לחיתוך וליפיד Droplet כתמים של Oenocytes בתוך דרוזופילה הזחלים
Summary
הציגו כאן הן שיטות מפורטות לחיתוך וליפיד droplet כתמים של oenocytes ב הזחלים Drosophila ילה באמצעות BODIPY 493/503, שומנים בצבעי פלורסנט ספציפי לשומנים.
Abstract
שומנים חיוניים להתפתחות בעלי חיים והומאוסטזיס פיזיולוגי. דיסרגולציה של מטבוליזם השומנים מביא לפגמים התפתחותיים שונים ומחלות, כגון השמנת יתר ושומן בכבד. בדרך כלל, שומנים מאוחסנים טיפות שומנים בדם, אשר הם שומנים משולבים אחסון השומנים בתאים. טיפות ליפיד משתנות בגודל ובמספר ברקמות שונות ובתנאים שונים. זה דווח כי טיפות השומנים מבוקרת היטב באמצעות רגולציה של biogenesis שלה השפלה. ב Drosophila ילה melanogaster, oenocyte היא רקמה חשובה עבור חילוף החומרים לשומנים והוא זוהה לאחרונה בתור הכבד האנושי אנלוגי לגבי הגיוס השומנים בתגובה ללחץ. עם זאת, המנגנונים המשמשים את הוויסות של מטבוליזם droplet השומנים ב oenocytes להישאר חמקמק. כדי לפתור בעיה זו, הוא בעל חשיבות עליונה כדי לפתח שיטה אמינה ורגישה כדי להמחיש ישירות שינויי שומנים דינמיים oenocytes במהלך הפיתוח ובתנאים מלחיצים. ניצול של ליפופילית BODIPY 493/503, השומנים droplet ספציפי לצבוע פלורסנט, תיאר כאן הוא פרוטוקול מפורט עבור הניתוח והoenocytes השומנים הבאים מכתים בתוך הזחלים של דרוזופילה בתגובה לרעב. זה מאפשר ניתוח איכותני של שומנים בדינמיקה השומנים בתנאים שונים על ידי קונפוקלית יקרוסקופיה. יתר על כן, זו שיטה מהירה ומאוד הניתנת לכימות יכול לשמש גם במסכים גנטיים עבור משיניים גורמים גנטיים הרומן מעורבים מטבוליזם droplet השומנים ב oenocytes ורקמות אחרות.
Introduction
שומנים חיוניים להישרדות התא. בנוסף התפקיד המסורתי שלהם כמו רכיבים בלתי נפרד של מערכות קרום התאית, שומנים גם לשחק פונקציות מכריע אספקת אנרגיה ו איתות התמרה ברחבי מחזורי חיים של חיות בודדות1. כך, חילוף החומרים של השומנים חייב להתאים תקנות קפדנית כדי לשמור על הומוסטאזיס פיסיולוגיים בתאים. ידוע כי דיסרגולציה של מטבוליזם השומנים תוצאות מחלות שונות, כגון סוכרת ושומן בכבד. למרות החשיבות הרבה של חילוף החומרים לשומנים בבריאות בעלי חיים, המנגנונים הבסיסיים רגולציה מטבוליזם להישאר במידה רבה לא ידוע.
דרוזופילה שימש באופן נרחב במשך שנים מאז פרופ ‘ תומס ה. מורגן התחיל להשתמש בהם במחקרים הכרוכים בגנטיקה ושאלות אחרות ביולוגיות בסיסיות2. בעשורים האחרונים, ראיות מתפתחות הראו כי drosophila ילה היא אורגניזם מודל מצוין במחקר של מחלות מטבוליזם רבים הקשורים להשמנת יתר, כגון השמנה1,3. במיוחד, מניות Drosophila ילה שמרו באופן מאוד גנים מטבוליים עם בני אדם ובעלי הרקמות הרלוונטיות דומה/איברים סוגי תאים עבור חילוף החומרים השומנים.
לדוגמה, הגוף השמן של דרוסופילה, האחראי על האחסון הטריליגליליד, מתפקד בדומה לרקמת השומן האנושית. לאחרונה, אשכול של תאים המקצועית כמו hepatocyte (כלומר, oenocytes), אשר דווחו להיות אנלוגי פונקציונלי לכבד האדם, הוכחו להיות מעורבים בחומצות שומן ומטבוליזם פחמימנים של פירות זבובים4,5. בדומה למקרה של יונקים כבדים, oenocytes להגיב לרעב על ידי הפעלת היווצרות droplet השומנים בשני הזחל ומבוגרים drosophila ילה, וכתוצאה מכך הצטברות droplet השומנים ב oenocytes4,6,7,8. מבחינה אנטומית, oenocytes הם מחוברים היטב את המשטח הפנימי הבסיס של האפידרמיס לרוחב באשכולות של כ שישה תאים לכל פלח הבטן, מה שהופך אותו מאוד מסוגל לבודד אשכולות oenocyte מן האפידרמיס. כך, oenocytes חייב להיות מחובר האפידרמיס במהלך ניתוח וכתמים.
שומנים מאוחסנים בצורה של טיפות שומנים בדם, אשר אורגלים עם ממברנות שכבה אחת בתאים9. טיפות השומנים להתקיים כמעט כל סוגי התאים על פני זנים שונים10. השומנים הדינמיקה droplet, כולל גודלו ומספר, שינוי בתגובה לגורמי הסביבה. הדבר נחשב כהשתקפות של מצב חילוף החומרים בתגובה למתח, כגון הזדקנות ורעב7,8. לכן, זה חשוב מאוד לפתח שיטה אפשרית ואמינה כדי לקבוע את השומנים droplet הדינמיקה oenocytes במהלך הפיתוח ובתנאים מלחיצים. בפרט, הזחלים הoenocytes השלישי, מכילים מעטים או לא לגילוי טיפות שומנים תחת התנאים האכילים, אבל הם מכילים רבים טיפות השומנים גדול לאחר מחסור בתזונה4. כדי לאמת את האפקטיביות של שיטה זו, הוא הציע לבצע כתמים droplet השומנים ב oenocytes תחת תנאים מורעבים.
כיום, מספר צבעים ליפופילית זמינים לצביעת טיפות שומנים בדם, כגון צבעי פלורסנט בסודאן שחור ושמן אדום וצבעי פלורסנט הנילוס אדום BODIPY 493/50311. סודן שחור, שמן אדום O משמשים בדרך כלל עבור cholesteryl אסטרים רקמות triacylglycerols ניתן לזהות בקלות על ידי מיקרוסקופ אור. עם זאת, כתמים ברקע גבוה יחסית ברזולוציה נמוכה יחסית הם שני גורמים מגבילים עבור היישומים שלה בניתוח איכותני של שומנים בדינמיקה droplet. כדי להתגבר על מגבלות של צבעי פלורסנט, הנילוס אדום ו BODIPY 493/503 מנוצלים כתחליף אידיאלי עבור כתמים droplet השומנים. זה דווח כי הנילוס אדום יכול גם לזהות כמה כולסטרול שאינו מתאים, מה שהופך bodipy 493/503 צבע ספציפי יותר עבור טיפות השומנים הסלולר, במידה מסוימת12,13,14.
מעל לכל, כדי למלא את הצורך בניתוח מהיר ורגיש של טיפות שומנים בדם ב oenocytes, פרוטוקול זה מציג שיטה אפשרית ומאוד הניתן לשימוש של fixative מבוססי שומנים באופן ספציפי droplet-ספציפיים באמצעות BODIPY 493/503 כמו צבע הכתם. בדו ח זה, oenocytes הם גזור, ו bodipy 493/503 משמש לצביעת droplet השומנים בoenocytes, שבו טיפות שומנים מזוהים על ידי מיקרוסקופ קונפוקלית וקד. הקלות והנוחות ביותר של הליך זה הופכים אותו לאידיאלי עבור שינוי ושימוש נוסף ביישומים אחרים, כגון הזרימה cy, try.
Protocol
Representative Results
Discussion
בין המפורטים לעיל, קיימים מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול זה, כאשר הביצה מניחה את תקופת הזמן להיות אחת מאלה. כרקמה מoenocyte ליפיד, מדובר ברגישות גבוהה למצב תזונה6,8. פרקי זמן ממושכים להנחת ביצים עלולים לגרום לזחלים מוארכים ולתחרות מזון מוגברת, המובילה לתוצאות לא מ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו היתה נתמכת על ידי מענקים מן הלאומי המדע הטבעי הקרן של סין (31671422, 31529004, ו 31601112), הפרויקט 111 (D18010), פרויקט מקומי חדשני וצוותי מחקר של גואנג-דונג הנהר הכשרונות התוכנית (2017bt01s155), ואת ה הקרן המדע הפוסט-דוקטורט (2018M640767).
Materials
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430829 | 50 mL |
| 6 cm Petri dish | Thermo Fisher | 150326 | 6 cm |
| Agar | For fly food | ||
| Aluminum foil | N/A | N/A | Protect smaple from light |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen | D3922 | Lipid droplet staining dye |
| Confocal microscope | Leica | Leica TSC SP5 | Confocal imaging |
| Corn syrup | For fly food | ||
| Cornmeal | For fly food | ||
| Coverslip | Citoglas | 10212424C | 20 × 20 mm, 0.13-0.17 thick |
| Dissection pin | N/A | N/A | |
| Dissection plate | N/A | N/A | |
| Filter paper | N/A | N/A | Diameter: 11 cm |
| Fixation buffer | N/A | N/A | 4% Paraformaldehyde (PFA) in 1xPBS |
| Forcep | Dumont | 11252-30 | #5 |
| Incubator | Jiangnan | SPX-380 | For fly culture |
| Microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | 1.5 ml |
| Microscopy slide | Citoglas | 10127105P-G | |
| Mounting medium | VECTASHIELDAntifade Mounting Medium | H-1000 | Antifade mounting medium |
| Nail polish | PanEra | AAPR419 | Seal the coverslip |
| Paintbrush | N/A | N/A | |
| PBS | N/A | N/A | 1xPBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,1.8 mM KH2PO4, pH 7.4) |
| Rotator | Kylin-Bell Lab Instruments | WH-986 | |
| Scissor | Smartdata Medical | SR81 | Vannas spring scissor |
| Soy flour | For fly food | ||
| Spatula | N/A | N/A | |
| Standard cornmeal food | N/A | N/A | Accoding to Bloomington standard cornmeal food recipe |
| Stereo microscope | Leica | Leica S6E | For tissue dissection |
| Wipe paper | N/A | N/A | |
| Yeast | For fly food | ||
| yw | Kept as lab stock | N/A | Drosophila |
References
- Liu, Z., Huang, X. Lipid metabolism in Drosophila: development and disease. Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 45 (1), 44-50 (2013).
- Cheng, Y., Chen, D. Fruit fly research in China. Journal of Genetics and Genomics. 45 (11), 583-592 (2018).
- Warr, C. G., Shaw, K. H., Azim, A., Piper, M. D. W., Parsons, L. M. Using mouse and Drosophila models to investigate the mechanistic links between diet, obesity, type II diabetes, and cancer. International Journal of Molecular Science. 19 (12), (2018).
- Gutierrez, E., Wiggins, D., Fielding, B., Gould, A. P. Specialized hepatocyte-like cells regulate Drosophila lipid metabolism. Nature. 445 (7125), 275-280 (2007).
- Makki, R., Cinnamon, E., Gould, A. P. The development and functions of oenocytes. Annual Review of Entomology. 59, 405-425 (2014).
- Chatterjee, D., et al. Control of metabolic adaptation to fasting by dILP6-induced insulin signaling in Drosophila oenocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (50), 17959-17964 (2014).
- Yan, Y., et al. HDAC6 suppresses age-dependent ectopic fat accumulation by maintaining the proteostasis of PLIN2 in Drosophila. Developmental Cell. 43 (1), 99-111 (2017).
- Yan, Y., et al. HDAC6 regulates lipid droplet turnover in response to nutrient deprivation via p62-mediated selective autophagy. Journal of Genetics and Genomics. 46 (4), 221-229 (2019).
- Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets finally get a little R-E-S-P-E-C-T. Cell. 139 (5), 855-860 (2009).
- Murphy, D. J. The dynamic roles of intracellular lipid droplets: from archaea to mammals. Protoplasma. 249 (3), 541-585 (2012).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68 (1), 105-115 (2014).
- Fowler, S. D., Greenspan, P. Application of Nile red, a fluorescent hydrophobic probe, for the detection of neutral lipid deposits in tissue sections: comparison with oil red O. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 833-836 (1985).
- Gocze, P. M., Freeman, D. A. Factors underlying the variability of lipid droplet fluorescence in MA-10 Leydig tumor cells. Cytometry. 17 (2), 151-158 (1994).
- Fam, T. K., Klymchenko, A. S., Collot, M. Recent advances in fluorescent probes for lipid droplets. Materials (Basel). 11 (9), (2018).
- BDSC Standard Cornmeal Medium. Bloomington Drosophila Stock Center Available from: https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html (2019)
- Milon, A., et al. Do estrogens regulate lipid status in testicular steroidogenic Leydig cell?. Acta Histochemica. 121 (5), 611-618 (2019).
- Farmer, B. C., Kluemper, J., Johnson, L. A. Apolipoprotein E4 alters astrocyte fatty acid metabolism and lipid droplet formation. Cells. 8 (2), (2019).
