Summary
We presenteren het kipchorioallantoïsche membraanmodel als een alternatief, transplanteerbaar, in vivo model voor de engraftment van gynaecologische en urologische kankercellijnen en tumoren die door de patiënt zijn afgeleid.
Abstract
Muismodellen zijn de benchmarktests voor in vivo kankerstudies. Kosten, tijd en ethische overwegingen hebben echter geleid tot oproepen tot alternatieve in vivo kankermodellen. Het kipchorioallantoïsche membraan (CAM) model biedt een goedkoop, snel alternatief dat directe visualisatie van tumorontwikkeling mogelijk maakt en geschikt is voor in vivo beeldvorming. Als zodanig probeerden we een geoptimaliseerd protocol te ontwikkelen voor het enten van gynaecologische en urologische tumoren in dit model, dat we hier presenteren. Ongeveer 7 dagen na bevruchting wordt de luchtcel verplaatst naar de gevasculariseerde kant van het ei, waar een opening in de schaal wordt gecreëerd. Tumoren uit murine en menselijke cellijnen en primaire weefsels kunnen dan worden geënt. Deze zijn meestal gezaaid in een mengsel van extracellulaire matrix en medium om cellulaire verspreiding te voorkomen en bieden voedingsstoffen ondersteuning totdat de cellen werven een vasculaire levering. Tumoren kunnen dan groeien tot een extra 14 dagen voorafgaand aan de eieren uitkomen. Door het implanteren van cellen stabiel getrans-transduced met firefly luciferase, bioluminescentie beeldvorming kan worden gebruikt voor de gevoelige detectie van tumorgroei op het membraan en kankercel verspreid over het embryo. Dit model kan mogelijk worden gebruikt om tumorigeniciteit, invasie, metastase en therapeutische effectiviteit te bestuderen. De kip CAM model vergt aanzienlijk minder tijd en financiële middelen in vergelijking met traditionele murine modellen. Omdat de eieren immuungecompromitteerd en immuuntolerant zijn, kunnen weefsels van elk organisme mogelijk worden geïmplanteerd zonder kostbare transgene dieren (bijvoorbeeld muizen) die nodig zijn voor implantatie van menselijke weefsels. Echter, veel van de voordelen van dit model kan potentieel ook beperkingen, met inbegrip van de korte tumor generatie tijd en immunogecompromitteerde / immuun tolerante status. Bovendien, hoewel alle tumortypes hier engraft in de kip chorioallantoic membraan model, ze doen dit met verschillende mate van tumorgroei.
Introduction
Muizen hebben gediend als het klassieke model organisme voor de studie van menselijke ziekten, met inbegrip van maligniteit. Als zoogdieren, ze delen veel overeenkomsten met de mens. Hun hoge mate van genetische gelijkenis heeft transgene manipulatie van het muizengenoom toegestaan om een enorm inzicht te geven in de genetische bestrijding van menselijke ziekten1. Uitgebreide ervaring in de behandeling van en experimenteren met muizen heeft geresulteerd in hun zijn het model van keuze voor biomedisch onderzoek. Echter, in aanvulling op de ethische en wetenschappelijke bezorgdheid met betrekking tot murine modellen, kunnen ze ook vrij duur en tijdrovend2,3. De ontwikkeling van tumoren kan weken of zelfs maanden duren. De huisvesting bij een typische instelling alleen kan draaien in de honderden tot duizenden dollars, terwijl tumoren zich ontwikkelen. Eierstokkanker is een voorbeeld van dit nadeel, omdat de groei van murine modellen kan gemakkelijk maanden duren. Vertragingen in de voortgang van het onderzoek hebben mogelijk gevolgen voor de aanhoudend lage overlevingskans van 5 jaar van 5 jaar van patiënten met eierstokkanker (d.w.z. een toename van de overleving van slechts 10% over 30 jaar)4. Op dezelfde manier vormen urologische kankers (nier-, prostaat- en blaaskanker) 19% van alle kankergevallen in de Verenigde Staten en 11% van de sterfgevallen in verband met kanker4. Zo kan een nieuwe in vivo benadering van gynaecologische en urologische kankers een laboratorium veel tijd, arbeid en geld besparen, zelfs als dit model alleen wordt toegepast op eerste screeningexperimenten. Bovendien kan de resulterende versnelling van de onderzoeksresultaten aanzienlijke gevolgen hebben voor de 177.000 personen gediagnosticeerd met deze kankers per jaar.
Het kip CAM model biedt vele voordelen die de bovengenoemde problemen aanpakken. Een populair model voor het bestuderen van angiogenese5,6, tumorcel invasie7,8, en metastase7,9, het kuiken embryo CAM model is al gebruikt om vele vormen van kanker te bestuderen, waaronder glioom10,11,12, hoofd en nek plaveiselcelcarcinoom13,14,leukemie15,16, alvleesklierkanker17, en colorectale kanker18. Daarnaast zijn CAM-modellen gegenereerd voor neuroblastoom19, Burkitt lymfoom20, melanoom21, en feline fibrosarcoma22. Eerdere studies hebben ook gepresenteerd engraftment van blaaskanker23 en prostaatkanker cel lijnen24, maar met beperkte protocol details. Eieren zijn niet alleen veel goedkoper dan muizen, maar produceren ook zeer reproduceerbare resultaten25,26. Ze tonen een snelle vasculatuur ontwikkeling, en tumor engraftment kan optreden in zo snel als een paar dagen en worden in de lengterichting gevisualiseerd door het open venster. Met het 21 dagen tijdsbestek tussen eibevruchting en uitkomen, kunnen experimenten binnen een paar weken worden voltooid. Bovendien, de lage kosten, beperkte huisvesting behoeften, en kleine omvang gemakkelijk mogelijk grootschalige experimenten die onbetaalbaar zou zijn voor muis studies.
Daarom hebben we geprobeerd om het CAM-model te optimaliseren voor de engraftment van gynaecologische en urologische kankers. Door de immunogecompromitteerde status van het vroege kippenembryo27kunnen zowel muis- als menselijke cellen gemakkelijk worden geïmplanteerd. Als zodanig hebben we met succes geënt eierstokkanker, nier-, prostaat- en blaaskanker. Voor elk van deze tumortypes accepteert de CAM gemakkelijk gevestigde murine- en/of menselijke tumorcellijnen. Belangrijk is dat vers geoogste primaire menselijke tumorweefsels ook kunnen enten van verteerde cellen of stukken vast weefsel met een hoog succespercentage. Elk van deze soorten kanker en celbronnen vereist optimalisatie, die we hier delen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten die hierin werden gepresenteerd werden beoordeeld en goedgekeurd door de juiste ethische commissies aan de Universiteit van Californië, Los Angeles (UCLA). Het gebruik van gedeidentificeerde, primaire menselijke tumoren is goedgekeurd door de UCLA Institutional Review Board (Protocolnummers 17-000037, 17-001169 en 11-001363). Bij UCLA is onderzoek van het Comité voor dieronderzoek niet nodig voor experimenten met kippenembryo's; protocol goedkeuring is alleen vereist wanneer de eieren zullen worden uitgebroed. Best practices, zoals de AVMA-richtlijnen voor de euthanasie van dieren, werden echter gebruikt om kippenembryo's ethisch te behandelen en pijn zoveel mogelijk te voorkomen. Onderzoekers worden aangespoord om de toezichtvereisten bij hun instelling te verifiëren voorafgaand aan het initiëren van studies met behulp van CAM-modellen.
1. Bereiding van de eieren
- Voordat u de eieren ontvangt, moet u de eierbroedmachine assembleren tot 37,8 °C (100 °F) met een luchtvochtigheid van 60-70% volgens de instructies van de fabrikant.
OPMERKING: Om besmettingsrisico's te minimaliseren, kan autoclaved water worden gebruikt om de vochtigheid te controleren. - Bij ontvangst bevrucht, Rhode Island Rode kippeneieren van een gecertificeerd laboratorium-grade eileverancier, droog veeg het oppervlak van de schelpen met papieren handdoeken. Een licht gedempte papieren handdoek kan worden gebruikt om vastgezet materiaal te verwijderen. Droog onmiddellijk.
OPMERKING: Het natmaken van de schaal met vloeistof onder de 43,3 °C kan bacteriën in het ei brengen. Als men ervoor kiest de eieren te wassen of te desinfecteren, moet de temperatuur van de vloeistof tussen 43,3-48,9 °C liggen. Hogere temperaturen kunnen de eieren koken. De keuze van het ontsmettingsmiddel moet worden gemaakt op basis van de micro-organismen die bezorgdheid veroorzaken. - Gebruik een potlood of markering om de datum op het ei te labelen. Dit wordt beschouwd als ontwikkelingsdag 0.
- Plaats de eieren in de eierbroedmachine en broed gedurende ten minste 7 dagen met rotatie om cam-ontwikkeling mogelijk te maken. Er mag een automatische rotator worden gebruikt of de eieren mogen 180° 2-3x per dag worden gedraaid.
2. Opening van de eieren
OPMERKING: Het openen van de eieren moet worden gedaan wanneer de CAM volledig is ontwikkeld. Dit is meestal op ontwikkelingsdag 7 of 8.
- Desinfecteer een bioveiligheidskast met 70% ethanol. Op dezelfde manier desinfecteren en plaats in de bioveiligheidskast een eierrek, ei candler, marker, draadloze roterende gereedschap met een silicium carbide slijpsteen en cirkelsnijdenwiel, 18 G naald, pipet controller met kwart-inch vacuüm buizen, verpakkingstape, kantoor schaar, gebogen schaar, Semken (of iets dergelijks) tangen, katoenen ballen, en 6 x 7 cm transparante film dressing. Gebruik waar mogelijk steriele, wegwerp- of autoclaved-gereedschappen.
- Zet de eierrotator uit. Plaats ongeveer 1-3 eieren in de bioveiligheidskast op het eierrek. Terwijl in het donker, plaats het ei kandelaar tegen de eierschaal om de luchtcel te identificeren. Markeer de locatie van de luchtcel.
OPMERKING: De intensiteit van de verlichting van het ei kandelaar is cruciaal voor het visualiseren van het interieur van het ei. Als de luchtcel of vasculatuur is consequent moeilijk te zien, probeer het vervangen van de ei candler batterijen. - Verplaats het ei kandelaar over de schaal om een groot bloedvatnetwerk te vinden. Draai het ei indien nodig. Een ideale vasculatuur zal vertakken in de buurt van het midden van het ei. Gebruik een marker om over de vasculatuur te trekken om te worden gebruikt voor implantatie.
- Doe het licht in de motorkap aan. Met behulp van een draadloze roterende gereedschap uitgerust met een silicium carbide slijpsteen, boor een klein gat in de schelp direct over het midden van de luchtcel. Boor tot het grootste deel van de schaal is verwijderd, maar het witte, binnenste membraan is intact.
OPMERKING: Boren over de luchtcel voordat het richten van de vasculatuur maakt het mogelijk het bepalen van de dikte van die specifieke eierschaal over de luchtcel in plaats van over de CAM en vasculatuur. Als de CAM of vasculatuur wordt verstoord, is het ei niet bruikbaar voor implantatie. - Boor en open een ander klein gaatje waar het vaatvenster zal worden geopend zoals werd gedaan voor de luchtcel (stap 2.4).
- Met behulp van een naald van 18 G, voorzichtig doorboren van het witte, binnenste membraan over de luchtcel en vasculatuur. Als niet in staat om de schelp te penetreren, dan voorzichtig boren een beetje meer. Zorg ervoor dat het witte, binnenste membraan (maar niet de CAM) wordt verstoord in het gehele geboorde gebied. Verwijdering van het membraanstuk is niet nodig.
OPMERKING: Als de CAM of vasculatuur tijdens deze stap wordt verstoord, gooi het ei weg. Schade is duidelijk als er bloed of albumine lekt uit een geboord gat. - Doe het licht van de kap uit. Controleer met behulp van de eierkaars dat de luchtcel van het einde van het ei naar het gebied over de vasculatuur is overgebracht. Plaats indien nodig de vacuümslang die in een pipetcontroller rond het gat over de oorspronkelijke luchtcel wordt geplaatst en breng voorzichtig zuigkracht aan in korte uitbarstingen om de luchtcel te verplaatsen.
- Gebruik een markering om de nieuwe locatie van de luchtcel ongeveer 0,5 cm binnen de lucht-CAM-grens te schetsen. Breng een stuk verpakkingstape net over de nieuwe luchtcel. Gebruik indien nodig een standaard kantoorschaar om de tape op een passende grootte te knippen.
OPMERKING: Tape kan de luchtstroom door de schaal verstoren en mag niet groter zijn dan nodig is om de luchtcel volledig te bedekken. - Breng de eieren terug naar de couveuse om zonder rotatie te verwarmen met de nieuwe luchtcel naar boven gericht. Herhaal stap 2.2-2.9 voor de resterende eieren die moeten worden geopend.
LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken. Indien de kwaliteit van de CAM-ontwikkeling niet zeker is, moet een klein aantal eieren door stap 2.16 worden voortgezet voordat de resterende eieren worden geopend. - Plaats ongeveer 1-3 eieren met verplaatste luchtcellen op het eirek in de bioveiligheidskast.
OPMERKING: Er moet voor worden gezorgd dat besmetting in het geopende ei wordt voorkomen. Open daarom altijd eieren in een bioveiligheidskast en gebruik waar mogelijk steriele gereedschappen en apparatuur. - Met behulp van een draadloze roterende gereedschap uitgerust met een cirkelvormig snijwiel, snijd een kleine lijn over de luchtcel grens getrokken in stap 2.8. Zorg ervoor dat dit ongeveer 0,5 cm binnen de werkelijke lucht-CAM grens ligt om te voorkomen dat de CAM of vasculatuur wordt verstoord. Snijd volledig door de schelp, maar wees voorzichtig niet diep genoeg door te dringen om de CAM of vasculatuur te verstoren.
- Met behulp van gebogen schaar, snijd rond de resterende luchtcel om een venster in de shell te creëren.
OPMERKING: Als er bloed of membraan aanwezig is op de verwijderde schaal, is het ei niet geschikt voor implantatie. Als een groot deel van de eieren niet netjes worden geopend, overweeg dan minstens 1 extra dag te wachten om de resterende eieren te openen om een betere CAM-vorming mogelijk te maken. Als de schelpen van de resterende eieren niet zijn doorboord, moet de rotatie van de eieren in de couveuse worden hervat. - Controleer de levensvatbaarheid van het embryo. Levensvatbare embryo's tonen uitgebreide vasculatuur, duidelijke albumine, embryobeweging of een zichtbare hartslag.
- Met behulp van Semken forceps, trek kleine stukjes katoen uit een steriele katoenen bal. Dep het CAM-oppervlak voorzichtig uit om het stof en vuil van de schaal te verwijderen.
OPMERKING: Het verwijderen van vuil moet worden uitgevoerd op dezelfde dag dat de eieren worden geopend. - Bedek de shell opening met een kwart stuk van 6 x 7 cm transparante film dressing.
- Breng de eieren terug naar de couveuse. Zorg ervoor dat het ei stevig zit met het geopende raam naar boven gericht en de CAM niet aanraken van de transparante film dressing. Gebruik een stuk eirek, de rand van de ei rotator, of een ander geschikt item om alle eieren die blijven rollen prop.
- Herhaal stap 2.10-2.16 voor alle resterende eieren die moeten worden geopend.
OPMERKING: Het openen van de eieren hoeft niet te worden voltooid op dezelfde dag als implantatie. Wachten ten minste 1 dag kan helpen elimineren eieren waarvan de levensvatbaarheid werd aangetast door het openen van de shell.
3. Voorbereiding van de kankercelschorsing voor transplantatie (optie 1)
OPMERKING: Dit moet vlak voor de implantatie worden voltooid, die idealiter tussen dag 7 en 10 moet plaatsvinden. Zie notities aan het begin van stap 5 of 6 voor meer informatie over de implantatiedatum. Deze aanpak werd gebruikt voor alle cellijnen en gekweekte nierkanker tumor verteert.
- Ontdooi de extracellulaire matrixoplossing op ijs.
- Met behulp van mechanische en/of enzymatische spijsvertering, het verkrijgen van een eencellige suspensie met behulp van een methode die geschikt is voor het type cel wordt geïmplanteerd.
- Het totale aantal cellen dat moet worden geïmplanteerd opnieuw opschorten in een geschikt medium voor implantatie. Implantaten van 1-2 x 106 cellen per ei zijn typisch.
OPMERKING: Het medium dat wordt gebruikt voor de implantatie van de cellijnen is meestal het volledige medium dat wordt gebruikt voor het kweken van de cellen, met FBS of serumvervanging. De implantatie van tumordigesten maakt meestal gebruik van het volledige medium dat wordt gebruikt voor het kweken van cellijnen van hetzelfde kankertype. Indien nodig kunnen de mediumformulering echter experimenteel worden aangepast. De effecten op tumorontwikkeling en groei zouden empirisch moeten worden bepaald. - Pellet de cellen met behulp van een centrifuge snelheid en tijd die geschikt is voor de cellen worden gebruikt. Typische snelheden zijn 250-300 x g,en tijden zijn 5-10 min.
- Verwijder de supernatant uit de pelletse cellen door te besneeuwen. Mechanisch opnieuw opschorten van de cellen in het resterende medium via flicking of pipetteren. Plaats op ijs om af te koelen. Meet het volume cellen en medium met behulp van een geschikte grootte pipet.
- Bereken implantatievolumes zodanig dat 1-2 x 106 cellen worden geïmplanteerd in een volume van 20-100 μL per ei met een uiteindelijke extracellulaire matrixconcentratie van 2,7-4 mg/mL-eiwit. Voeg medium, alle gewenste groeifactoren of additieven, en extracellulaire matrix oplossing volgens deze berekening. Blijf op ijs tot klaar om te implanteren.
OPMERKING: Voor de berekeningen in de stappen 3.3 en 3.6 moet een extra volume van ten minste de helft van het eiimplantaat worden opgenomen om een voldoende volume voor alle eieren in de groep te garanderen. Voor implantatie van de eierstokkankercellijnen (d.w.z. SKOV3 en ID8) werden 106 cellen per ei geïmplanteerd. Voor implantatie van de niercelcarcinoma cellijn RENCA, gekweekte cellen afgeleid van verteerd primair menselijk niercelcareloom, prostaatkankercellijnen (d.w.z. CWR, C4-2 en MyC-CaP) en blaaskankercellijnen (d.w.z. HT-1376 en T24), werden 2 x 106 cellen geïmplanteerd.
4. Voorbereiden van tumorstukken op implantatie (optie 2)
OPMERKING: Dit moet vlak voor de implantatie worden voltooid, die idealiter tussen dag 7 en 10 moet plaatsvinden. Zie notities aan het begin van stap 5 of 6 voor meer informatie over de implantatiedatum. Primaire eierstokkanker en blaaskanker werden geïmplanteerd als tumor stukken.
- Ontdooi extracellulaire matrixoplossing op ijs. Verdun tot een uiteindelijke eiwitconcentratie van 2,7-4 mg/mL in een geschikt medium dat de gewenste groeifactoren of additieven bevat. Blijf op ijs.
OPMERKING: Implantatie van tumorstukken gebruikt meestal het volledige medium dat wordt gebruikt voor het kweken van cellijnen van hetzelfde kankertype. Echter, aanpassingen aan de medium formulering kan worden gedaan indien nodig experimenteel. De effecten op tumorengraftment en groei zouden empirisch moeten worden bepaald. - Met behulp van een scalpel of schaar, accijns stukken van de verse tumor. Ideale maten variëren van 2-5 mm aan elke kant. Houd weefsels ondergedompeld in het medium tot ze klaar zijn om te implanteren.
5. Implantatie met behulp van een antiaanbakring (optie 1)
OPMERKING: Cellen kunnen worden geïmplanteerd vanaf ontwikkelingsdag 7 als de CAM volledig is ontwikkeld. Implantatie kan optreden op elk moment voorafgaand aan het uitkomen dat voldoende tijd voor tumorontwikkeling en het gewenste experiment mogelijk maakt, maar merk op dat het embryo immuuncellen beginnen aanwezig te zijn rond dag 10 postbevruchting27. Tumor groei percentage varieert aanzienlijk per cel type en moet empirisch worden bepaald voor de cel type rente. De eierstokkanker en de prostaatkankercellen werden geïmplanteerd met behulp van de nonstick ring methode. Houd er rekening mee dat wanneer een antiaanstokring niet beschikbaar is, een pipettip kan worden gesneden op een vergelijkbare grootte en gebruikt.
- Gebruik 70% ethanol om een bioveiligheidskast en alle benodigde gereedschappen te desinfecteren: een eierrek, gebogen iristangen, antiaanbakringen (1/4 inch binnendiameter), glazen roerstaaf, geschikte volumebuizen en -tips, 6 x 7 cm transparante foliedressing, kantoorschaar en marker of potlood. Waar mogelijk moeten steriele, wegwerp- of autoclaved-gereedschappen worden gebruikt.
- Plaats eieren die op een eierrek moeten worden geïmplanteerd in een bioveiligheidskast. Selecteer een beheersbaar aantal eieren. Tot zes is typisch. Vermijd het toestaan van de eieren om aanzienlijk af te koelen tijdens het werken met hen.
- Verwijder transparante filmdressing van de schaal door de randen naar het open raam te rollen om te voorkomen dat stukken shell wegtrekken. Controleer of de eieren levensvatbaar en gezond zijn. Ideale eieren hebben een groot vat in het midden van het geopende gebied met kleinere schepen vertakking van het.
- Met behulp van gebogen iris tangen, plaats een steriele, nonstick ring op de CAM over het schip, idealiter over een tak punt. Gebruik een steriele glazen roerstaaf om de CAM voorzichtig te schuren.
- Pipet de cel vering van stap 3.6 in het midden van de antiaanbakring. U ook tangen gebruiken om een tumorstuk van stap 4.2 in het midden van de nonstickring te plaatsen en te bedekken met 20-50 μL van de extracellulaire matrixoplossing gegenereerd in stap 4.1.
- Sluit de opening af met een kwart stuk van 6 x 7 cm transparante filmdressing. Label de eieren met een passende implantaataanduiding.
OPMERKING: Het nummeren van de eieren binnen een groep vergemakkelijkt longitudinale waarnemingen. - Breng het ei terug naar de couveuse. Zorg ervoor dat de opening van de schaal rechtop zit en dat het ei veilig is.
LET OP: Eieren kunnen zonder rotatie worden teruggebracht naar een eierbroedmachine. Als alternatief kan een hoge postimplant levensvatbaarheid worden verkregen met behulp van een 37-38 °C cel incubator met de CO2 gedeactiveerd en een hygrometer om de luchtvochtigheid te controleren, die moet worden 50%-80%.
6. Implantatie zonder antiaanbakring (optie 2)
OPMERKING: Cellen kunnen worden geïmplanteerd vanaf ontwikkelingsdag 7 als de CAM volledig is ontwikkeld. Implantatie kan optreden op elk moment voorafgaand aan het uitkomen dat voldoende tijd voor tumorontwikkeling en het gewenste experiment mogelijk maakt, maar merk op dat het embryo immuuncellen beginnen aanwezig te zijn rond dag 10 postbevruchting27. Deze methode werd gebruikt voor het implanteren van de niercel carcinoma cellen en de blaas kankercellen.
- Gebruik 70% ethanol om een bioveiligheidskast en alle benodigde gereedschappen te desinfecteren: geschikte volumebuizen en -tips, steriele weefselkweekschotels van 10 cm, eirek, 6 x 7 cm transparante filmdressing, kantoorschaar en marker.
- Aanzuigen een inentingsvolume van de celvering gegenereerd in stap 3.6 in een geschikt formaat pipet tip (200 μL is typisch). Terwijl u het bovenste gedeelte van de punt vasthoudt, werpt u de pipettip voorzichtig uit en plaats horizontaal in een steriele weefselkweekschaal van 10 cm.
- Herhaal stap 6.2 voor alle monsters binnen een groep met één gerecht voor elke groep.
- Plaats tips in een 37 °C incubator voor 15-30 min om de extracellulaire matrix gedeeltelijk te polymeriseren.
- Na 15 min incubatie, beginnen met het controleren op polymerisatie. Een kleine hoeveelheid vloeistof lekt meestal uit de punt wanneer geplaatst op de schotel. Polymerisatie van deze vloeistof kan worden gebruikt om de omvang van de polymerisatie van de vloeistof in de tip te schatten.
- Plaats de te implanteren eieren op een eierrek in een bioveiligheidskast. Selecteer een beheersbaar aantal eieren. Tot zes is typisch. Vermijd het toestaan van de eieren om aanzienlijk af te koelen tijdens het werken met hen.
- Verwijder de transparante foliedressing van de schaal door de randen naar het open raam te rollen. Dit voorkomt het wegtrekken van stukken van shell.
- Controleer of de eieren levensvatbaar en gezond zijn. Ideale eieren hebben een groot vat in het midden van het geopende gebied met kleinere schepen vertakking van het.
- Plaats een pipet tip op een geschikt formaat pipet. Druk de zuiger om de gedeeltelijk gepolymeriseerde celvering op de CAM te dwingen over een groot, goed ontwikkeld vat, idealiter over een takpunt.
- Sluit de opening af met een kwart stuk van 6 x 7 cm transparante filmdressing.
- Label het ei met een passende implantaataanduiding.
OPMERKING: Het nummeren van de eieren binnen een groep vergemakkelijkt longitudinale waarnemingen. - Breng het ei terug naar de couveuse. Zorg ervoor dat de opening van de schaal rechtop zit en dat het ei veilig is.
LET OP: Eieren kunnen zonder rotatie worden teruggebracht naar een speciale eierbroedmachine. Als alternatief kan een hoge postimplant levensvatbaarheid worden verkregen met behulp van een 37-38 °C cel incubator met de CO2 gedeactiveerd en een hygrometer om de luchtvochtigheid te controleren, die moet worden 50%-80%.
7. Bioluminescentie beeldvorming van firefly luciferase gemarkeerde tumoren
OPMERKING: Als de geïmplanteerde cellen stabiel werden trans-transduced met het gen coderen firefly luciferase of andere beeldvormingfactoren, dan kunnen de resulterende tumoren worden gevisualiseerd met behulp van bioluminescentie beeldvorming. Fluorescentie beeldvorming wordt niet aanbevolen op intacte eieren als gevolg van een hoge achtergrond van de eierschaal. Dit is endpoint analyse, als de opening van de shell drastisch vermindert de overleving. Tumoren kunnen worden afgebeeld op elk gewenst moment dat geschikt is voor experimentele behoeften en de snelheid van de tumorgroei. Echter, gemiddeld, eieren uitkomen 21 dagen postbevruchting. Daarom is ontwikkelingsdag 18 een geschikt eindpunt om ongewenst uitkomen te voorkomen.
- Breng indien nodig eieren naar de beeldvormingsfaciliteit. Plak eieren op weefselkweekgerechten van 10 cm. Breng ze terug naar een eierbroedmachine van 37,8 °C (100 °F) met het rotatiemechanisme verwijderd of gedeactiveerd. Vochtigheid is niet cruciaal voor transport en beeldvorming.
- Met behulp van gebogen iristangen duwt u de CAM voorzichtig weg van de schaal totdat de CAM gelijk is met het albumine en embryo. Met behulp van breed getipt eitje forceps, los stukken van de shell om de shell opening voldoende uit te breiden voor tumor visualisatie.
- Injecteer minimaal 50 μL van 30 mg/mL D-luciferinin in het eialbumine. Een vergelijkbaar volume van D-luciferine kan ook worden gepipettttineerd in de antiaanbakring of op het oppervlak van de CAM in het gebied dat de geïmplanteerde cellen bevat. Dit zorgt voor een optimale bioluminescentie bij afwezigheid van een ideale vasculaire toevoer. Incubeer voor 8 min.
- Injecteer 20-50 μL isoflurane in de albumine van het ei om het ei te verdoven. Incubeer voor nog eens 2 min. Als alternatief kan het ei worden geplaatst in een inductiekamer met 2-2,5% verdampte isoflurane. Adequate anesthesiediepte wordt verkregen wanneer embryonale beweging ophoudt.
OPMERKING: Grotere hoeveelheden isoflurane (100 μL) kunnen worden gebruikt om het ei te euthanaseren. - Plaats eieren in een bioluminescentie-inrichting en -afbeelding met behulp van de juiste instellingen zoals bepaald door de instructies van de fabrikant. Voor deze studie werd een blootstellingstijd van 1 min gebruikt.
- Om de resterende CAM en embryo in beeld te brengen, opent u het ei in een weefselkweekschaal van 10 cm.
- Pak het ei met de vingers van beide handen aan de onderkant van het ei in de buurt van het midden van het ei en de duimen aan weerszijden van de shell opening.
- Trek voorzichtig de twee helften van het ei uit elkaar met de duimen terwijl u zachtjes met de vingers in het ei drukt.
- Wanneer de schaal ongeveer half gescheiden is van de CAM en het embryo, draai het ei ondersteboven over een weefselkweekschaal van 10 cm.
- Blijf de shell helften scheiden. Als de CAM aan de binnenkant van de schaal kleeft, gebruikt u de vingers voorzichtig om de CAM van de schaal weg te duwen.
- Het embryo kan indien gewenst in een andere schotel worden omgedraaid.
- Indien nodig kan aanvullende isoflurane worden toegediend als in stap 7.4.
8. Tumor oogsten
OPMERKING: Tumoren kunnen worden geoogst op elk moment dat geschikt is voor de experimentele behoeften en de snelheid van de tumorgroei. Echter, gemiddeld, eieren uitkomen 21 dagen postbevruchting. Daarom is ontwikkelingsdag 18 een geschikt eindpunt om ongewenst uitkomen te voorkomen.
- Grijp tumor met tangen. Met behulp van een schaar (veer iris schaar goed werken) of een scalpel, zorgvuldig accijns tumor van CAM.
- Als de tumor is trans-transduced met de firefly luciferase gen, reimaging kan worden uitgevoerd om succesvolle verwijdering van moeilijk te visualiseren tumoren te verifiëren.
OPMERKING: Accijnstumoren kunnen worden geanalyseerd door elke methode die geschikt is voor een bepaald experiment. Tumoren kunnen ook opnieuw worden geïmplanteerd in CAM of muizen. Om de tumoridentiteit te bevestigen, kunnen tumoren worden gefixeerd, paraffine ingebed en onderzocht met hematoxyline en eosine of immunohistochemische vlekken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tot nu toe hebben we deze methode van implantatie succesvol gevonden voor eierstokkanker, nier-, prostaat- en blaaskanker. Elk werd geoptimaliseerd om specifieke voorwaarden voor implantatie te identificeren, hoewel er flexibiliteit kan zijn. Van de geteste tumortypes was de groei van eierstokkanker veel minder uitgesproken en meestal niet zichtbaar zonder de hulp van bioluminescentiebeeldvorming(figuur 1). Echter, een versteviging van de CAM kan worden gevoeld met tangen op het gebied van implantatie. Dit kan helpen bij het identificeren van mogelijke tumorgroei bij afwezigheid van bioluminescentiebeeldvorming, hoewel verdere validatie nodig zou zijn via histologie of een andere geschikte methode. We bereikten een succesvolle engraftment van zowel menselijke als murine cellijnen die morfologieën vertonen die overeenkomen met die in andere in vivo modellen(figuur 1A en 1B). Bovendien was de implantatie van tumorstukken mogelijk(figuur 1C, blauwe pijl geeft tumor aan). De geïmplanteerde tumor kwam in dit geval van een patiënt met hoogwaardige, uitgezaaide, ovariële sereuze carcinoma. De resulterende tumoren leken morfologisch op hun tumoren van oorsprong en drukten mensspecifieke eiwitten uit, zoals cytokeratine 8/18, die gemakkelijk hun differentiatie van CAM- en kipembryonale weefsels mogelijk maken.
Bij het optimaliseren van tumorengraftment en groei kunnen op het moment van implantatie passende groeifactoren of hormonen worden toegevoegd. Zo werd een subtiele, niet-significante toename van de tumorgrootte (gemeten aan de basis van de totale stralingsflux) waargenomen in ID8-cellen wanneer deze werden aangevuld met drie eenheden (U) van menselijk follikelstimulerend hormoon (FSH) op het moment van implantatie(figuur 1D). De selectie van FSH voor de groei van eierstokkanker kwam voort uit de expressie van de FSH-receptor in ID8-cellen en de hoge niveaus van FSH die meestal worden aangetroffen bij postmenopauzale vrouwen, die de meerderheid van de gevallen van eierstokkanker vormen. Soortgelijke benaderingen kunnen worden aangenomen voor andere moeilijk te kweken kankertypes om het nut van het CAM-model te verbeteren. Bovendien werd FSH alleen toegevoegd op het moment van celimplantatie. Het aanvullen van de groeifactor of het hormoon kan worden bereikt door een passende hoeveelheid van het additief in het medium met de juiste intervallen in de antiaanbakring te bestoken, wat het effect zou kunnen verbeteren.
Voor nierkanker produceerde implantatie van 2 x 106 duidelijke celniercelcarcinomcellen uit gevestigde cellijnen, zoals RENCA, snelle, robuuste tumorvorming, hoewel lagere celdoses ook kunnen worden gebruikt(figuur 2A, 10 dagen na implantatie). Resulterende tumoren morfologisch leek op die verkregen door middel van standaard muis in vivo modellen28. Implantatie van RENCA cellen gemarkeerd met firefly luciferase toegestaan bioluminescentie beeldvorming. Primaire menselijke tumoren kunnen ook worden geïmplanteerd. De stukjes tumor bleven bestaan en rekruteerden vasculatuur zonder significante groei te laten zien. De implantatie van verteerde cellen afkomstig van een primair, duidelijk celniercellinoom dat in vitro werd uitgebreid, groeide echter op dezelfde manier als de gevestigde cellijnen (figuur 2B). Renal cell carcinoma cellen kunnen worden gezaaid met behulp van ofwel de nonstick ring methode of de methode zonder de nonstick ring.
Meerdere menselijke en murine prostaatkanker cellijnen werden getest op CAM engraftment(Figuur 3). Elk groeide goed toen 2 x 106 cellen werden geïmplanteerd met behulp van de nonstick ring. Histologische evaluatie van de resulterende tumoren was in overeenstemming met de verwachtingen voor elke cellijn. Bovendien, implantatie van cellen stabiel gemarkeerd met firefly luciferase toegestaan tumor identificatie met bioluminescentie beeldvorming(figuur 3A).
Blaaskanker werd vastgesteld in het CAM-model van gevestigde cellijnen en stukken primair menselijk weefsel(figuur 4). Cellijnen groeiden goed toen ze werden geïmplanteerd met 2 x 106 cellen zonder de nonstick ring(figuur 4A en 4B),hoewel implantatie met de ring succesvol was. Primaire menselijke tumor kan worden geïmplanteerd uit stukjes weefsel(figuur 4C). Het gepresenteerde geval is afkomstig van een patiënt met een hoge kwaliteit, niet-spier-invasieve, urotheliale carcinoma. Implantatie van verteerde cellen is nog niet geprobeerd als gevolg van voortdurende tumor spijsvertering optimalisatie. Kankercellen van de resulterende CAM tumoren behield de morfologie van de oorspronkelijke tumor, maar met een veranderde stromal component. Tumorgroei was minder dan voor niercelcareloom en prostaatkanker, hoewel nog steeds gemakkelijk zichtbaar.
Om een groot aantal levensvatbare, testbare eieren aan het eindpunt te garanderen, moet bij het broeden en openen van de eieren worden gezorgd. Als de couveuseomstandigheden voor of na de implantatie suboptimaal zijn, kan de levensvatbaarheid van embryo's in het gedrang komen. Als er significante embryonale sterfte optreedt, lost de couveuseomstandigheden op volgens de instructies van de fabrikant. In onze ervaring lijken temperatuur- en vochtigheidsstabiliteit belangrijker te zijn dan hun exacte waarden. Daarom vonden we dat het uitbroeden van de ingeënte eieren in een gemodificeerde, cel-cultuur, CO2 incubator bereikt superieure levensvatbaarheid dan het behoud van de eieren in kleine, toegewijde ei incubators die vaker openen nodig om het water dat de vochtigheid controles aan te vullen. Het minimaliseren van de frequentie waarmee de ingeënte eieren worden verwijderd voor tumoronderzoek kan ook de levensvatbaarheid van het embryo verbeteren.
Een bijkomende zorg van CAM-implantatie is de integriteit van de CAM bij inenting. Als de CAM niet intact is na het openen van de schaal, dan zullen de antiaanbakring en geïmplanteerde cellen in het albumine van het embryo zinken (zie de noot na stap 2.12). Dit veroorzaakt kankercelverspreiding. Sommige tumoren kunnen zich nog steeds vormen, maar kankers die aanzienlijke groei en overleving signaal ontvangen van naburige kankercellen, zoals eierstokkanker, zal niet betrouwbaar vormen tumoren onder dergelijke omstandigheden. Als antiaanbakringen worden gebruikt voor implantatie, kan het falen van de CAM worden geïdentificeerd door het zinken van de ring in de albumine. Dit moet worden onderscheiden van gevallen waarin de ring en geïmplanteerde cellen door embryonale beweging naar de bodem van het ei zijn verplaatst. In die gevallen zal de ring worden gevonden tussen de CAM en de onderkant van de shell. Embryonale beweging kan niet worden gecontroleerd. Ringplaatsing kan het echter moeilijker maken voor het embryo om de geïmplanteerde cellen te verstoren. Ringen geplaatst aan de randen van de luchtzak gegenereerd in stap 2.7 hebben meer kans om te worden verplaatst door het embryo dan die geplaatst in het midden van het veld.
Figuur 1: Representatieve tumorontwikkeling van eierstokkanker. Met succes geïmplanteerde eierstokcellen zijn: (A) de menselijke SKOV3-cellijn, (B) de murine ID8-cellijn en (C) primaire tumoren. Representatieve hematoxyline en eosine kleuring wordt gepresenteerd samen met bioluminescentie beeldvorming, naar gelang van het geval. Voor de CAM-tumor als gevolg van de implantatie van een primair tumorstuk(C)zijn hematoxyline- en eosinevlekken van zowel de CAM-tumor als de primaire tumor opgenomen, samen met cytokeratine 8/18 (CK 8/18) kleuring van de resulterende CAM-tumor. De blauwe pijl in het eerste paneel geeft de tumor aan. (D) Tumorgrootte van ID8-implantaten met en zonder 3U FSH, berekend als de totale flux als gevolg van bioluminescentiebeeldvorming (n = 3 voor onbehandeld en n = 4 voor FSH-aangevuld). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Representatieve tumorontwikkeling van helder celniercelleunoom. Tumoren als gevolg van implantatie van (A) de murine niercel carcinoma cellijn, RENCA, of (B) gekweekte cellen afgeleid van een verteerd menselijke primaire tumor. De meetschaal naast de uitgesneden tumor in(B)toont 1 mm markeringen. Overeenkomstige histologie in (A) en (B) toont hematoxyline en eosine kleuring. In (A), wordt ook de representatieve bioluminescentiebeeldvorming van firefly-luciferase-gemarkeerde RENCA-cellen getoond. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Representatieve tumorontwikkeling van prostaatkankercellijnen. Representatieve tumoren en hematoxyline en eosine kleuring als gevolg van de implantatie van de menselijke prostaatkanker cellijnen (A) CWR en (B) C4-2 samen met de murine cellijn (C) MyC-CaP. Bioluminescentie beeldvorming van de resulterende tumoren van firefly luciferase gemarkeerde CWR cellen wordt getoond in (A). De meetschaal naast de uitgesneden tumoren toont 1 mm markeringen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Representatieve tumorontwikkeling door blaaskanker. Representatieve tumoren als gevolg van de implantatie van de gevestigde menselijke blaaskanker cellijnen (A) HT-1376, (B) T24, en (C) primaire menselijke blaastumor. In (C),hematoxyline en eosine kleuring van de resulterende CAM tumor en de primaire tumor worden getoond. De meetschaal naast de uitgesneden tumoren toont 1 mm markeringen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tumorexpansie en -engraftment met behulp van het CAM-model maakt een snellere en direct waarneembare tumorgroei mogelijk dan bestaande in vivo diermodellen. Bovendien zijn de kosten aanzienlijk lager zodra de eerste aankoop van apparatuur is voltooid, vooral in vergelijking met de kosten van immuungecompromitteerde muizen. De eerste, immuungecompromitteerde toestand van kippenembryo's maakt het gemakkelijk mogelijk engraftment van menselijk en murineweefsel. Zelfs met deze sterke punten heeft het CAM-model beperkingen. De korte tijd die een voordeel kan zijn, kan ook ten koste gaan als langdurige behandelingsstudies gerechtvaardigd zijn. De immunogecompromitteerde/immuuntolerante status van het CAM-model kan studies van tumor-immuuninteracties bemoeilijken. Voor deze studies kan coimplantatie van immuuncellen van belang nodig zijn, eventueel met aanvulling van het immuunsysteem compartiment. Bovendien, hoewel alle tumortypes die we engraft in het CAM-model presenteerden, doen ze dat met verschillende mate van groei. Bijvoorbeeld, niercelcareloom vormt snel grote tumoren, maar eierstokkanker tumoren zijn moeilijk te visualiseren zonder de hulp van bioluminescentie beeldvorming. Tumorgroei en snelheid zouden moeten worden beoordeeld voor een bepaald tumortype om te bepalen of de CAM een geschikt experimenteel model zou zijn.
Succesvolle tumor engraftment vereist de zorgvuldige voltooiing van specifieke stappen van het protocol. Ten eerste moeten eieren onder ideale omstandigheden worden geïncubeerd om een optimale embryooverleving en CAM-vorming te hebben voorafgaand aan de engraftment. Vanwege de natuurlijke variabiliteit in batches, raden we aan om overtollige eieren te verkrijgen bij de specifieke eierleverancier. We hebben ook ontdekt dat koeler, regenachtiger weer kan leiden tot schimmelgroei in de eieren. Tijdens natter weer, meer eieren kunnen nodig zijn om te worden geënt om voldoende opbrengsten te verkrijgen op het eindpunt. Deze seizoensvariatie zal waarschijnlijk regiospecifiek zijn. Adequate CAM vorming is essentieel voor een succesvolle tumor engraftment. Eventuele aanwijzingen van de CAM die bij het openen aan de schaal blijven bevestigd, mogen niet worden genegeerd. Als meerdere eieren geen intacte CAM hebben bij het openen van de eerste batch, raden we aan de opening van de resterende eieren minstens 1 extra dag uit te stellen.
Als een slechte levensvatbaarheid of engraftment worden verkregen, kunnen verschillende stappen in gebreke zijn. Ten eerste kan de levensvatbaarheid van het embryo van de leverancier slecht zijn. Afwezigheid van een luchtcel en zichtbare vasculatuur duidt op een niet-levensvatbare ei. Soms kan embryobeweging worden gevisualiseerd om de levensvatbaarheid te bevestigen. Zorg er echter eerst voor dat verse batterijen in het ei kaarsje zitten, omdat er een sterk licht nodig is voor visualisatie. De float test kan ook worden gedaan om de levensvatbaarheid te beoordelen (een verscheidenheid aan instructies en video's zijn online beschikbaar). Een andere mogelijke verklaring voor slechte levensvatbaarheid is de incubator. Zorg er met behulp van een onafhankelijke hygrometer en thermometer voor dat de instellingen nauwkeurig en stabiel zijn. De instructies van de fabrikant voor de incubator moeten gedetailleerde instructies voor het oplossen van problemen bevatten om de juiste instellingen te beoordelen. Onjuiste incubator-instellingen kunnen ook cam-ontwikkeling in gevaar brengen. Met behulp van tape en / of een marker, bepalen of het ei rotator is eigenlijk spinnen de eieren. Als antiaanhoudende ringen in albumin in een hoog aandeel van de engrafted eieren dalen, dan ontwikkelde cam zich niet voldoende. Ten slotte hebben we geconstateerd dat frequente controle van het geënte ei, wat leidt tot temperatuur- en vochtigheidsschommelingen, de levensvatbaarheid van postimplant kan verminderen. Als geïmplanteerde eieren in eerste instantie levensvatbaar zijn, maar de levensvatbaarheid tijdens de entingsperiode afneemt, moeten de eieren minder vaak worden gecontroleerd. Deze afname van de levensvatbaarheid kan ook te wijten zijn aan onjuiste of ongepaste incubator-instellingen na implantatie.
Bij het optimaliseren van deze methode voor een nieuw celtype kunnen verschillende factoren worden gecontroleerd. De eerste is het celnummer. We implanteren meestal 5 x 105-2 x 106 cellen uit cellijnen. Geïmplanteerde tumor stukken zijn meestal 2-5 mm aan elke kant. Deze bedragen kunnen worden aangepast om de engraftment of grootte te verbeteren. We hebben echter vastgesteld dat tumorgroei afneemt boven een bepaalde drempel, die afhankelijk is van het celtype. Aanvullende engraftment parameters omvatten de aanwezigheid of afwezigheid van een nonstick ring. Deze keuze wordt meestal gemaakt op basis van de vraag of de ring de eindpuntanalyse zal belemmeren, hoewel deze ook van invloed kan zijn op succesvolle engraftment. De aanwezigheid van de antiaanbakring kan ook toestaan dat de ontluikende graft met medium met de gewenste intervallen om de overleving te verbeteren voorafgaand aan vasculaire werving, indien gewenst. De keuze van extracellulaire matrix type, concentratie, en medium waarin de matrix wordt verdund kan ook invloed hebben op engraftment. De toevoeging van groeifactoren of hormonen kan verder verbeteren tumor te nemen tarief of grootte. De selectie van additieven en concentraties zou moeten worden gedaan op basis van wat geschikt zou zijn voor het specifieke celtype en niet interfereren met het experiment. Deze zouden ook het potentieel hebben om met tussenpozen worden aangevuld als een nonstickring wordt gebruikt.
Toekomstige toepassingen van dit modelsysteem zijn afhankelijk van de te testen hypothese. Deze tumorgrafts kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt om nieuwe therapeutische benaderingen te testen om de tumorgrootte te verminderen of een subpopulatie van de tumor uit te putten. Co-implantatie met cellen uit de microomgeving van de gastheertumor kan studies van de invloed van deze cellen op een verscheidenheid van parameters, met inbegrip van tumorgroei en behandelingsweerstand toelaten. Dit model kan ook dienen als een kans om geleidelijk uit te breiden primaire menselijke tumoren voorafgaand aan de oprichting van xenografts in immunogecompromitteerde diermodellen. De eerste aanpassing aan CAM engraftment zou misschien tumor take rate in murine modellen te vergemakkelijken. Deze toepassingen moeten nog worden getest, maar rechtvaardigen verdere verkenning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen Dr. Fuyuhiko Tamanoi en Binh Vu bedanken voor de initiële training over deze methode. Discussies met Dr Eva Koziolek zijn instrumenteel geweest in het optimaliseren van deze aanpak en zijn zeer gewaardeerd. Dit werk zou niet mogelijk zijn geweest zonder financiering uit de volgende bronnen: de Tabak-Gerelateerde Ziekte Research Program Postdoctoral Fellowship (27FT-0023, ACS), het Ministerie van Defensie (DoD) Ovarian Cancer Research Program (W81XWH-17-1-0160), NCI / NIH (1R21CA216770), Tabak-Gerelateerde Ziekte Research Program High Impact Pilot Award (27IR-0016), en institutionele UCLA ondersteuning, waaronder een JCCC Seed Grant (NCI/NIH P30CA016042) en een 3R Grant van Office of the Vice Chancellor for Research aan LW.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| -010 Teflon (PTFE) White 55 Duro Shore D O-Rings | The O-Ring Store | TEF010 | Nonstick ring for cell seeding. 1/4"ID X 3/8"OD X 1/16"CS Polytetrafluoroethylene (PTFE). |
| C4-2 | ATCC | CRL-3314 | Human prostate cancer cell line. |
| CWR22Rv1 | CWR cells were the kind gift of Dr. David Agus (Keck Medicine of University of Southern California) | ||
| Cytokeratin 8/18 Antibody (C-51) | Novus Biologicals | NBP2-44929-0.02mg | Used at a dilution of 1:100 for immunohistochemical analysis of human ovarian CAM tumors. |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Goldbio | LUCK-1G | |
| Delicate Operating Scissors; Curved; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4-3/4 in. Overall Length | Roboz Surgical | RS6703 | This is provided as an example. Any similar curved scissors would work as well. |
| Dremel 8050-N/18 Micro 8V Max Tool Kit | Dremel | 8050-N/18 | This kit contains all necessary tools. |
| Fertilized chicken eggs (Rhode Island Red - Brown, Lab Grade) | AA Lab Eggs Inc. | N/A | A local egg supplier would need to be identified, as this supplier only delivers regionally. |
| HT-1376 | ATCC | CRL-1472 | Human bladder cancer cell line. |
| Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit | Incubator Warehouse | HB1588D-NONE-1102-1588-1357 | Other egg incubators may be used, but their reliability would need to be verified. After implantation, a cell incubator with the CO2 disabled may also be used. |
| ID8 | Not commercially available, please see PMID: 10753190. | ||
| Incu-Bright Cool Light Egg Candler | Incubator Warehouse | 1102 | Other candlers may be used; however, this is preferred among those that we have tested. This candler is included in the aforementioned incubator kit. |
| Iris Forceps, 10cm, Curved, Serrated, 0.8mm tips | World Precision Instrument | 15915 | This is provided as an example. Any similar curved forceps would work as well. Multiple brands have been used for this method. |
| Isoflurane | Clipper Distributing | 0010250 | |
| IVIS Lumina II In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | ||
| Matrigel Membrane Matrix HC; LDEV-Free | Corning | 354248 | Extracellular matrix solution |
| MyC-CaP | ATCC | CRL-3255 | Murine prostate cancer cell line. |
| Portable Pipet-Aid XP Pipette Controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | Any similar pipet controller would be appropriate. |
| PrecisionGlide Hypodermic Needles | BD | 305196 | This is provided as an example. Any 18G needle would work similarly. |
| RENCA | ATCC | CRL-2947 | |
| Semken Forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | This is provided as an example. Any similar forceps or another style that suits researcher preference would be appropriate. |
| SKOV3 | ATCC | HTB-77 | Human ovarian cancer cell line. |
| Specimen forceps | Electron Microscopy Sciences | 72914 | This is provided as an example. The forceps used for pulling away the shell for bioluminescence imaging are approximately 12.8 cm long with 3 mm-wide tips. |
| Sterile Cotton Balls | Fisherbrand | 22-456-885 | This is provided as an example. Any sterile cotton balls would suffice. |
| Stirring Rods with Rubber Policeman; 5mm diameter, 6 in. length | United Scientific Supplies | GRPL06 | This is provided as an example. Any similar glass stir rods would work as well. |
| T24 | ATCC | HTB-4 | Human bladder cancer cell line. |
| Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4" | Moore Medical | 21272 | |
| Tissue Culture Dishes, 10 cm diameter | Corning | 353803 | This is provided as an example. Any similar, sterile 10-cm dish may be used. Tissue culture treatment is not necessary. |
| Tygon Clear Laboratory Tubing - 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 feet) | Tygon | AACUN017 | This is provided as an example. Any similarly sized tubing would work as well. |
References
- Kersten, K., de Visser, K. E., van Miltenburg, M. H., Jonkers, J. Genetically engineered mouse models in oncology research and cancer medicine. EMBO Molecular Medicine. 9 (2), 137-153 (2017).
- Jackson, S. J., Thomas, G. J. Human tissue models in cancer research: looking beyond the mouse. Disease Models & Mechanisms. 10 (8), 939-942 (2017).
- Cheon, D. J., Orsulic, S. Mouse Models of Cancer. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 6 (1), 95-119 (2011).
- Howlader, N., et al. SEER Cancer Statistics Review, 1975-2016. , National Cancer Institute. Bethesda, MD. https://seer.cancer.gov/csr/1975_2016/ (2018).
- Ribatti, D. Chicken chorioallantoic membrane angiogenesis model. Methods Molecular Biology. 843, 47-57 (2012).
- Nowak-Sliwinska, P., Segura, T., Iruela-Arispe, M. L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
- Lokman, N. A., Elder, A. S., Ricciardelli, C., Oehler, M. K. Chick chorioallantoic membrane (CAM) assay as an in vivo model to study the effect of newly identified molecules on ovarian cancer invasion and metastasis. International Journal of Molecular Science. 13 (8), 9959-9970 (2012).
- Xiao, X., et al. Chick Chorioallantoic Membrane Assay: A 3D Animal Model for Study of Human Nasopharyngeal Carcinoma. PLoS ONE. 10 (6), e0130935 (2015).
- Deryugina, E. I., Quigley, J. P. Chick embryo chorioallantoic membrane model systems to study and visualize human tumor cell metastasis. Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1119-1130 (2008).
- Shoin, K., et al. Chick Embryo Assay as Chemosensitivity Test for Malignant Glioma. Japanese Journal of Cancer Research. 82 (10), 1165-1170 (1991).
- Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102 (5), 1643-1648 (2005).
- Kavaliauskaitė, D., et al. The Effect of Sodium Valproate on the Glioblastoma U87 Cell Line Tumor Development on the Chicken Embryo Chorioallantoic Membrane and on EZH2 and p53 Expression. BioMed Research International. 2017, 12 (2017).
- Liu, M., et al. The Histone Methyltransferase EZH2 Mediates Tumor Progression on the Chick Chorioallantoic Membrane Assay, a Novel Model of Head and Neck Squamous Cell Carcinoma. Translational Oncology. 6 (3), 273-281 (2013).
- Rudy, S. F., et al. In vivo Wnt pathway inhibition of human squamous cell carcinoma growth and metastasis in the chick chorioallantoic model. Journal of Otolaryngology - Head & Neck Surgery. 45 (1), 26 (2016).
- Canale, S., et al. Interleukin-27 inhibits pediatric B-acute lymphoblastic leukemia cell spreading in a preclinical model. Leukemia. 25, 1815 (2011).
- Loos, C., et al. Amino-functionalized nanoparticles as inhibitors of mTOR and inducers of cell cycle arrest in leukemia cells. Biomaterials. 35 (6), 1944-1953 (2014).
- Rovithi, M., et al. Development of bioluminescent chick chorioallantoic membrane (CAM) models for primary pancreatic cancer cells: a platform for drug testing. Scientific Reports. 7, 44686 (2017).
- Majerník, M., et al. Novel Insights into the Effect of Hyperforin and Photodynamic Therapy with Hypericin on Chosen Angiogenic Factors in Colorectal Micro-Tumors Created on Chorioallantoic Membrane. International Journal of Molecular Science. 20 (12), 3004 (2019).
- Swadi, R., et al. Optimising the chick chorioallantoic membrane xenograft model of neuroblastoma for drug delivery. BMC Cancer. 18 (1), 28 (2018).
- Klingenberg, M., Becker, J., Eberth, S., Kube, D., Wilting, J. The chick chorioallantoic membrane as an in vivo xenograft model for Burkitt lymphoma. BMC Cancer. 14 (1), 339 (2014).
- Avram, S., et al. Standardization of A375 human melanoma models on chicken embryo chorioallantoic membrane and Balb/c nude mice. Oncology Reports. 38 (1), 89-99 (2017).
- Zabielska-Koczywas, K., et al. 3D chick embryo chorioallantoic membrane model as an in vivo model to study morphological and histopathological features of feline fibrosarcomas. BMC Veterinary Research. 13 (1), 201 (2017).
- Skowron, M. A., et al. Applying the chicken embryo chorioallantoic membrane assay to study treatment approaches in urothelial carcinoma. Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations. 35 (9), e511-e523 (2017).
- Jefferies, B., et al. Non-invasive imaging of engineered human tumors in the living chicken embryo. Scientific Reports. 7 (1), 4991 (2017).
- Taizi, M., Deutsch, V. R., Leitner, A., Ohana, A., Goldstein, R. S. A novel and rapid in vivo system for testing therapeutics on human leukemias. Experimental Hematology. 34 (12), 1698-1708 (2006).
- Strojnik, T., Kavalar, R., Barone, T. A., Plunkett, R. J. Experimental model and immunohistochemical comparison of U87 human glioblastoma cell xenografts on the chicken chorioallantoic membrane and in rat brains. Anticancer Research. 30 (12), 4851-4860 (2010).
- Ribatti, D. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for tumor biology. Experimental Cell Research. 328 (2), 314-324 (2014).
- Hu, J., et al. A Non-integrating Lentiviral Approach Overcomes Cas9-Induced Immune Rejection to Establish an Immunocompetent Metastatic Renal Cancer Model. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 9, 203-210 (2018).
