料，对细胞膜和其他细胞器的背景染色最小。它们允许在活细胞和固定细胞中快速染色脂滴，无需清洗步骤16，17。这种脂滴染色方案的一个局限性是，它不是定量测量细胞中脂肪储备的最佳选择，尽管它适用于对脂质滴大小、数量和形态的定性评估。
除了在卵细胞中的脂滴染色外，这种方法还可用于幼虫的其他组织（即肌肉、脂肪体和肠道组织），在组织解剖和切片过程中稍作修改。此外，该方法也适用于成人组织7的脂滴染色。该方法的修改版本可推广到更广泛的应用，结合免疫组织化学染色和抗体。在这种情况下，固定组织应渗透皂苷（0.1%在RT30分钟），而不是传统的洗涤剂孵育与抗体，这有利于抗体交叉血浆膜和维护脂液滴膜完整性8。
总之，该协议为研究人员提供了一个可行的方法，以调查某些基因或环境操作是否导致血脂滴量和模式（即大小、数量和形态）的质量变化，而无需操作困难，设备和材料昂贵。
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Disclosures
提交人没有利益冲突可披露。
Acknowledgments
这项工作得到了国家自然科学基金（31671422、31529004和31601112）、111项目（D18010）、广东珀尔河人才计划地方创新与研究团队项目（2017BT01S155）和中国博士后科学基金会（2018M640767）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430829 | 50 mL |
| 6 cm Petri dish | Thermo Fisher | 150326 | 6 cm |
| Agar | For fly food | ||
| Aluminum foil | N/A | N/A | Protect smaple from light |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen | D3922 | Lipid droplet staining dye |
| Confocal microscope | Leica | Leica TSC SP5 | Confocal imaging |
| Corn syrup | For fly food | ||
| Cornmeal | For fly food | ||
| Coverslip | Citoglas | 10212424C | 20 × 20 mm, 0.13-0.17 thick |
| Dissection pin | N/A | N/A | |
| Dissection plate | N/A | N/A | |
| Filter paper | N/A | N/A | Diameter: 11 cm |
| Fixation buffer | N/A | N/A | 4% Paraformaldehyde (PFA) in 1x PBS |
| Forcep | Dumont | 11252-30 | #5 |
| Incubator | Jiangnan | SPX-380 | For fly culture |
| Microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL |
| Microscopy slide | Citoglas | 10127105P-G | |
| Mounting medium | VECTASHIELDAntifade Mounting Medium | H-1000 | Antifade mounting medium |
| Nail polish | PanEra | AAPR419 | Seal the coverslip |
| Paintbrush | N/A | N/A | |
| PBS | N/A | N/A | 1x PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,1.8 mM KH2PO4, pH 7.4) |
| Rotator | Kylin-Bell Lab Instruments | WH-986 | |
| Scissor | Smartdata Medical | SR81 | Vannas spring scissor |
| Soy flour | For fly food | ||
| Spatula | N/A | N/A | |
| Standard cornmeal food | N/A | N/A | Accoding to Bloomington standard cornmeal food recipe |
| Stereo microscope | Leica | Leica S6E | For tissue dissection |
| Wipe paper | N/A | N/A | |
| Yeast | For fly food | ||
| yw | Kept as lab stock | N/A | Drosophila |
References
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