Summary
Aquí se presentan métodos detallados para la disección y la tinción de gotas lipídicas de los enocitos en larvas de Drosophila utilizando BODIPY 493/503, un tinte fluorescente específico de gotas de lípidos.
Abstract
Los lípidos son esenciales para el desarrollo animal y la homeostasis fisiológica. La desregulación del metabolismo lipídico da lugar a diversos defectos del desarrollo y enfermedades, como la obesidad y el hígado graso. Por lo general, los lípidos se almacenan en gotas de lípidos, que son los orgánulos multifuncionales de almacenamiento de lípidos en las células. Las gotas de lípidos varían en tamaño y número en diferentes tejidos y en diferentes condiciones. Se ha informado que las gotas de lípidos están estrechamente controladas a través de la regulación de su biogénesis y degradación. En Drosophila melanogaster, el enocito es un tejido importante para el metabolismo de los lípidos y se ha identificado recientemente como un análogo del hígado humano con respecto a la movilización de lípidos en respuesta al estrés. Sin embargo, los mecanismos subyacentes a la regulación del metabolismo de las gotas lipídicas en los enocitos siguen siendo esquivas. Para resolver este problema, es de suma importancia desarrollar un método fiable y sensible para visualizar directamente los cambios dinámicos de gotas lipídicas en los enocitos durante el desarrollo y en condiciones estresantes. Aprovechando el BODIPY 493/503 lipofílico, un tinte fluorescente específico de gotas lipídicas, descrito aquí es un protocolo detallado para la disección y posterior tinción de gotas lipídicas en los enocitos de larvas de Drosophila en respuesta a la inanición. Esto permite el análisis cualitativo de la dinámica de gotas lipídicas bajo diversas condiciones por microscopía confocal. Además, este método rápido y altamente reproducible también se puede utilizar en pantallas genéticas para identificar nuevos factores genéticos que implican el metabolismo de las gotas lipídicas en los enocitos y otros tejidos.
Introduction
Los lípidos son esenciales para la supervivencia celular. Además de su papel tradicional como componentes integrales de los sistemas de membrana celular, los lípidos también desempeñan funciones cruciales en el suministro de energía y la transducción de señalización a lo largo de los ciclos de vida de los animales individuales1. Por lo tanto, el metabolismo de los lípidos debe ajustarse a estrictas regulaciones para mantener la hemostasis fisiológica en las células. Se sabe que la desregulación del metabolismo lipídico resulta en varias enfermedades, como la diabetes y el hígado graso. A pesar de la gran importancia del metabolismo lipídico en la salud animal, los mecanismos subyacentes a la regulación del metabolismo lipídico siguen siendo en gran parte desconocidos.
Drosophila se ha utilizado ampliamente durante años desde que el profesor Thomas H. Morgan comenzó a utilizarlos en estudios relacionados con la genética y otras preguntas biológicas básicas2. En las últimas décadas, la evidencia emergente ha demostrado que la drosophila es un excelente organismo modelo en el estudio de muchas enfermedades asociadas al metabolismo lipídico, como la obesidad1,3. En particular, Drosophila comparte genes metabólicos altamente conservados con los seres humanos y poseen tejidos/órganos relevantes similares y tipos celulares para el metabolismo de los lípidos.
Por ejemplo, el cuerpo gordo de Drosophila,que es responsable del almacenamiento de triacilglicéridos, funciones análogas al tejido adiposo humano. Recientemente, se ha demostrado que un grupo de células especializadas similares a los hepatocitos (es decir, los enocitos), que se ha informado que son un análogo funcional al hígado humano, están implicados en el metabolismo de ácidos grasos e hidrocarburos en moscas de la fruta4,5. Al igual que en los hígados de mamíferos, los enocitos responden a la inanición activando la formación de gotas lipídicas tanto en Drosophilalarval como en adulta, lo que resulta en la acumulación de gotas lipídicas en los enocitos4,6,7,8. Anatómicamente, los enocitos están estrechamente unidos a la superficie interna basal de la epidermis lateral en grupos de aproximadamente seis células por hemisegmento abdominal, lo que hace que sea impracticable aislar los racimos de oenocitos de la epidermis. Por lo tanto, los enocitos deben estar unidos a la epidermis durante la disección y la tinción.
Los lípidos se almacenan en forma de gotas de lípidos, que son orgánulos con membranas de una sola capa en las células9. Las gotas de lípidos existen en casi todos los tipos de células en diferentes especies10. La dinámica de las gotas de lípidos, incluyendo su tamaño y número, cambia en respuesta a los factores estresantes ambientales. Esto se considera como un reflejo del estado metabólico en respuesta al estrés, como el envejecimiento y el hambre7,8. Por lo tanto, es de gran importancia desarrollar un método factible y confiable para determinar cualitativamente la dinámica de las gotas lipídicas en los enocitos durante el desarrollo y en condiciones estresantes. En particular, en la tercera larva instar, los enocitos contienen pocas o ninguna gotita de lípidos detectables en condiciones de alimentación, pero contienen numerosas gotas de lípidos grandes después de la privación nutricional4. Para verificar la eficacia de este método, se sugiere realizar la tinción de gotas de lípidos en los enocitos en condiciones de hambre.
Actualmente, varios colorantes lipofílicos están disponibles para las manchas de gotas lipídicas, tales como los colorantes no fluorescentes Sudán Negro y Aceite Rojo O y los colores fluorescentes Nilo Rojo y BODIPY 493/50311. Sudán Negro y Aceite Rojo O se utilizan comúnmente para ésteres de colesteryl tejido y triacilgroles y pueden ser fácilmente detectados por microscopía de luz. Sin embargo, la tinción de fondo relativamente alta y una resolución relativamente baja son dos factores limitantes para sus aplicaciones en el análisis cualitativo de la dinámica de las gotas lipídicas. Para superar las limitaciones de los colorantes no fluorescentes, Nile Red y BODIPY 493/503 se utilizan como sustitutos ideales para la tinción de gotas de lípidos. Se ha informado que el rojo del Nilo también puede detectar algún colesterol no esterificado, lo que hace que BODIPY 493/503 sea un tinte más específico para las gotas de lípidos celulares, hasta cierto punto12,13,14.
Sobre todo, para satisfacer la necesidad de un análisis rápido y sensible de las gotas lipídicas en los enocitos, este protocolo presenta un método factible y altamente reproducible de tinción específica de gotas de lípidos a base de fijación utilizando BODIPY 493/503 como tinte de mancha. En este informe, los olores se diseccionan, y BODIPY 493/503 se utiliza para la tinción de gotas lipídicas en los enocitos, en los que las gotas lipídicas se detectan mediante microscopía confocal. La facilidad y asequibilidad de este procedimiento lo hacen ideal para su modificación y uso posterior en otras aplicaciones, como la citometría de flujo.
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Protocol
1. Colocación de huevos
- Prepare los alimentos estándar de harina de maíz para la puesta de huevos.
NOTA: Para la receta y el procedimiento de cocción de los alimentos estándar de harina de maíz utilizados aquí, ver los detalles publicados anteriormente15. - Preparar la pasta de levadura fresca añadiendo 6 ml de agua destilada a 4 g de levadura seca activa en un tubo centrífugo de 50 ml. Usa una espátula para mezclar y hacer una pasta.
- Haga botellas de puesta de huevos llenando los alimentos de harina de maíz en las botellas y esparza aproximadamente 1 g de pasta de levadura sobre la superficie del alimento de harina de maíz con una espátula.
- Colocar las moscas de los genotipos deseados en una botella de puesta de huevos y colocarlas en una incubadora con una temperatura constante de 25oC y una humedad del 60%.
NOTA: Las cruces ideales suelen consistir en 150 moscas vírgenes y al menos 75 machos. Mantener las moscas en la oscuridad colocando una caja a prueba de luz sobre las botellas de puesta de huevos aumentará la tasa de reproducción. - Antes de la recolección de huevos, deje que las moscas pongan huevos durante 1 h para permitir la eliminación de todos los huevos viejos que permanecen almacenados en los oviductos femeninos.
- Deje que las moscas pongan huevos en una botella nueva durante 1 h y retire a los adultos de la botella.
NOTA: Controlar el tiempo de puesta de huevos para minimizar el rango de desarrollo con el fin de obtener larvas dentro de una etapa de desarrollo controlada con precisión. - Dejar que los huevos se desarrollen durante 84 h en las larvas de la tercera estrella en la incubadora a 25 oC con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h/12 h.
2. Tratamiento de inanición para las larvas
NOTA: Como se mencionó anteriormente, en la tercera larva instar, hay pocas o ninguna gotas de lípidos detectables en los olores en condiciones normales de alimentación, pero numerosas gotas de lípidos grandes pueden ser inducidas en los enocitos en condiciones de estrés, como el hambre. Para verificar aún más este método, es necesario pretratar estas larvas para inducir la biogénesis de gotas lipídicas en los enocitos. Aquí, un curso de tiempo de hambre de 12 h, 24 h y 36 h fue elegido como paradigma. En particular, un corto período de inanición (por ejemplo, 3 h) es suficiente para inducir gotas de lípidos detectables en los ovocitos. La duración del hambre puede variar según los objetivos y ajustes experimentales específicos.
- Haga cámaras para tratamientos de inanición y control.
- Para cámaras de tratamiento de hambre: coloque un papel de filtro de tamaño adecuado en una placa Petri de 6 cm y una pipeta de 1 ml de PBS en el papel de filtro.
- Para cámaras de tratamiento de control: coloque 5 ml de harina de maíz estándar Bloomington en el plato Petri.
- Utilice una espátula para desenterrar suavemente la capa superior de alimentos que contienen larvas que todavía están cavando en los alimentos y transferirlos a un plato de Petri lleno de 5 ml de PBS. Revuelva suavemente las larvas en PBS para eliminar cualquier contaminación alimentaria de las larvas y hacerlas lo más limpias posible.
- Usa un pequeño pincel para recoger 40 terceras larvas instar del mismo tamaño aproximado. Ordenarlos aleatoriamente en una cámara de control o hambre, con 20 larvas cada una.
- Colocar las cámaras en la incubadora a 25oC con 60% de humedad y permitir el desarrollo durante 12 h, 24 h y 36 h de tratamiento.
NOTA: Para las larvas de la cámara de inanición, añadir 1 mL de PBS cada 12 h para evitar la deshidratación de las larvas.
3. Disección de enocitos
- Use un pequeño pincel para recoger larvas de la edad apropiada (12 h, 24 h o 36 h después del tratamiento), luego transfieralas a un nuevo plato DePetr lleno de 5 ml de PBS helado para lavarlos.
NOTA: Repita el paso 2.2 cuando trate con larvas en una cámara de control para eliminar cualquier contaminación de los alimentos. - Llene una placa de disección con PBS helado y use fórceps para transferir suavemente las larvas a la placa de disección. Coloque la placa de disección bajo un microscopio estéreo para el siguiente paso de disección.
NOTA: La temperatura helada ayudará a ralentizar los movimientos de las larvas y facilitará la disección. - Gire el lado ventral de las larvas hacia arriba y el lado dorsal hacia abajo y mantenga suavemente en su lugar usando fórceps. Fije las larvas a la placa de disección colocando un pasador de disección a través de la faringe en el extremo anterior y otro pasador a través del espiráculo en el extremo posterior.
NOTA: El lado dorsal se identifica más fácilmente por la presencia de los troncos dorsales de la tráquea. - Utilice las tijeras de resorte Vannas para incisor (longitudinalmente) a través de la epidermis desde el extremo anterior hasta el posterior.
- Retire el tejido interno de la epidermis con fórceps.
NOTA: Se debe tener precaución al retirar las ramas traqueales para evitar daños en los enocitos, que se localizan en la superficie interna de la epidermis. - Con fórceps, recupere los pasadores de disección y transfiera la epidermis a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml lleno de PBS sobre hielo.
- Continúe diseccionando otras larvas siguiendo el procedimiento descrito anteriormente.
4. Tinción de gotas de lípidos
- Incubar la epidermis diseccionada en el tampón de fijacióndurante 30 minutos a temperatura ambiente (RT) en un rotador.
NOTA: El búfer de fijación contiene 4% de paraformaldehído (PFA) en PBS. - Retire el tampón de fijación, seguido de un lavado rápido. Para realizar un lavado rápido, agregue 1 ml de PBS en RT en el tubo después de la extracción de PFA, resuspende suavemente los tejidos y deseche el PBS.
PRECAUCION: El búfer de fijación contiene PFA, que es perjudicial para la salud humana. Es importante eliminar correctamente el tampón de fijación como residuo peligroso. - Lave las muestras 3 veces durante 5 minutos cada una con PBS para lavar todos los posibles residuos de PFA.
- Incubar la epidermis con BODIPY 493/503 (1 g/ml; ver Tabla de Materiales)durante 30 min a RT en un rotador.
NOTA: A partir de este paso, envuelva el tubo de microcentrífuga con un pedazo de papel de aluminio para proteger las muestras de la luz y minimizar el posible fotoblanqueo. - Retire la solución de tinción BODIPY 493/503 y lave las muestras 3 veces durante 10 minutos cada una con PBS para eliminar completamente los colorantes residuales.
5. Montaje e imágenes
- Coloque el medio de montaje de 6 ml sobre una corredera de microscopio limpia.
NOTA: El medio de montaje se utiliza para un tiempo de detección más largo basado en sus propiedades antidescolor. - Use fórceps para recoger una epidermis y retire suavemente el PBS residual con una toallita.
- Coloque la epidermis en el medio de montaje y ajuste su orientación para que su superficie interna que contenga los enocitos esté en la parte inferior y su superficie externa esté en la parte superior.
- Coloque suavemente un cubreobjetos en la epidermis.
NOTA: Retire cualquier medio de montaje adicional con fugas de debajo de la cubierta con una toallita, si es necesario. Para facilitar la toma de imágenes, empuje suavemente hacia abajo en la cubierta con fórceps para que, al observar la diapositiva a través del microscopio, el clúster de enocitos se pueda tomar fácilmente una imagen en un solo plano. Alternativamente, es factible cortar la epidermis en dos semi-epidermis a través de la línea media para evitar la acumulación de toda la epidermis al montar los tejidos. - Aplique esmalte de uñas transparente alrededor de los bordes de la cubierta para sellar.
- Coloque las diapositivas en una caja de muestra a prueba de luz y deje que el esmalte de uñas se seque en RT, que puede tardar de 5 a 10 minutos.
- Proceder con el análisis microscópico. Tomar imágenes utilizando un microscopio confocal (magnificación de 63x con ajustes optimizados de filtro GFP o FITC, excitación a 488 nm, emisión a 503 nm) para adquirir señales limpias y sensibles con fondo minimizado.
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Representative Results
La ejecución exitosa de este procedimiento debe dar lugar a gotas de lípidos claras manchadas que revelan el número y el tamaño de gotas de lípidos en los enocitos. La Figura 1A,A',A'' muestra que hay pocas gotas de lípidos detectables (puntos verdes) en los enocitos de las larvas de alimentación normal durante diferentes etapas del desarrollo. La Figura 1B,B',B'' muestra el aumento de las gotas lipídicas (puntos verdes) cantidad en los oenocitos en respuesta a 12 h (B), 24 h (B'), y 36 h (B'') períodos de inanición. Cabe señalar que después de 96 h, las larvas alimentadas (A) parecían mostrar alguna acumulación de gotas lipídicas en los enocitos, que pueden haber sido debido a sus tasas de crecimiento rápido. Los investigadores deben prestar mayor atención al tratar con las larvas durante esta etapa.
Figura 1: Imágenes representativas de la tinción de gotas lipídicas. Las imágenes se muestran en el curso del tiempo de desarrollo y hambre en los enocitos de las larvas de Drosophila utilizando BODIPY 493/503. (A,A',A'') La tinción de gotas de lípidos (puntos verdes) de imágenes representativas de enocitos se agrupan en larvas alimentadas. (B,B',B'') Tinción de gotas lipídicas (puntos verdes) en imágenes representativas de los racimos de oenocitos después de 12 h (B), 24 h (B') y 36 h (B'') períodos de inanición, a partir de larvas con una edad de 84 h. Todas las imágenes fueron tomadas en el mismo aumento. Barra de escala a 20 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Entre los descritos anteriormente, hay varios pasos críticos en este protocolo, con el período de tiempo de puesta de huevos siendo uno de estos. Como tejido movilizador de lípidos, el enocito es altamente sensible al estado nutricional6,8. Los períodos prolongados de tiempo de puesta de huevos pueden dar lugar a larvas cantosas y a una mayor competencia alimentaria, lo que conduce a resultados inexactos. El período de tiempo de puesta de huevos de 1 h utilizado en este protocolo permite que las larvas se desarrollen sin competencia nutricional. Un número mucho mayor de larvas que pueden resultar de períodos de tiempo de puesta de óvulos más largos también puede afectar las cantidades y patrones de gotas lipídicas (por ejemplo, tamaño, número y morfología) en los enocitos.
Además, períodos prolongados de tiempo de puesta de huevos también resulta en una población larvaria con una amplia variación de las etapas del desarrollo. En este contexto, los investigadores deben tener cuidado al usar mutantes que afectan el desarrollo embrionario o larvario, ya que su influencia en los patrones de gotas lipídicas puede verse influenciada por los efectos secundarios de los defectos del desarrollo. El procedimiento de curso de tiempo sugiere que las gotas de lípidos rara vez son detectables en la condición de alimentado socitos durante el desarrollo de larvas de tercera estrella tempranas (84 h) a larvas de tercera estrella tardías (120 h). Además, a diferencia de la pigmentación ámbar de los enocitos en adultos, los enocitos larvarias son incoloros5. Por lo tanto, se debe prestar mayor atención durante la disección de enocitos para evitar posibles daños a los enocitos, especialmente cuando se extraen los tejidos circundantes (es decir, ramas traqueales). Además, las gotas lipídicas son orgánulos de membrana de una sola capa, que son sensibles a detergentes como Triton X-1009. Por lo tanto, es importante asegurarse de que los tampones utilizados en este protocolo no contengan detergentes.
Como se mencionó anteriormente, hay varios distees utilizados para determinar la cantidad de gotas de lípidos y cambios de patrón en Drosophila y otras especies. Entre ellos, BODIPY 493/503 puede ser más adecuado para la tinción específica de gotas de lípidos en comparación con otros colorantes fluorescentes (por ejemplo, rojo del nilo) o no fluorescentes (por ejemplo, aceite rojo O); aunque se están desarrollando más yados novedosos y avanzados. Por ejemplo, LipidSpot 488 y sus derivados son una serie de colorantes fluorescentes recién desarrollados con mínima tinción de fondo de membranas celulares y otros orgánulos. Permiten la tinción rápida de gotas de lípidos en células vivas y fijas, sin necesidad de paso de lavado16,17. Una limitación de este protocolo de tinción de gotas lipídicas es que no es óptimo para medir cuantitativamente las reservas de grasa en las células, a pesar de que funciona bien para la evaluación cualitativa del tamaño, número y morfología de las gotas de lípidos.
Además de la tinción de gotas lipídicas en los ovenocitos, este método también se puede aplicar a otros tejidos de larvas (es decir, músculo, cuerpo de grasa y tejido intestinal) con modificaciones menores durante la disección de tejidos y el seccionamiento7. Por otra parte, este método también funciona bien para la tinción de gotas de lípidos de los tejidos adultos7. Una versión modificada de este método puede extenderse a aplicaciones más amplias en combinación con la tinción inmunohistoquímica con anticuerpos. En este caso, los tejidos fijos deben impregnarse de saponina (0,1% durante 30 min a RT) en lugar de detergentes tradicionales antes de incubar con anticuerpos, lo que facilita el cruce de anticuerpos a través de membranas plasmáticas y el mantenimiento de la integridad de la membrana de gotas lipídicas8.
En resumen, este protocolo proporciona un método factible para que los investigadores investiguen si ciertas manipulaciones genéticas o ambientales causan cambios cualitativos en las cantidades y patrones de gotas de lípidos (es decir, tamaño, número y morfología) sin necesidad de operaciones difíciles y equipos y materiales costosos.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31671422, 31529004 y 31601112), el Proyecto 111 (D18010), el Proyecto Local de Equipos de Innovación e Investigación del Programa de Talentos del Río Guangdong Perl (2017BT01S155), y el Fundación De Ciencia Postdoctoral de China (2018M640767).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430829 | 50 mL |
| 6 cm Petri dish | Thermo Fisher | 150326 | 6 cm |
| Agar | For fly food | ||
| Aluminum foil | N/A | N/A | Protect smaple from light |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen | D3922 | Lipid droplet staining dye |
| Confocal microscope | Leica | Leica TSC SP5 | Confocal imaging |
| Corn syrup | For fly food | ||
| Cornmeal | For fly food | ||
| Coverslip | Citoglas | 10212424C | 20 × 20 mm, 0.13-0.17 thick |
| Dissection pin | N/A | N/A | |
| Dissection plate | N/A | N/A | |
| Filter paper | N/A | N/A | Diameter: 11 cm |
| Fixation buffer | N/A | N/A | 4% Paraformaldehyde (PFA) in 1x PBS |
| Forcep | Dumont | 11252-30 | #5 |
| Incubator | Jiangnan | SPX-380 | For fly culture |
| Microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL |
| Microscopy slide | Citoglas | 10127105P-G | |
| Mounting medium | VECTASHIELDAntifade Mounting Medium | H-1000 | Antifade mounting medium |
| Nail polish | PanEra | AAPR419 | Seal the coverslip |
| Paintbrush | N/A | N/A | |
| PBS | N/A | N/A | 1x PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,1.8 mM KH2PO4, pH 7.4) |
| Rotator | Kylin-Bell Lab Instruments | WH-986 | |
| Scissor | Smartdata Medical | SR81 | Vannas spring scissor |
| Soy flour | For fly food | ||
| Spatula | N/A | N/A | |
| Standard cornmeal food | N/A | N/A | Accoding to Bloomington standard cornmeal food recipe |
| Stereo microscope | Leica | Leica S6E | For tissue dissection |
| Wipe paper | N/A | N/A | |
| Yeast | For fly food | ||
| yw | Kept as lab stock | N/A | Drosophila |
References
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