La termoforesis a microescala obtiene constantes de unión rápidamente a bajo costo de material. La termoforesis a microescala etiquetada o sin etiqueta está disponible comercialmente; sin embargo, la termoforesis sin etiquetas no es capaz de la diversidad de mediciones de interacción que se pueden realizar utilizando etiquetas fluorescentes. Proporcionamos un protocolo para mediciones de termoforesis etiquetadas.
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Artículo de método
Uso de la termoforesis a microescala para medir las interacciones proteína-lípido
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Resumen
Resumen
La capacidad de determinar la afinidad de unión de los lípidos a las proteínas es una parte esencial de la comprensión de las interacciones proteína-lípido en el tráfico de membranas, la transducción de señales y la remodelación citoesquelética. Las herramientas clásicas para medir tales interacciones incluyen la resonancia de plasmón de superficie (SPR) y la calorimetría de titulación isotérmica (ITC). Si bien son herramientas poderosas, estos enfoques tienen contratiempos. ItC requiere grandes cantidades de proteína purificada, así como lípidos, que pueden ser costosos y difíciles de producir. Además, el ITC y el SPR consumen mucho tiempo, lo que podría aumentar significativamente el costo de realizar estos experimentos. Una forma de evitar estas restricciones es utilizar la técnica relativamente nueva de termoforesis a microescala (MST). MST es rápido y rentable utilizando pequeñas cantidades de muestra para obtener una curva de saturación para un evento de unión dado. Actualmente hay dos tipos de sistemas MST disponibles. Un tipo de MST requiere etiquetado con un fluoróforo en el espectro azul o rojo. El segundo sistema se basa en la fluorescencia intrínseca de los aminoácidos aromáticos en el rango UV. Ambos sistemas detectan el movimiento de las moléculas en respuesta a la inducción localizada de calor de un láser infrarrojo. Cada enfoque tiene sus ventajas y desventajas. El MST sin etiquetas puede usar proteínas nativas sin etiquetar; sin embargo, muchos analitos, incluidos los productos farmacéuticos, emiten fluorescencia en el rango UV, lo que puede interferir con la determinación de valores precisos de KD. En comparación, el MST etiquetado permite una mayor diversidad de interacciones medibles por pares utilizando sondas marcadas fluorescentemente unidas a ligandos con absorbancias medibles en el rango visible en lugar de UV, lo que limita el potencial de interferencia de señales de analitos.
Introducción
La termoforesis a microescala es una técnica relativamente nueva para determinar constantes de disociación (KD) y constantes de inhibición (IC50) entre ligandos bioquímicamente relevantes. El minorista comercial líder para MST (por ejemplo, NanoTemper) ofrece dos tecnologías populares de MST: 1) MST sin etiquetas que requiere una etiqueta fluorescente, y 2) termoforesis etiquetada utilizando la fluorescencia inherente de proteínas dependientes del número de residuos aromáticos presentes en cada proteína1. Una desventaja de la termoforesis sin etiqueta es que, en la mayoría de los casos, no permite la medi....
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Protocolo
1. Preparación de materiales
- Preparar solución salina tamponada con fosfato (PBS): 137 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM NaH2PO4 y 2 mM KH2PO4, pH 7.41.
- Preparar el tinte NTA-Atto 647 N. Diluya el tinte NTA-Atto 647 N a 100 nM de una solución 100% DMSO en PBS sin Tween.
- Express Vam7-His8 – Proteína como proteína de fusión en E. coli y purificar mediante Cromatografía de Ni-NTA y exclusión de tamaño8.
- Valore el analito en el tampón PBS. Si el analito está en un tampón diferente, el MST etiquetado no es particularmente sensible a las dife....
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Resultados
Esta es una salida de muestra utilizando el análisis de afinidad. El MST etiquetado se utilizó para determinar la constante de unión del Vam7-His8 al dioctanoilo soluble (DiC8) PA de uno de sus sustratos naturales9. La Figura 1 presenta los rastros termoforéticos de un ensayo de una titulación 1:1 de DiC8 PA a partir de 500 μM contra 50 nM de Vam7-His8. Se muestra la fluorescencia inicial (tiempo antes de que se encienda el láser infrarrojo), Tjump (tiempo inicialment.......
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Discusión
La determinación de Vam7-His8unión a DiC8-PA proporcionó un KD ajustado robusto para la interacción dada, que es una afinidad ligeramente menor que el KD medido de Vam7-His8 a los liposomas pa (no publicado). Esta diferencia se debe muy probablemente a la falta de una membrana, lo que generalmente resulta en una menor afinidad por las interacciones de unión lipídica específicas de la membrana y, por lo tanto, demuestra el papel del andamio de membrana del liposoma.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no existe un posible conflicto de intereses.
Agradecimientos
Esta investigación fue apoyada por una subvención de la National Science Foundation (MCB 1818310) a la RAF. Este trabajo fue apoyado en parte por la Instalación Básica de Biología Química / Unidad de Cristalografía de Proteínas en el Centro oncológico H. Lee Moffitt (NIH / NCI: P30-CA076292).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Cy5 Maleimida Colorante Mono-Reactivo GE | Healthcare | PA23031 | para el etiquetado de proteínas |
| Graphpad Prsim | Graphpad software | ||
| Monolith NT.115 Capilares (1000 unidades) | Nanotemper | MO-K022 | Capilares para máquina MST |
| Monolith NT.115 | Equipo universitario | Nanotemper | |
| NTA-Atto 647 N | Sigma | 2175 | etiqueta para sus etiquetas |
| Fosfatidilinositol 3-fosfato diC8 (PI(3)P diC8) | Echelon | P-3008 | Lípidos para experimentos de unión |
Referencias
- Jerabek-Willemsen, M., et al. MicroScale Thermophoresis: Interaction analysis and beyond. Journal of Molecular Structure. 1077, 101-113 (2014).
- Chapman, D., Hochstrasser, R., Millar, D., Youderia, nP.
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Reimpresiones y permisos
