Summary
Vi præsenterer kylling chorioallantoic membran model som en alternativ, transplanterbar, in vivo model for engraftment af gynækologiske og urologiske kræft cellelinjer og patient-afledte tumorer.
Abstract
Musemodeller er benchmarktest for in vivo kræft undersøgelser. Men, omkostninger, tid og etiske overvejelser har ført til opfordringer til alternative in vivo kræftmodeller. Kylling chorioallantoic membran (CAM) model giver en billig, hurtig alternativ, der tillader direkte visualisering af tumor udvikling og er velegnet til in vivo imaging. Som sådan forsøgte vi at udvikle en optimeret protokol til ompodning gynækologiske og urologiske tumorer i denne model, som vi præsenterer her. Ca. 7 dage efterbefrugtning, luftcellen flyttes til den vaskulære side af ægget, hvor en åbning er skabt i skallen. Tumorer fra murine og menneskelige cellelinjer og primære væv kan derefter indpodet. Disse er typisk seedet i en blanding af ekstracellulære matrix og medium for at undgå cellulære spredning og give næringsstof støtte, indtil cellerne rekruttere en vaskulær forsyning. Tumorer kan derefter vokse i op til yderligere 14 dage før æggene ruge. Ved at implantere celler stabilt transduceret med firefly luciferase, bioluminescens imaging kan bruges til følsom påvisning af tumorvækst på membranen og kræftcelle spredes i hele fosteret. Denne model kan potentielt bruges til at studere tumorigenicity, invasion, metastase, og terapeutisk effektivitet. Kylling CAM model kræver betydeligt mindre tid og finansielle ressourcer i forhold til traditionelle murine modeller. Da æggene er immunkompromitterede og immuntolerante, kan væv fra enhver organisme potentielt implanteres uden dyre transgene dyr (f.eks. mus), der kræves til implantation af humane væv. Men, mange af fordelene ved denne model kunne potentielt også være begrænsninger, herunder den korte tumor generation tid og immunkompromitteret / immuntolerant status. Derudover, selv om alle tumor typer præsenteres her engraft i kylling chorioallantoic membran model, de gør det med varierende grader af tumor vækst.
Introduction
Mus har tjent som den klassiske model organisme for studiet af sygdomme hos mennesker, herunder malignitet. Som pattedyr deler de mange ligheder med mennesker. Deres høje grad af genetisk lighed har gjort det muligt for transgen manipulation af musegenomet at give enorm indsigt i den genetiske kontrol af sygdommehos mennesker 1. Omfattende erfaring i håndtering af og eksperimenter med mus har resulteret i, at de er den foretrukne model for biomedicinsk forskning. Men ud over de etiske og videnskabelige bekymringer vedrørende murine modeller, kan de også være ganske dyrt og tidskrævende2,3. Udviklingen af tumorer kan tage uger eller endda måneder. Boligerne på en typisk institution alene kan køre i hundreder til tusindvis af dollars, mens tumorer er ved at udvikle. Kræft i æggestokkene er et eksempel på denne ulempe, fordi dens vækst i murine modeller let kan tage måneder. Forsinkelser i forskningsfremskridt påvirker potentielt kræftpatienter i æggestokkenes vedvarende lave 5-årige overlevelsesrate på kun 47 % (dvs. en stigning i overlevelsen på kun 10 % over 30 år)4. Tilsvarende, urologiske kræftformer (nyre-, prostata- og blærekræft) udgør 19% af alle kræfttilfælde i USA og 11% af kræftrelaterede dødsfald4. Således kan en ny in vivo tilgang til at studere gynækologiske og urologiske kræftformer spare et laboratorium lang tid, arbejdskraft og penge, selv om denne model kun anvendes til indledende screening eksperimenter. Derudover, den resulterende acceleration af forskningsresultater kan påvirke de 177.000 personer diagnosticeret med disse kræftformer årligt.
Kylling CAM model tilbyder mange fordele, der løser de førnævnte spørgsmål. En populær model til at studere angiogenese5,6,tumorcelle invasion7,8,og metastase7,9, chick embryo CAM model er allerede blevet brugt til at studere mange former for kræft, herunder gliom10,11,12, hoved og hals planocellulært karcinom13,14, leukæmi15,16, kræft i bugspytkirtlen17, og kolorektal cancer18. Derudover, CAM modeller er blevet genereret for neuroblastoma19, Burkitt lymfom20, melanom21,og feline fibrosarkom22. Tidligere undersøgelser har også præsenteret engraftment af blærekræft23 og prostatakræft cellelinjer24, men med begrænset protokol detaljer. Ikke alene er æg meget billigere end mus, men de producerer også meget reproducerbare resultater25,26. De viser hurtig vaskulatur udvikling, og tumor engraftment kan forekomme i så hurtigt som et par dage og visualiseres langsgående gennem det åbne vindue. Med 21 dages tidsramme mellem ægbefrugtning og udklækning, kan eksperimenter være afsluttet inden for et par uger. Desuden tillader de lave omkostninger, begrænsede boligbehov og små størrelselet eksperimenter, der ville være uoverkommelige for musestudier.
Derfor forsøgte vi at optimere CAM-modellen til engraftment af gynækologiske og urologiske kræftformer. På grund af den immunkompromitterede status af den tidlige kylling embryo27, både mus og menneskelige celler kan implanteres let. Som sådan har vi med succes podet æggestokkene, nyre, prostata, og blærekræft. For hver af disse tumortyper accepterer CAM let etablerede murine og/eller humane tumorcellelinjer. Vigtigere, friskhøstet primære menneskelige tumorvæv kan også engraft fra enten fordøjet celler eller stykker af fast væv med høje succesrater. Hver af disse kræfttyper og cellekilder kræver optimering, som vi deler her.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle de eksperimenter, der præsenteres heri, blev gennemgået og godkendt af de relevante etiske udvalg ved University of California, Los Angeles (UCLA). Brugen af identificerede, primære menneskelige tumorer er blevet godkendt af UCLA Institutional Review Board (Protokol numre 17-000037, 17-001169, og 11-001363). På UCLA er animal research committee gennemgang ikke påkrævet for forsøg med kylling embryoner; protokolgodkendelse er kun påkrævet, når æggene udklækkes. Men bedste praksis, såsom AVMA's retningslinjer for dyrenes dødshjælp, blev anvendt til at håndtere kyllingeembryoner etisk og til at undgå smerte så meget som muligt. Forskere opfordres til at kontrollere kravene til tilsyn på deres institution, før de påbegynder undersøgelser ved hjælp af CAM-modeller.
1. Forberedelse af æggene
- Før æggene modtages, samles og ligevægtes ægkuvøsoren til 37,8 °C (100 °F) med 60-70 % fugtighed efter fabrikantens anvisninger.
BEMÆRK: For at minimere forureningsrisikoen kan der anvendes autoclaved vand til at styre luftfugtigheden. - Efter at have modtaget befrugtede, Rhode Island Red kylling æg fra en certificeret laboratorium-grade æg leverandør, tør tørre overfladen af skallerne med papirhåndklæder. En let dæmpet køkkenrulle kan bruges til at fjerne klæbende materiale. Tør straks.
BEMÆRK: Befugtning af skallen med væske under 43,3 °C kan indføre bakterier i ægget. Hvis man vælger at vaske eller desinficere æggene, skal væskens temperatur være mellem 43,3-48,9 °C. Højere temperaturer kan koge æggene. Valget af desinfektionsmiddel bør ske på grundlag af de mikroorganismer, der giver anledning til bekymring. - Brug en blyant eller markør til at mærke datoen på ægget. Dette betragtes som udviklingsdag 0.
- Læg æggene i ægkuvøse og inkuber i mindst 7 dage med rotation for at muliggøre CAM udvikling. Der kan anvendes en automatisk rotator, eller æggene kan roteres 180° 2-3x om dagen.
2. Åbning af æggene
BEMÆRK: Åbning af æggene skal ske, når CAM'en er fuldt udviklet. Dette er typisk på udviklingsdag 7 eller 8.
- Desinficere et biosikkerhedsskab med 70% ethanol. Tilsvarende desinficere og placere i biosafety kabinet et æg rack, æg candler, markør, trådløs e-værktøj med en silicium carbid slibesten og cirkulære skærehjul, 18 G nål, pipet controller med kvart-tommer vakuumslanger, pakning tape, kontor saks, buet saks, Semken (eller lignende) pincet, vatkugler og 6 x 7 cm gennemsigtig filmdressing. Når det er muligt, skal du bruge sterile, engangs- eller autoclaved værktøjer.
- Sluk for ægrotatoren. Læg ca. 1-3 æg i biosikkerhedsskabet på æggestativet. Mens du er i mørke, skal ægget lyses mod æggeskallen for at identificere luftcellen. Marker luftcellens placering.
BEMÆRK: Intensiteten af belysning fra ægget lyseser er afgørende for at visualisere det indre af ægget. Hvis luftcellen eller vaskulaturen er konsekvent vanskelig at se, kan du prøve at udskifte æggecandler-batterierne. - Flyt ægget candler over skallen for at finde et stort blodkar netværk. Drej ægget om nødvendigt. En ideel vaskulatur vil være forgrening nær midten af ægget. Brug en markør til at tegne over den vaskulatur, der skal bruges til implantation.
- Tænd lyset i hætten. Brug et trådløst roterende værktøj udstyret med en siliciumcarbid slibesten, bor et lille hul i skallen direkte over midten af luftcellen. Bor, indtil det meste af skallen er fjernet, men den hvide, indre membran er intakt.
BEMÆRK: Boring over luftcellen, før du målretter mod vaskulaturen tillader bestemmelse af tykkelsen af den pågældende æggeskal over luftcellen i stedet for over CAM og vaskulatur. Hvis CAM eller vaskulatur er afbrudt, så ægget er ikke brugbart til implantation. - Bor og åbn et andet lille hul, hvor det vaskulære vindue vil blive åbnet som det skete for luftcellen (trin 2.4).
- Brug en 18 G nål, forsigtigt gennembore gennem den hvide, indre membran over luftcellen og vaskulatur. Hvis det ikke er i stand til at trænge ind i skallen, så omhyggeligt bore lidt mere. Sørg for, at den hvide, indre membran (men ikke CAM) forstyrres i hele det borede område. Det er ikke nødvendigt at fjerne membranstykket.
BEMÆRK: Hvis CAM eller vaskulature afbrydes under dette trin, skal ægget kasseres. Skader er indlysende, hvis der er blod eller albumin lækker fra et boret hul. - Sluk for hættelyset. Ved hjælp af æggelyset skal du kontrollere, at luftcellen blev overført fra enden af ægget til området over vaskulaturen. Om nødvendigt skal vakuumslangen anbringes i en pipetregulator omkring hullet over den oprindelige luftcelle, og der skal forsigtigt suges i korte byger for at flytte luftcellen.
- Brug en markør til at skitsere den nye placering af luftcellen ca. 0,5 cm inden for luft-CAM-grænsen. Sæt et stykke emballage tape lige over den nye luftcelle. Brug om nødvendigt standardkontorsaks til at trimme båndet til en passende størrelse.
BEMÆRK: Tape kan forstyrre luftstrømmen gennem skallen og bør ikke være større end nødvendigt for fuldt ud at dække luftcellen. - Returnere æggene til kuvøse til at varme uden rotation med den nye luftcelle opad. Gentag trin 2.2-2.9 for de resterende æg, der skal åbnes.
BEMÆRK: Protokollen kan være sat på pause her. Hvis du er usikker på kvaliteten af CAM udvikling, et lille antal æg bør gå gennem trin 2,16 før åbningen af de resterende æg. - Placer ca. 1-3 æg med flyttede luftceller på ægholderen i biosikkerhedsskabet.
BEMÆRK: Der bør udvises forsigtighed for at undgå at indføre kontaminering i det åbne æg. Derfor altid åbne æg inde i en biosikkerhed kabinet, og bruge sterile værktøjer og udstyr, når det er muligt. - Brug et trådløst roterende værktøj udstyret med et cirkulært skærehjul, skæreen lille linje over luftcellegrænsen trukket i trin 2.8. Sørg for, at dette er ca. 0,5 cm inde i den faktiske luft-CAM grænse for at undgå at forstyrre CAM eller vaskulatur. Skær helt gennem skallen, men pas på ikke at trænge dybt nok til at forstyrre CAM eller vaskulatur.
- Brug buet saks, skåret rundt om den resterende luftcelle for at skabe et vindue i skallen.
BEMÆRK: Hvis der er blod eller membran på den fjernede skal, er ægget ikke egnet til implantation. Hvis en stor del af æggene ikke åbnes rent, kan du overveje at vente mindst 1 ekstra dag på at åbne de resterende æg for at tillade bedre CAM-dannelse. Hvis skallerne af de resterende æg ikke er blevet gennemboret, bør rotationen af æggene i rugemaskinen genoptages. - Kontroller embryonets levedygtighed. Levedygtige embryoner vil vise omfattende vaskulatur, klar albumin, embryo bevægelse, eller en synlig hjerteslag.
- Brug Semken pincet, trække små stykker bomuld fra en steril vat. Forsigtigt blot CAM overflade for at fjerne skallen støv og snavs.
BEMÆRK: Fjernelse af snavs skal udføres samme dag, som æggene åbnes. - Dæk skallen åbning med en fjerdedel stykke 6 x 7 cm gennemsigtig film dressing.
- Returnere æggene til kuvøse. Sørg for, at ægget sidder sikkert med det åbne vindue opad, og CAM ikke rører den gennemsigtige film dressing. Brug et stykke æg rack, kanten af ægget rotator, eller en anden egnet element til at støtte eventuelle æg, der holder rullende.
- Gentag trin 2.10-2.16 for alle resterende æg, der skal åbnes.
BEMÆRK: Åbningen af æggene behøver ikke at være afsluttet samme dag som implantation. Venter mindst 1 dag kan hjælpe med at fjerne æg, hvis levedygtighed blev kompromitteret ved at åbne skallen.
3. Forberedelse af kræftcellesuspension til transplantation (mulighed 1)
BEMÆRK: Dette skal udfyldes lige før implantationen, som ideelt set skulle finde sted mellem dag 7 og 10. Se noter i begyndelsen af trin 5 eller 6 for yderligere oplysninger om implantationsdatoen. Denne fremgangsmåde blev brugt til alle de cellelinjer og kulturfremstillede nyrekræft tumor fordøjer.
- Tø den ekstracellulære matrixopløsning på isen.
- Ved hjælp af mekanisk og/eller enzymatisk fordøjelse opnås en enkelt celleaffjedring ved hjælp af en metode, der passer til den celletype, der implanteres.
- Opslæm det samlede antal celler, der skal implanteres i et passende medium til implantation. Implantater af 1-2 x 106 celler pr æg er typiske.
BEMÆRK: Det medium, der anvendes til implantation af cellelinjerne, er typisk det komplette medium, der anvendes til dyrkning af cellerne, indeholdende FBS eller serumudskiftning. Implantation af tumor fordøjer typisk bruger det komplette medium, der anvendes til dyrkning af cellelinjer af samme kræfttype. Justeringer af den mellemste formulering kan dog foretages, hvis det er nødvendigt på forsøgsvis. Virkningerne på tumorudvikling og vækst skal empirisk bestemmes. - Pellet cellerne ved hjælp af en centrifuge hastighed og tid, der passer til de celler, der anvendes. Typiske hastigheder er 250-300 x g,og tiderne er 5-10 min.
- Fjern supernatantet fra de pelleterede celler ved at pipettere. Mekanisk resuspendering af cellerne i restmediet via knipse- eller pipettering. Placer på is for at køle af. Mål mængden af celler og medium ved hjælp af en passende størrelse pipet.
- Beregn implantationsmængder, således at 1-2 x 106 celler implanteres i et volumen på 20-100 μL pr. æg med en endelig ekstracellulær matrixkoncentration på 2,7-4 mg/ml protein. Tilføj medium, eventuelle ønskede vækstfaktorer eller tilsætningsstoffer, og ekstracellulære matrix løsning i henhold til denne beregning. Hold på is, indtil klar til implantat.
BEMÆRK: Ved beregningerne i trin 3.3 og 3.6 bør der indføjes en ekstra volumen på mindst et halvt ægimplantat for at sikre en tilstrækkelig mængde for alle æg i gruppen. Til implantation af cellelinjer i æggestokkene (dvs. SKOV3 og ID8) blev 106 celler pr. æg implanteret. Til implantation af nyrecellekarcinomcellelin renca, dyrkede celler stammer fra fordøjede primære humane nyrecellekarcinom, prostatakræft cellelinjer (dvs., CWR, C4-2, og MyC-CaP), og blærekræft cellelinjer (dvs. HT-1376 og T24), 2 x 106 celler blev implanteret.
4. Forberedelse tumor stykker til implantation (mulighed 2)
BEMÆRK: Dette skal udfyldes lige før implantation, som ideelt set bør finde sted mellem dag 7 og 10. Se noter i begyndelsen af trin 5 eller 6 for yderligere oplysninger om implantationsdatoen. Primær kræft i æggestokkene og blærekræft blev implanteret som tumor stykker.
- Tø ekstracellulære matrix opløsning på is. Fortyndes til en endelig proteinkoncentration på 2,7-4 mg/ml i et passende medium, der indeholder de ønskede vækstfaktorer eller tilsætningsstoffer. Bliv ved med isen.
BEMÆRK: Implantation af tumorstykker bruger typisk det komplette medium, der anvendes til dyrkning af cellelinjer af samme kræfttype. Justeringer af den mellemste formulering kan dog foretages, hvis det er nødvendigt på forsøgsvis. Virkningerne på tumorengraftment og vækst skulle empirisk bestemmes. - Ved hjælp af en skalpel eller saks, punktafgifter stykker fra den friske tumor. Ideelle størrelser spænder fra 2-5 mm på hver side. Hold væv nedsænket i mediet, indtil det er færdigt.
5. Implantation ved hjælp af en nonstick ring (mulighed 1)
BEMÆRK: Celler kan implanteres fra og med udviklingsdag 7, hvis CAM'et er fuldt udviklet. Implantation kan forekomme når som helst før udklækning, der tillader tilstrækkelig tid til tumorudvikling og det ønskede eksperiment, men bemærk, at embryoets immunceller begynder at være til stede omkring dag 10 efterbefrugtning27. Tumor vækstrate varierer betydeligt efter celletype og skal empirisk bestemmes for celletype af interesse. Kræft i æggestokkene og prostatakræft celler blev implanteret ved hjælp af nonstick ring metode. Bemærk, at når en nonstick ring ikke er tilgængelig, kan en pipet tip skæres til en lignende størrelse og anvendes.
- Brug 70% ethanol til at desinficere et biosikkerhedsskab og alle de nødvendige værktøjer: en æggeholdere, buede irispincet, nonstickringe (1/4 tommer inderdiameter), glasrørestang, passende volumenpipetter og spidser, 6 x 7 cm gennemsigtig filmdressing, kontorsaks og markør eller blyant. Når det er muligt, skal der anvendes sterile, engangs- eller autoclavedværktøjer.
- Placer æg, der skal implanteres på et æg rack i en biosikkerhed kabinet. Vælg et overskueligt antal æg. Op til seks er typisk. Undgå at lade æggene køle væsentligt, mens du arbejder med dem.
- Fjern gennemsigtig filmdressing fra skallen ved at rulle kanterne mod det åbne vindue for at undgå at trække stykker af skal. Kontroller, at æggene er levedygtige og sunde. Ideelle æg vil have et stort fartøj i midten af det åbnede område med mindre fartøjer forgrening fra det.
- Brug buede iris pincet, placere en steril, nonstick ring på CAM over fartøjet, ideelt over en gren punkt. Brug en steril glasrørestang til forsigtigt at abrade CAM.
- Pipet cellen suspension fra trin 3,6 i midten af nonstick ringen. Alternativt skal du bruge pincet til at placere en tumor stykke fra trin 4.2 i midten af nonstick ring og dække med 20-50 μL af den ekstracellulære matrix løsning genereret i trin 4.1.
- Seal åbningen med en fjerdedel stykke 6 x 7 cm gennemsigtig film dressing. Mærk æggene med en passende implantatbetegnelse.
BEMÆRK: Nummerering af æggene i en gruppe letter observationer i længderetningen. - Sæt ægget tilbage til kuvøsen. Sørg for, at åbningen af skallen sidder oprejst, og at ægget er sikkert.
BEMÆRK: Æg kan returneres til en ægkuvøse uden rotation. Alternativt kan høj postimplantat levedygtighed opnås ved hjælp af en 37-38 °C celle inkubator med CO2 deaktiveret og en hygrometer til at overvåge luftfugtigheden, som bør være 50% -80%.
6. Implantation uden en nonstick ring (mulighed 2)
BEMÆRK: Celler kan implanteres fra og med udviklingsdag 7, hvis CAM'et er fuldt udviklet. Implantation kan forekomme når som helst før udklækning, der tillader tilstrækkelig tid til tumorudvikling og det ønskede eksperiment, men bemærk, at embryoets immunceller begynder at være til stede omkring dag 10 efterbefrugtning27. Denne metode blev brugt til implantering af nyrecellekarcinomceller og blærekræftcellerne.
- Brug 70% ethanol til at desinficere et biosikkerhedsskab og alle nødvendige værktøjer: passende volumenpipetter og spidser, sterile 10 cm vævskulturretter, ægrack, 6 x 7 cm gennemsigtig filmdressing, kontorsaks og markør.
- Aspirere en inoulationsvolumen af celleaffjedringen genereret i trin 3.6 i en passende størrelse pipet spids (200 μL er typisk). Mens du holder den øverste del af spidsen, forsigtigt skubbe pipet spidsen og sted vandret i en steril, 10-cm væv kultur parabol.
- Gentag trin 6.2 for alle prøver i en gruppe med en skål for hver gruppe.
- Placer spidser i en 37 °C inkubator i 15-30 min at tillade den ekstracellulære matrix til delvist polymerize.
- Efter 15 min inkubation, begynde at kontrollere for polymerisering. En lille mængde væske lækker typisk ud af spidsen, når den placeres på skålen. Polymerisering af denne væske kan bruges til at vurdere omfanget af polymerisering af væsken i spidsen.
- Læg de æg, der skal implanteres på et ægrack, i et biosikkerhedsskab. Vælg et overskueligt antal æg. Op til seks er typisk. Undgå at lade æggene køle væsentligt, mens du arbejder med dem.
- Fjern den gennemsigtige filmdressing fra skallen ved at rulle kanterne mod det åbne vindue. Dette undgår at trække væk stykker af shell.
- Kontroller, at æggene er levedygtige og sunde. Ideelle æg vil have et stort fartøj i midten af det åbnede område med mindre fartøjer forgrening fra det.
- Placer en pipet spids på en passende størrelse pipet. Tryk stemplet for at tvinge den delvist polymeriserede celleaffjedring på CAM over et stort, veludviklet fartøj, ideelt over et grenpunkt.
- Seal åbningen med en fjerdedel stykke 6 x 7 cm gennemsigtig film dressing.
- Mærk ægget med en passende implantatbetegnelse.
BEMÆRK: Nummerering af æggene i en gruppe letter observationer i længderetningen. - Sæt ægget tilbage til kuvøsen. Sørg for, at åbningen af skallen sidder oprejst, og at ægget er sikkert.
BEMÆRK: Æg kan returneres til en dedikeret æg kuvøse uden rotation. Alternativt kan høj postimplantat levedygtighed opnås ved hjælp af en 37-38 °C celle inkubator med CO2 deaktiveret og en hygrometer til at overvåge luftfugtigheden, som bør være 50% -80%.
7. Bioluminescens billeddannelse af firefly luciferase markerede tumorer
BEMÆRK: Hvis de implanterede celler blev stabilt transduceret med genet kodning firefly luciferase eller andre billeddannelse faktorer, så de resulterende tumorer kan visualiseres ved hjælp af bioluminescens billeddannelse. Fluorescensbilleddannelse anbefales ikke på intakte æg på grund af høj baggrund fra æggeskallen. Dette er endepunktanalyse, da åbningen af skallen drastisk reducerer overlevelsen. Tumorer kan afbildes til enhver tid, der er egnet til eksperimentelle behov og hastigheden af tumor vækst. Men i gennemsnit, æg klækkes 21 dage efterbefrugtning. Derfor, udvikling dag 18 er et passende endepunkt for at undgå uønsket udklækning.
- Om nødvendigt transportere sæg til billedbehandlingsanlægget. Tape æg på 10-cm væv kultur retter. Sæt dem tilbage til en ægkuvøse med 37,8 °C (100 °F) med rotationsmekanismen fjernet eller deaktiveret. Fugtighed er ikke afgørende for transport og billeddannelse.
- Brug buede irispincet, skub forsigtigt CAM'en væk fra skallen, indtil CAM'en flugter med albumin og embryo. Ved hjælp af bredspidset prøve pincet, bryde væk stykker af skallen til at udvide skallen åbning tilstrækkeligt til tumor visualisering.
- Der injiceres mindst 50 μL 30 mg/ml D-luciferin i æggealbummet. Et lignende volumen af D-luciferin kan også pipetteres i nonstickringen eller på cam-overfladen i det område, der indeholder de implanterede celler. Dette sikrer optimal bioluminescens i mangel af en ideel vaskulær forsyning. Inkuberi i 8 min.
- Tilføres 20-50 μL isofluran i albumin af ægget for at bedøve ægget. Inkubere i yderligere 2 min. Alternativt kan ægget placeres i et induktionskammer, der indeholder 2-2,5% fordampet isofluran. Der opnås tilstrækkelig anæstesidybde, når embryonale bevægelser ophører.
BEMÆRK: Større volumener af isofluran (100 μL) kan bruges til at aflive ægget. - Læg æg i en bioluminescensbilledenhed og et billede ved hjælp af passende indstillinger som bestemmes af producentens anvisninger. Til denne undersøgelse blev der anvendt en eksponeringstid på 1 min.
- For at afbilledet den resterende CAM og embryo, åbne ægget i en 10-cm væv kultur parabol.
- Tag fat i ægget med fingrene på begge hænder på undersiden af ægget nær midten af ægget og tommelfingrene på hver side af skallen åbning.
- Træk forsigtigt æggets to halvdele fra hinanden med tommelfingrene, mens de forsigtigt trykkeind i ægget med fingrene.
- Når skallen er ca. halvt adskilt fra CAM og embryo, skal ægget vendes på hovedet over en 10 cm vævskulturskål.
- Fortsæt med at adskille skalhalvdele. Hvis CAM klæber til indersiden af skallen, skal du forsigtigt bruge fingrene til at skubbe CAM væk fra skallen.
- Embryoet kan vendes i en anden skål, hvis det ønskes.
- Om nødvendigt kan yderligere isofluran administreres som i trin 7.4.
8. Tumor høst
BEMÆRK: Tumorer kan høstes til enhver tid, der er passende for de eksperimentelle behov og hastigheden af tumor vækst. Men i gennemsnit, æg klækkes 21 dage efterbefrugtning. Derfor, udvikling dag 18 er et passende endepunkt for at undgå uønsket udklækning.
- Forstå tumor med pincet. Ved hjælp af saks (foråret iris saks fungerer godt) eller en skalpel, omhyggeligt punktafgifter tumor fra CAM.
- Hvis tumoren er blevet transduceret med firefly luciferase genet, reimaging kan udføres for at kontrollere en vellykket fjernelse af vanskelige at visualisere tumorer.
BEMÆRK: Punktafgifter tumorer kan analyseres ved enhver metode, der passer til et bestemt eksperiment. Tumorer kan også reimplanteres i CAM eller mus. For at bekræfte tumor identitet, tumorer kan fastsættes, paraffin indlejret, og undersøgt med hæmatoxylin og eosin eller immunhistokemisk farvning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hidtil har vi fundet denne metode til implantation at være en succes for æggestokkene, nyre, prostata, og blærekræft. Hver blev optimeret til at identificere specifikke betingelser for implantation, selv om der kan være fleksibilitet. Af de testede tumortyper var væksten i æggestokkene langt mindre udtalt og typisk ikke synlig uden hjælp fra bioluminescensbilleddannelse (figur 1). Men en afstivning af CAM kunne mærkes med pincet i området for implantation. Dette kan hjælpe med at identificere mulige tumor vækst i mangel af bioluminescens imaging, selv om yderligere validering ville være påkrævet via histologi eller en anden egnet metode. Vi opnåede en vellykket engraftment af både humane og murine celle linjer, der viser morfoologier i overensstemmelse med dem, der ses i andre in vivo modeller(Figur 1A og 1B). Desuden var implantation af tumorstykker mulig(figur 1C, blå pil indikerer tumor). Den implanterede tumor i dette tilfælde kom fra en patient med høj kvalitet, metastatisk, ovarie-serøs karcinom. Den resulterende tumorer morfologisk lignede deres tumorer af oprindelse og udtrykt menneske-specifikke proteiner, såsom cytokeratin 8/18, der let tillader deres differentiering fra CAM og kylling embryonale væv.
Når optimering tumor engraftment og vækst, passende vækstfaktorer eller hormoner kan tilføjes på tidspunktet for implantation. For eksempel, en subtil, ubetydelig stigning i tumorstørrelse (målt ved total udstråling flux) blev observeret i ID8 celler, når suppleret med tre enheder (U) af humant follikel stimulerende hormon (FSH) på tidspunktet for implantation (Figur 1D). Udvælgelsen af FSH for kræft i æggestokkene vækst stammede fra udtryk for FSH receptor i ID8 celler og de høje niveauer af FSH typisk findes i postmenopausale kvinder, der udgør størstedelen af kræft i æggestokkene tilfælde. Lignende tilgange kan anvendes til andre vanskelige at dyrke kræfttyper for at forbedre nytten af CAM-modellen. Desuden blev FSH først tilføjet på tidspunktet for celleimplantation. Genopfyldning af vækstfaktor eller hormon kunne opnås ved pipettering en passende mængde af tilsætningsstoffet i mediet i nonstick ringen med passende intervaller, hvilket kunne øge effekten.
For nyrekræft, implantation af 2 x 106 klar celle renal celle karcinom celler fra etablerede cellelinjer, såsom RENCA, produceret hurtig, robust tumordannelse, selvom lavere celledoser kan også anvendes(Figur 2A, 10 dage efterimplantation). Resulterende tumorer morfologisk lignede dem, der opnås gennem standard mus in vivo modeller28. Implantation af RENCA-celler markeret med fireflueluciferase tilladt bioluminescensbilleddannelse. Primære menneskelige tumorer kan også implanteres. Stykkerne af tumor fortsatte og rekrutteret vaskulatur uden at vise betydelig vækst. Implantation af fordøjede celler fra en primær, klar celle renal celle karcinom, der blev udvidet in vitro, dog voksede på samme måde som de etablerede cellelinjer(Figur 2B). Renal celle karcinom celler kan ses ved hjælp af enten nonstick ring metode eller metoden uden nonstick ring.
Flere humane og murine prostatakræft celle linjer blev testet for CAM engraftment (Figur 3). Hver voksede godt, når 2 x 106 celler blev implanteret ved hjælp af nonstick ringen. Histologisk evaluering af de resulterende tumorer var i overensstemmelse med forventningerne til hver cellelinje. Derudover, implantation af celler stabilt markeret med firefly luciferase tilladt tumor identifikation med bioluminescens imaging (Figur 3A).
Blærekræft blev etableret i CAM-modellen fra etablerede cellelinjer og stykker af primært humant væv (Figur 4). Cellelinjer voksede godt, når implanteret med 2 x 106 celler uden nonstick ring(Figur 4A og 4B),selv om implantation med ringen var vellykket. Primær menneskelig tumor kan implanteres fra stykker af væv (Figur 4C). Det fremlagte tilfælde stammede fra en patient med høj kvalitet, ikke-muskel-invasiv, urotelkarcinom. Implantation af fordøjede celler er endnu ikke blevet forsøgt på grund af igangværende tumor fordøjelse optimering. Kræftceller af de resulterende CAM tumorer beholdt morfologi af den oprindelige tumor, men med en ændret stromale komponent. Tumor vækst var mindre end for nyrecellekarcinom og prostatakræft, men stadig let synlige.
For at sikre et stort antal levedygtige, analysebare æg ved slutpunktet skal der udvises forsigtighed ved indkubering og åbning af æggene. Hvis inkubatorbetingelserne er suboptimale enten før eller efter implantationen, kan embryons levedygtighed blive kompromitteret. Hvis der opstår betydelig embryonal død, foretages der fejlfinding af inkubatorbetingelserne i henhold til producentens anvisninger. Det er vores erfaring, at temperatur og fugtighed stabilitet synes at være mere afgørende end deres nøjagtige værdier. Derfor fandt vi, at inkubering af de podede æg i en modificeret cellekultur opnåede CO 2-inkubator en overlegen levedygtighed frem for at bevare æggene i små, dedikerede ægkuvøser, der kræver hyppigere åbning for at genopbygge det vand, der styrer luftfugtigheden. Minimering af den hyppighed, hvormed de inokulerede æg fjernes til tumorundersøgelse, kan også øge embryons levedygtighed.
En yderligere bekymring for CAM implantation er integriteten af CAM ved podning. Hvis CAM ikke er intakt efter åbning af skallen, vil nonstick ringen og implanterede celler synke ned i embryoets albumin (se noten efter trin 2.12). Dette forårsager kræft celle spredning. Nogle tumorer kan stadig danne, men kræft, der modtager betydelig vækst og overlevelse signalering fra tilstødende kræftceller, såsom kræft i æggestokkene, vil ikke pålideligt danne tumorer under sådanne betingelser. Hvis nonstick ringe anvendes til implantation, kan cam'ens svigt identificeres ved ringens forlis i albuminet. Dette skal adskilles fra tilfælde, hvor ringen og de implanterede celler blev flyttet til bunden af ægget ved embryonal bevægelse. I disse tilfælde vil ringen blive fundet mellem CAM og undersiden af skallen. Embryonale bevægelser kan ikke kontrolleres. Men, ring placering kan gøre det vanskeligere for fosteret at forstyrre de implanterede celler. Ringe placeret i kanterne af luftlommen genereret i trin 2,7 er mere tilbøjelige til at blive flyttet af fosteret end dem, der placeres i midten af feltet.
Figur 1: Repræsentativ tumorudvikling fra kræft i æggestokkene. Kræft i æggestokkene med succes implanteret omfatter: (A) den menneskelige SKOV3 cellelinje, (B) murine ID8 cellelinje, og (C)primære tumorer. Repræsentativ hæmatoxylin og eosin farvning præsenteres sammen med bioluminescens billeddannelse, hvor det er relevant. For CAM tumor som følge af implantation af en primær tumor stykke (C)hematoxylin og eosin farvning af både CAM tumor og primær tumor er inkluderet, sammen med cytokeratin 8/18 (CK 8/18) farvning af den resulterende CAM tumor. Den blå pil i det første panel angiver tumoren. (D) Tumorstørrelse af ID8-implantater med og uden 3U FSH beregnet som den samlede flux som følge af bioluminescensbilleddannelse (n = 3 for ubehandlet og n = 4 for FSH-suppleret). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Repræsentativ tumorudvikling fra klar cellerenalcellekarcinom. Tumorer som følge af implantation af (A)murine renal celle karcinom cellelinje, RENCA, eller (B) dyrkede celler stammer fra en fordøjet menneskelige primære tumor. Måleskalaen ved siden af den fjernede tumor i (B) viser 1 mm markeringer. Tilsvarende histologi i (A) og (B) viser hæmatoxylin og eosin farvning. I (A)vises også den repræsentative bioluminescensafbrændingaf firefly-luciferase-mærkede RENCA-celler. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Repræsentativ tumorudvikling fra cellelinjer for prostatakræft. Repræsentative tumorer og hæmatoxylin og eosin farvning som følge af implantation af den menneskelige prostatakræft cellelinjer(A)CWR og (B) C4-2 sammen med murine cellelinje(C)MyC-CaP. Bioluminescens billeddannelse af de resulterende tumorer fra firefly luciferase mærket CWR celler er vist i (A). Måleskalaen ved siden af de punktafgifterede tumorer viser 1 mm markeringer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Repræsentativ tumorudvikling fra blærekræft. Repræsentative tumorer som følge af implantation af de etablerede humane blærekræft cellelinjer(A)HT-1376,(B)T24, og (C)primære menneskelige blære tumor. I (C),hæmatoxylin og eosin farvning af den resulterende CAM tumor og den primære tumor er vist. Måleskalaen ved siden af de punktafgifterede tumorer viser 1 mm markeringer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tumor ekspansion og engraftment ved hjælp af CAM model tillader hurtigere og direkte observerbare tumor vækst end eksisterende in vivo dyremodeller. Desuden er omkostningerne betydeligt lavere, når det oprindelige køb af udstyr er afsluttet, især sammenlignet med omkostningerne ved immunkompromitterede mus. Den oprindelige, immunkompromitterede tilstand af kylling embryoner let tillader engraftment af humane og murine væv. Selv med disse styrker har CAM-modellen begrænsninger. Den korte tid, der kan være en fordel, kan også være til skade, hvis langtidsbehandlingsundersøgelser er berettigede. Den immunkompromitterede/immuntolerante status af CAM-modellen kan komplicere undersøgelser af tumor-immune interaktioner. I forbindelse med disse undersøgelser kan det være nødvendigt at medimplantere immunceller af interesse, eventuelt med genopfyldning af immunrummet. Desuden, selv om alle de tumortyper, vi præsenterede engraft i CAM model, de gør det med varierende grader af vækst. For eksempel, renal celle karcinom hurtigt danner store tumorer, men kræft i æggestokkene tumorer er vanskelige at visualisere uden hjælp fra bioluminescens imaging. Tumor vækst og hastighed skulle vurderes for en bestemt tumor type for at afgøre, om CAM ville være en passende eksperimentel model.
Vellykket tumor engraftment kræver omhyggelig afslutning af specifikke trin i protokollen. For det første skal æg inkuberes under ideelle forhold for at have optimal embryonoverlevelse og CAM-dannelse før indskrivning. På grund af den naturlige variation i partier, foreslår vi at opnå overskydende æg fra den specifikke æg leverandør. Vi har også konstateret, at køligere, rainier vejr kan føre til svampevækst i æggene. Under vådere vejr, kan flere æg skal indpodet for at opnå passende udbytter ved slutpunktet. Denne sæsonmæssige variation vil sandsynligvis være regionsspecifik. Tilstrækkelig CAM dannelse er afgørende for en vellykket tumor engraftment. Eventuelle tegn på, at cam'en forbliver fastgjort til skallen, når åbningen ikke bør ignoreres. Hvis flere æg ikke har intakt CAM, når du åbner det første parti, anbefaler vi at forsinke åbningen af de resterende æg i mindst 1 ekstra dag.
Hvis der opnås dårlig levedygtighed eller engraftment, kan der være flere trin, der skyldes fejl. For det første kan leverandørens embryonlevedygtighed være dårlig. Fravær af en luftcelle og synlig vaskulatur indikerer et ikke-levedygtigt æg. Nogle gange kan embryobevægelse visualiseres for at bekræfte levedygtigheden. Først skal du dog sørge for, at friske batterier er i æggelyset, fordi der er brug for et stærkt lys til visualisering. Flydetesten kan også udføres for at vurdere levedygtigheden (en række instruktioner og videoer er tilgængelige online). En anden mulig forklaring på dårlig levedygtighed er kuvøse. Ved hjælp af et uafhængigt hygrometer og termometer skal du sikre dig, at indstillingerne er nøjagtige og stabile. Producentens anvisninger til kuvøse skal indeholde detaljerede fejlfindingsinstruktioner for at vurdere korrekte indstillinger. Forkert inkubator indstillinger kunne også kompromittere CAM udvikling. Ved hjælp af tape og/eller en markør skal du afgøre, om æggerotatoren rent faktisk drejer æggene rundt. Hvis nonstick ringe synker ned i albumin i en høj andel af de podede æg, så CAM ikke tilstrækkeligt udvikle. Endelig har vi konstateret, at hyppig kontrol af det indpode æg, der fører til temperatur- og fugtighedsudsving, kan falde efterimplantatets levedygtighed. Hvis implanterede æg i første omgang er levedygtige, men levedygtigheden falder i hele indskrivningsperioden, skal æggene kontrolleres mindre hyppigt. Dette fald i levedygtigheden kan også skyldes unøjagtige eller uhensigtsmæssige inkubatorindstillinger efter implantation.
Når du optimerer denne metode for en ny celletype, kan flere faktorer styres. Det første er cellenummer. Vi implanterer typisk 5 x 105-2 x 106 celler fra cellelinjer. Implanterede tumorstykker er typisk 2-5 mm på hver side. Disse beløb kan justeres for at forbedre indskrivningen eller størrelsen. Men, Vi har konstateret, at tumor vækst mindsker over en vis tærskel, som er celletype afhængige. Yderligere engraftment parametre omfatter tilstedeværelse n eller fravær af en nonstick ring. Dette valg er typisk foretaget baseret på, om ringen vil hindre slutpunktsanalysen, selv om det også kan påvirke vellykket engraftment. Tilstedeværelsen af nonstick ringen kan også tillade, at der dækker den spirende graft med medium med følgende intervaller for at forbedre overlevelsen forud for vaskulær rekruttering, hvis det ønskes. Valget af ekstracellulær matrixtype, koncentration og medium, hvor matrixen fortyndes, kan også påvirke indskrivningen. Tilføjelsen af vækstfaktorer eller hormoner kan yderligere forbedre tumor tage sats eller størrelse. Udvælgelsen af tilsætningsstoffer og koncentrationer skal ske på grundlag af, hvad der ville være passende for den specifikke celletype og ikke forstyrre forsøget. Disse ville også have potentiale til at blive genopfyldt med mellemrum, hvis en nonstick ring anvendes.
Fremtidige anvendelser af dette modelsystem afhænger af den hypotese, der skal testes. For eksempel, disse tumor grafts kunne bruges til at teste nye terapeutiske tilgange til at reducere tumor størrelse eller nedbryder en delpopulation af tumoren. Co-implantation med celler fra værten tumor mikromiljø kunne tillade undersøgelser af indflydelsen af disse celler på en række parametre, herunder tumor vækst og behandlingsmodstand. Denne model kunne også tjene som en mulighed for gradvist at udvide primære menneskelige tumorer forud for oprettelse af xenografts i immunkompromitterede dyremodeller. Den indledende tilpasning til CAM-engraftment kunne måske lette tumor tage sats i murine modeller. Disse programmer er endnu ikke afprøvet, men berettiger yderligere udforskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker at takke Dr. Fuyuhiko Tamanoi og Binh Vu for den indledende uddannelse på denne metode. Drøftelser med Dr. Eva Koziolek har været medvirkende til at optimere denne tilgang og har været meget værdsat. Dette arbejde ville ikke have været muligt uden finansiering fra følgende kilder: Tobaksrelaterede Sygdomme Research Program Postdoctoral Fellowship (27FT-0023, til ACS), Department of Defense (DoD) Ovariecancer Research Program (W81XWH-17-1-0160), NCI / NIH (1R21CA216770), Tobak-Relaterede Sygdomme Research Program High Impact Pilot Award (27IR-0016), og UCLA institutionel støtte, herunder et JCCC Seed Grant (NCI/NIH P30CA016042) og et 3R-tilskud fra vicekansler for forskning til LW.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| -010 Teflon (PTFE) White 55 Duro Shore D O-Rings | The O-Ring Store | TEF010 | Nonstick ring for cell seeding. 1/4"ID X 3/8"OD X 1/16"CS Polytetrafluoroethylene (PTFE). |
| C4-2 | ATCC | CRL-3314 | Human prostate cancer cell line. |
| CWR22Rv1 | CWR cells were the kind gift of Dr. David Agus (Keck Medicine of University of Southern California) | ||
| Cytokeratin 8/18 Antibody (C-51) | Novus Biologicals | NBP2-44929-0.02mg | Used at a dilution of 1:100 for immunohistochemical analysis of human ovarian CAM tumors. |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Goldbio | LUCK-1G | |
| Delicate Operating Scissors; Curved; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4-3/4 in. Overall Length | Roboz Surgical | RS6703 | This is provided as an example. Any similar curved scissors would work as well. |
| Dremel 8050-N/18 Micro 8V Max Tool Kit | Dremel | 8050-N/18 | This kit contains all necessary tools. |
| Fertilized chicken eggs (Rhode Island Red - Brown, Lab Grade) | AA Lab Eggs Inc. | N/A | A local egg supplier would need to be identified, as this supplier only delivers regionally. |
| HT-1376 | ATCC | CRL-1472 | Human bladder cancer cell line. |
| Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit | Incubator Warehouse | HB1588D-NONE-1102-1588-1357 | Other egg incubators may be used, but their reliability would need to be verified. After implantation, a cell incubator with the CO2 disabled may also be used. |
| ID8 | Not commercially available, please see PMID: 10753190. | ||
| Incu-Bright Cool Light Egg Candler | Incubator Warehouse | 1102 | Other candlers may be used; however, this is preferred among those that we have tested. This candler is included in the aforementioned incubator kit. |
| Iris Forceps, 10cm, Curved, Serrated, 0.8mm tips | World Precision Instrument | 15915 | This is provided as an example. Any similar curved forceps would work as well. Multiple brands have been used for this method. |
| Isoflurane | Clipper Distributing | 0010250 | |
| IVIS Lumina II In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | ||
| Matrigel Membrane Matrix HC; LDEV-Free | Corning | 354248 | Extracellular matrix solution |
| MyC-CaP | ATCC | CRL-3255 | Murine prostate cancer cell line. |
| Portable Pipet-Aid XP Pipette Controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | Any similar pipet controller would be appropriate. |
| PrecisionGlide Hypodermic Needles | BD | 305196 | This is provided as an example. Any 18G needle would work similarly. |
| RENCA | ATCC | CRL-2947 | |
| Semken Forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | This is provided as an example. Any similar forceps or another style that suits researcher preference would be appropriate. |
| SKOV3 | ATCC | HTB-77 | Human ovarian cancer cell line. |
| Specimen forceps | Electron Microscopy Sciences | 72914 | This is provided as an example. The forceps used for pulling away the shell for bioluminescence imaging are approximately 12.8 cm long with 3 mm-wide tips. |
| Sterile Cotton Balls | Fisherbrand | 22-456-885 | This is provided as an example. Any sterile cotton balls would suffice. |
| Stirring Rods with Rubber Policeman; 5mm diameter, 6 in. length | United Scientific Supplies | GRPL06 | This is provided as an example. Any similar glass stir rods would work as well. |
| T24 | ATCC | HTB-4 | Human bladder cancer cell line. |
| Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4" | Moore Medical | 21272 | |
| Tissue Culture Dishes, 10 cm diameter | Corning | 353803 | This is provided as an example. Any similar, sterile 10-cm dish may be used. Tissue culture treatment is not necessary. |
| Tygon Clear Laboratory Tubing - 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 feet) | Tygon | AACUN017 | This is provided as an example. Any similarly sized tubing would work as well. |
References
- Kersten, K., de Visser, K. E., van Miltenburg, M. H., Jonkers, J. Genetically engineered mouse models in oncology research and cancer medicine. EMBO Molecular Medicine. 9 (2), 137-153 (2017).
- Jackson, S. J., Thomas, G. J. Human tissue models in cancer research: looking beyond the mouse. Disease Models & Mechanisms. 10 (8), 939-942 (2017).
- Cheon, D. J., Orsulic, S. Mouse Models of Cancer. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 6 (1), 95-119 (2011).
- Howlader, N., et al. SEER Cancer Statistics Review, 1975-2016. , National Cancer Institute. Bethesda, MD. https://seer.cancer.gov/csr/1975_2016/ (2018).
- Ribatti, D. Chicken chorioallantoic membrane angiogenesis model. Methods Molecular Biology. 843, 47-57 (2012).
- Nowak-Sliwinska, P., Segura, T., Iruela-Arispe, M. L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
- Lokman, N. A., Elder, A. S., Ricciardelli, C., Oehler, M. K. Chick chorioallantoic membrane (CAM) assay as an in vivo model to study the effect of newly identified molecules on ovarian cancer invasion and metastasis. International Journal of Molecular Science. 13 (8), 9959-9970 (2012).
- Xiao, X., et al. Chick Chorioallantoic Membrane Assay: A 3D Animal Model for Study of Human Nasopharyngeal Carcinoma. PLoS ONE. 10 (6), e0130935 (2015).
- Deryugina, E. I., Quigley, J. P. Chick embryo chorioallantoic membrane model systems to study and visualize human tumor cell metastasis. Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1119-1130 (2008).
- Shoin, K., et al. Chick Embryo Assay as Chemosensitivity Test for Malignant Glioma. Japanese Journal of Cancer Research. 82 (10), 1165-1170 (1991).
- Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102 (5), 1643-1648 (2005).
- Kavaliauskaitė, D., et al. The Effect of Sodium Valproate on the Glioblastoma U87 Cell Line Tumor Development on the Chicken Embryo Chorioallantoic Membrane and on EZH2 and p53 Expression. BioMed Research International. 2017, 12 (2017).
- Liu, M., et al. The Histone Methyltransferase EZH2 Mediates Tumor Progression on the Chick Chorioallantoic Membrane Assay, a Novel Model of Head and Neck Squamous Cell Carcinoma. Translational Oncology. 6 (3), 273-281 (2013).
- Rudy, S. F., et al. In vivo Wnt pathway inhibition of human squamous cell carcinoma growth and metastasis in the chick chorioallantoic model. Journal of Otolaryngology - Head & Neck Surgery. 45 (1), 26 (2016).
- Canale, S., et al. Interleukin-27 inhibits pediatric B-acute lymphoblastic leukemia cell spreading in a preclinical model. Leukemia. 25, 1815 (2011).
- Loos, C., et al. Amino-functionalized nanoparticles as inhibitors of mTOR and inducers of cell cycle arrest in leukemia cells. Biomaterials. 35 (6), 1944-1953 (2014).
- Rovithi, M., et al. Development of bioluminescent chick chorioallantoic membrane (CAM) models for primary pancreatic cancer cells: a platform for drug testing. Scientific Reports. 7, 44686 (2017).
- Majerník, M., et al. Novel Insights into the Effect of Hyperforin and Photodynamic Therapy with Hypericin on Chosen Angiogenic Factors in Colorectal Micro-Tumors Created on Chorioallantoic Membrane. International Journal of Molecular Science. 20 (12), 3004 (2019).
- Swadi, R., et al. Optimising the chick chorioallantoic membrane xenograft model of neuroblastoma for drug delivery. BMC Cancer. 18 (1), 28 (2018).
- Klingenberg, M., Becker, J., Eberth, S., Kube, D., Wilting, J. The chick chorioallantoic membrane as an in vivo xenograft model for Burkitt lymphoma. BMC Cancer. 14 (1), 339 (2014).
- Avram, S., et al. Standardization of A375 human melanoma models on chicken embryo chorioallantoic membrane and Balb/c nude mice. Oncology Reports. 38 (1), 89-99 (2017).
- Zabielska-Koczywas, K., et al. 3D chick embryo chorioallantoic membrane model as an in vivo model to study morphological and histopathological features of feline fibrosarcomas. BMC Veterinary Research. 13 (1), 201 (2017).
- Skowron, M. A., et al. Applying the chicken embryo chorioallantoic membrane assay to study treatment approaches in urothelial carcinoma. Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations. 35 (9), e511-e523 (2017).
- Jefferies, B., et al. Non-invasive imaging of engineered human tumors in the living chicken embryo. Scientific Reports. 7 (1), 4991 (2017).
- Taizi, M., Deutsch, V. R., Leitner, A., Ohana, A., Goldstein, R. S. A novel and rapid in vivo system for testing therapeutics on human leukemias. Experimental Hematology. 34 (12), 1698-1708 (2006).
- Strojnik, T., Kavalar, R., Barone, T. A., Plunkett, R. J. Experimental model and immunohistochemical comparison of U87 human glioblastoma cell xenografts on the chicken chorioallantoic membrane and in rat brains. Anticancer Research. 30 (12), 4851-4860 (2010).
- Ribatti, D. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for tumor biology. Experimental Cell Research. 328 (2), 314-324 (2014).
- Hu, J., et al. A Non-integrating Lentiviral Approach Overcomes Cas9-Induced Immune Rejection to Establish an Immunocompetent Metastatic Renal Cancer Model. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 9, 203-210 (2018).
